OPCML对卵巢癌细胞抑制的体内外实验研究.docx

OPCML对卵巢癌细胞抑制的体内外实验研究【摘要】 目的 探讨OPCML在体外、体内对卵巢癌细胞的影响。方法 将OPCML用重组慢病毒转导入人卵巢癌细胞A2780、OCC1和正常小鼠卵巢上皮细胞CD1。通过细胞增殖试验、细胞聚合力试验、细胞周期的分析和体内成瘤试验等来研究OPCML在卵巢癌细胞中的功能。结果 OPCML能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞，转导效率几乎达100%，同时达到稳定的表达，Western blot 能检测到OPCML(60kDa)和GFP(27kDa)基因蛋白在靶细胞中的表达；在A2780细胞系，转导入OPCML后的细胞的增殖明显的比未转基因或仅转空载体者慢，但在OCC1和CD1细胞系，OPCML对细胞的增殖无明显的影响；用流式细胞仪法对细胞周期分析显示，OPCML对A2780的细胞周期有明显的滞留作用，但对OCC1、CD1细胞则无明显滞留作用；细胞聚合力试验提示OPCML能明显增强细胞的粘附力；表达OPCML的A2780细胞在裸鼠皮下仅有一个有肿瘤生长，体积显着小于A2780及A2780-pWPI组，免疫组织化学染色法能够检测到OPCML蛋白在肿瘤组织中的表达。结论 慢病毒载体作为转基因的工具，具有高效转导率和稳定表达的特点；OPCML能够增加细胞的粘附能力，抑制A2780的增殖和体内成瘤，提示OPCML可能是一个新的抑癌基因。【关键词】 OPCML；卵巢癌；慢病毒载体；基因转移；移植瘤模型Key words：OPCML; Ovarian cancer; Lentiviral vector; Gene transfer; Xenograft model0 引言 OPCML (Opioidbinding protein/cell adhesion moleculelike )定位于人染色体11q25，而已有的研究证实在这个区域的杂合子缺失与卵巢上皮癌的不良预后相关。因而提示在这个区域可能存卵巢癌的抑癌基因。OPCML与肿瘤的关系目前尚不清楚。我们已经从正常组织中克隆OPCML全长基因，并克隆到了慢病毒载体，为了进一步明确OPCML的功能，本研究利用重组慢病毒将OPCML转导入卵巢癌细胞，研究转基因前后细胞生物学特性的变化。 1 材料和方法材料细胞及质粒来源人胚胎肾上皮细胞293T、人卵巢浆液性囊腺癌细胞系A2780、人卵巢透明细胞癌细胞系OCC1和小白鼠正常卵巢上皮细胞系CD1均为渥太华大学癌症中心保存和提供，293T、A2780和OCC1均不表达OPCML。质粒pWPIGFP、和pMDG由瑞士Institute of Technology Lausanne由Trono博士惠赠；OPCML表达质粒pWPI-OPCML由本研究组构建。单抗、试剂盒、酶、试剂及引物来源OPCML单克隆抗体由英国爱丁堡大学Eric Miller博士惠赠。兔抗GFP多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，FuGEN6转染试剂盒购自美国Roche公司。山羊抗鸡多抗购自加拿大Abcam公司。方法重组慢病毒介导的基因转移用磷酸钙沉淀法 1将pWPIOPCML+pMDG共转染包装细胞293T，获得携带目的基因OPCML和GFP基因的重组病毒(实验组)，同时共转染pWPIGFP+ +pMDG进另一组293T作为对照。按文献方法 1分别获取重组慢病毒，后用之感染A2780、OCC1和CD1细胞系，分别获得表达OPCML和GFP的细胞系A2780OCML、OCC1OPCML、CD1OPCML以及仅携带有荧光蛋白GFP的A2780pWPI、OCC1pWPI、CD1pWPI细胞系。卵巢上皮癌细胞系OPCML基因表达检测重组慢病毒介导基因转导效率的检测重组病毒感染48h后，将培养皿放在荧光显微镜下，观察有绿色荧光的细胞数，判断感染的效率。同时可用FCM检测GFP阳性细胞百分数：将1106细胞离心沉淀，用PBS洗2次将细胞重新悬浮于1ml PBS中，尽可能吹打成单个细胞；在流式细胞仪上检测GFP阳性细胞数，验证慢病毒感染效率。采用Western blot检测靶细胞中目的基因蛋白质OPCML的表达重组病毒感染细胞72h后，收集靶细胞蛋白，Western blot检测OPCML蛋白质和标记蛋白GFP的表达。一抗分别为鸡抗OPCML的单体和兔抗GFP的多克隆抗体，二抗为相应的山羊抗鸡或山羊抗兔的多克隆抗体，用微管蛋白 (Tubulin)作为内对照。OPCML对卵巢上皮癌细胞生物行为影响的体外实验细胞增殖试验一式三份5104个对数生长期的细胞A2780, A2780pWPI, A2780OPCML, OCC1,OCC1pWPI, OCC1OPCML，CD1, CD1pWPI, CD1OPCML被分别培养在6孔的培养平板中，72h后用胰酶消化，收集细胞，并吹打成单个细胞，并用自动细胞计数仪计算细胞数，重复3次相同的实验。细胞聚合力试验将对数生长期的A2780OPCML细胞及对照组A2780pWPI细胞制成单个细胞悬浮液，将1106个细胞置于含1ml DMEM的离心管中，于37含5%CO2的培养箱中培养。每隔15min，用宽口移液管头吸取30l培养液，加入30l苔盼蓝，显微镜下计算单个活细胞数，计算单个细胞所占的百分数；重复3次相同实验。细胞周期测定用碘化丙啶染色法，用流式细胞仪按说明操作检测转染OPCML前后靶细胞的细胞周期变化。体内移植瘤形成试验 分别将5106个A2780、 A2780pWPI、 A2780OPCML注射到体重相同的雌性CD1裸鼠皮下；观察肿瘤的形成和进展，4周时，因部分肿瘤太大，结束试验；处死所有的裸鼠，解剖检查肿瘤的形成，测量肿瘤的重量；将移植瘤置于荧光显微镜下，观察绿色荧光GFP表达情况。 移植瘤中OPCML蛋白质的表达 采用免疫组织化学ABC法检测，按试剂盒说明操作。 统计学处理 用GraphPad Prism 软件作统计学处理，样本均数的比较用t检验。 2 结果基因转导效率的检测结果 重组慢病毒感染靶细胞48h后，将培养皿放在荧光显微镜下，可以看到几乎100%细胞表达GFP，流式细胞仪检测靶细胞GFP表达，其阳性率达98%以上。 Western blot检测目的基因蛋白OPCML在卵巢癌细胞系中表达结果 Western blo检测显示，重组慢病毒介导的pWPIOPCML转导入靶细胞后，分别能检测到OPCML和GFP蛋白质的表达，而对照组pWPIGFP仅能检测到GFP，无OPCML蛋白表达，见图1。 OPCML对细胞增殖能力的影响 将OPCML转导入A2780细胞后，细胞增殖速度显着慢于空白组和对照组，而空白组和对照组之间无显着性差异；但在OCC1和CD1细胞系，OPCML对细胞的增殖无明显的影响，提示OPCML能够抑制A2780的增殖，但对OCC1和CD1无明显的抑制作用，见图2。 OPCML对细胞周期的影响 FCM检测显示OPCML对A2780的细胞周期有明显的滞留作用，转导OPCML后停留在G0G1期细胞数比转导前的细胞数明显增多，但对OCC1和CD1无明显的滞留作用。 OPCML对细胞聚合力影响 细胞聚合力试验显示随着培养时间的增长，单个细胞的数目在A2780-OPCML组显着少于对照组A278-pWPI ()，提示OPCML能明显增强细胞的粘附力，有助于抑制肿瘤的转移，见图3。 OPCML对体内移植瘤生长抑制的影响 注射A2780和A2780/pWPI细胞的4只裸鼠均有肿瘤形成，其重量分别为mg和mg；而注射A2780/OPCML细胞的4只裸鼠中仅1只有肿瘤形成，其重量仅为10mg。后者在裸鼠体内成瘤重量与前两者分别比较，差异均有统计学意义()，但前两者间比较，差异无统计学意义。 荧光显微镜检测移植瘤中GFP蛋白的表达结果 将转导有pWPIOPCML或pWPIGFP的移植瘤置于荧光显微镜下，仍然可见很强的绿色荧光，而空白对照组A2780形成的肿瘤无荧光，说明被转导的基因能够持久稳定的表达。 裸鼠肿瘤组织病理学检查及OPCML蛋白表达结果 病理检查显示，形成的肿瘤细胞核大、染色质浓染，可见核分裂象，免疫组织化学染色显示在移植瘤组织细胞中，仍然有OPCML蛋白的表达，定位于细胞膜，提示慢病毒转导的基因能与宿主细胞的DNA整合，随着细胞的分裂遗传到子代，达到持久稳定的表达，见图4。 3 讨论OPCML基因对卵巢上皮癌生物学行为的影响 OPCML基因表达的蛋白位于细胞膜，是一个鸦片受体类的细胞粘附因子，广泛存在于神经系统细胞中，在调节鸦片受体和信号传导上具有重要的作用，促进细胞分化以及改变细胞膜性质 。OPCML广泛存在于正常组织和卵巢上皮组织中，在维持正常细胞功能中起着重要的作用，作为一个粘附因子，赋予了细胞间相互黏附的能力 ，同时维持细胞的正常分化发育。OPCML基因与卵巢癌的关系，目前知之甚少，但由于其染色体定位区域所发生的杂合子缺失与卵巢上皮癌不良预后相关，因而推测它为肿瘤抑制基因 。2003年Sellar等 首先报道了OPCML与卵巢癌的关系，研究结果显示，OPCML广泛存在于正常卵巢上皮，而在卵巢上皮癌，由于等位基因缺失和甲基化使OPCML失活，可能导致肿瘤的发生，在A2780细胞中OPCML是失活的 。本研究显示，正常OPCML能够抑制A2780细胞的增殖，使A2780细胞周期滞留于G0G1期；使注射A2780-OPCML细胞的裸鼠体内成瘤率明显下降，肿瘤生长速度明显变慢；能增强细胞的聚合力和粘附力。以上的体内外实验结果进一步证实了以往对OPCML基因作为抑癌基因的推测，表明OPCML基因在卵巢癌的生长、浸润和转移中发挥重要的抑制作用。 OPCML基因抑制肿瘤生长的机制尚不清楚，但在对OPCML基因结构及生物学功能的研究中发现，其序列与酪氨酸激酶生长因子类受体的序列近似，推测OPCML基因有可能通过胞内第二信使的其他途径而发挥作用，如通过胞内的第二信号传导而影响细胞的生长速度和细胞凋亡 。另有学者报道，可能由于等位基因缺失或甲基化而使OPCML基因失活，导致了肿瘤的发生 4，6。 但值得注意的是，本研究结果也显示，OPCML基因对病理类型为透明细胞癌的OCC1似乎没有抑制作用，其机制尚不清楚，可能与其遗传背境不一样，突变的基因不同，细胞间信号传导途径不一样有关。临床研究已显示，相对其他病理类型的卵巢癌而言，卵巢透明细胞极易对铂类药物产生耐药，同时预后也差 7,8。另外，在体外介导的其他抑癌基因如p53、Barx2与透明细胞癌生长关系的研究也发现，抑癌基因对透明细胞癌系的生长抑制作用明显低于其他病理类型的卵巢上皮癌 。 重组慢病毒载体介导基因转导的意义 与其他物理或化学转基因方法不同，重组病毒载体基因转移方法具有高效、快速等优点，重组慢病毒载体与重组腺病毒载体不同的是，后者不能感染非分裂期细胞，目的基因不能整合到宿主细胞DNA中而达到稳定表达，而重组慢病毒具有转染效率极高，能够感染分裂期细胞及非分裂期细胞，目的基因能整合到宿主的基因组中，并持久稳定地表达，同时具有免疫源性极小、不易产生中和抗体等优点，因而其是目前体内转基因乃至基因治疗最为合适的载体。我们所用的转基因系统中，pWPIGFP为携带目的基因的载体，其带有绿色荧光标志蛋白GFP，可以通过检测绿色荧光标志蛋白GFP间接地反映OPCML的表达，这样可以直接在显微镜下检测活细胞目的基因的转导和表达情况，具有方便、快捷和准确等优点。我们的实验显示，该系统具有极高的转染效果，经二个循环的感染，几乎可使100%的靶细胞获得目的基因，通过荧光显微镜直接观察有否GFP表达从而间接知道靶细胞是否被转染和表达OPCML，大大地简单化了实验过程，其可在23天内导入100%的靶细胞，达到稳定表达。因此，为转基因工作研究提供了有效、快捷的工具，同时为今后体内的转基因治疗提供了更为有效可行的工具。 【参考文献】 1Hanawa H, Kelly PF, Nathwani AC, et al. 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