基于线粒体Cyt b基因的洪泽湖翘嘴鲌群体遗传多样性分析.pdf

doi:10.16446/j.fsti.20221200108 收稿日期:2022-12-08 作者简介:李大命(1981),男,研究员,研究方向为渔业资源监测和保护。E-mail:ldm8212 项目资助:江苏省农业科技自主创新项目 江苏翘嘴鲌野生种质资源鉴定评价及保护策略CX(21)3003;2021 年度省级单位项 目 渔业生态与资源监测(2021-SJ-110-03)。基于线粒体 Cyt b 基因的洪泽湖翘嘴鲌群体遗传多样性分析李大命1 杨子萍1,2 刘燕山1 谷先坤1 唐晟凯1 杨家新2(1 江苏省淡水水产研究所,江苏省内陆水域渔业资源重点实验室,江苏南京 210017;2 南京师范大学海洋科学与工程学院,江苏南京 210023)摘 要:为全面了解洪泽湖翘嘴鲌的种质资源遗传状况,采用 Cyt b 基因(线粒体细胞色素 b 基因),分析了洪泽湖 6 个群体共计 210 尾翘嘴鲌的遗传多样性及遗传结构。结果显示,Cyt b 基因序列全长为 1 141 bp,碱基 A+T 的含量(56.0%)大于 G+C 的含量(44.0%)。试验共检测到 31 个变异位点,定义 26 个单倍型,平均单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为 0.7350.032 和 0.001 90.000 1;6 个群体的单倍型多样性(Hd)为(0.6180.096)(0.7880.064),核苷酸多样性(Pi)为(0.001 50.000 3)(0.002 10.000 2);翘嘴鲌的遗传多样性属于高 Hd低 Pi类型,暗示其遗传多样性较低。分子方差分析显示,遗传差异主要来源于群体内部,群体间的遗传分化指数 Fst为-0.017 70.018 2,P0.05,表明群体间没有显著的遗传分化。单倍型邻接关系树和单倍型网络结构图显示,所有单倍型聚为 1 个分支,6 个群体未形成特定的地理遗传结构。Tajimas D 和 Fus Fs中性检验均为负值,且具有显著性差异,核苷酸错配分布曲线呈现明显的单峰分布,均表明翘嘴鲌在历史上经历了显著的群体扩张事件。研究结果表明,洪泽湖翘嘴鲌6 个群体间没有显著的遗传分化,应作为 1 个整体进行管理和保护。洪泽湖翘嘴鲌资源遗传多样性较低,需要采取措施增加翘嘴鲌种群数量,提高其遗传多样性。关键词:洪泽湖;翘嘴鲌;Cyt b 基因;遗传多样性;群体历史动态 洪泽湖(1181011852E,33063340N)位于江苏省西部淮河下游,水域面积约 1 597 km2,是我国五大淡水湖之一。洪泽湖具有相对稳定的水位、宽广的水域和丰富的水生生物资源,为渔业发展提供了良好条件,是我国主要淡水渔业基地之一1。近几十年来,由于过度捕捞、水体环境质量下降、水利工程建设等多重因素影响,洪泽湖鱼类物种数量减少,群落结构趋于单一化,鱼类小型化趋势严重,大型肉食性鱼类如翘嘴鲌等资源衰退严重1-2。翘嘴鲌(Culter alburnus)隶属于鲤形目(Cyp-riniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鲌亚科(Culteri-nae)、鲌属(Culter),俗称白鱼、翘嘴白丝、大白鱼等,广泛分布于我国各个水系3。翘嘴鲌为凶猛肉食性鱼类,是水域生态系统中的顶级消费者,能有效控制小型鱼类种群数量,减轻小型鱼类对浮游生物的压力,在稳定生态系统结构和功能中发挥重要作用4-5。近年来,渔业主管部门在洪泽湖开展了翘嘴鲌人工放流,对于恢复翘嘴鲌资源发挥了重要作用,但盲目的增殖放流可能会对鱼类资源遗传结构产生不利影响6。因此,迫切需要了解洪泽湖的翘嘴鲌种质资源状况和遗传多样性1432023,50(6)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)水平,用于指导洪泽湖翘嘴鲌增殖放流、种质资源保护和管理工作。目前,分子标记技术被广泛用于研究物种群体的遗传多样性和遗传结构。由于线粒体 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)具有分子小、结构简单、进化快、严格的母系遗传等特点,因此成为群体遗传学和分子系统学的重要分子标记6。Cyt b 基因(线粒体细胞色素 b 基因)是 mtDNA 的 13个蛋白编码基因之一,其结构和功能较为清晰,进化速率适中,包含着从种内到种间的较强进化信号,故被广泛用于物种多样性和系统进化等方面的研究7-9。王利华等10应用 CO和 Cyt b 基因分析了 6 种鲌属鱼类(达氏鲌、海南鲌、尖头鲌、蒙古鲌、拟尖头鲌和翘嘴鲌)的遗传关系,认为线粒体 CO和 Cyt b 基因可以作为 DNA 条形码鉴定鲌属鱼类。李大命等11采用 Cyt b 基因序列研究了滆湖 3 种鲌属鱼类(翘嘴鲌、蒙古鲌、达氏鲌)的遗传多样性,发现 3 种鲌鱼的遗传结构趋于单一化。张桂宁等12通过 Cyt b 基因序列分析发现,长江下游 4 个翘嘴鲌群体的遗传多样性较高。2009 年,伊西庆13采用线粒体 ND2 基因序列对采集的 16 尾洪泽湖翘嘴鲌进行了遗传分析,检测到较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性,但该研究所分析的样本量较少,其结果无法准确反映洪泽湖翘嘴鲌的遗传状况。近十多年,尚未有关于洪泽湖翘嘴鲌遗传多样性的研究报道。本研究拟采用线粒体 Cyt b 基因序列,对6 个洪泽湖翘嘴鲌群体的遗传多样性和遗传结构进行分析,以期了解当前洪泽湖翘嘴鲌群体的遗传多样性状况,并为翘嘴鲌增殖放流、种质资源保护及利用提供科学的理论依据。1 材料和方法1.1 样品采集和处理2021 年在洪泽湖开展渔业资源监测,采用三重刺网在 6 个采样点采集翘嘴鲌 210 尾,其中洪泽群体(HZ)35 尾,高渡群体(GD)34 尾,顾勒河群体(GLH)34 尾,新开河群体(XKH)33 尾、临淮群体(LH)36 尾,马浪岗群体(MLG)38 尾。各群体样品采样点位置见表 1。测量每尾鱼的体长,称取体质量,并剪取尾鳍组织放入无水乙醇中保存。表 1 洪泽湖翘嘴鲌各群体采样点位置采样点经纬度坐标洪泽东经 118.829 8,北纬 33.360 1高渡东经 118.819 7,北纬 33.498 1顾勒河东经 118.517 7,北纬 33.470 1新开河东经 118.439 3,北纬 33.326 1临淮东经 118.425 6,北纬 33.231 3马浪岗东经 118.439 3,北纬 33.211 61.2 DNA 提取、PCR 扩增和测序采用 TaKaRa 公司试剂盒提取翘嘴鲌的基因组 DNA,将 DNA 溶于 TE 溶液,于-20 保存备用。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA 质量和浓度。线粒体 Cyt b 基因扩增引物为 L14724(序列为 5-CGTCAGTCCTTTACTTCGCA-3)和 H15915(序 列 为5-AGGGCATACTCACGGGGTTG-3)14,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反应体系共 50 L,其中包括:2Premix TaqTM 25 L(TaKaRa Taq 1.25 U/25 L、0.2 mM dNTP、1.5 mM Mg2+、色素 Marker、比重增加物和稳定剂)、上、下游引物各 2 L(10 mol/L)、DNA 模板 2 L(40 ng/L)和 ddH2O 19 L。PCR 扩增程序为:94 预变性 4 min;94 变性40 s,55 复性 30 s,72 延伸 1 min,35 个循环;72 延伸 5 min。PCR 反应完成后,取 4 L 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测,剩余的 PCR 产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化和双向测序,测序引物与扩增引物一致。1.3 数据处理和分析使用 BioEdit 7.0.9.0 软件15读取序列,并参照测序图谱人工校对序列中可能的错误。使用CLUSTALX 2.0 软件16对序列进行多重比对和排序。使用 MEGA 7.0.26 软件17统计序列的碱基组成、突变位点数和突变类型,计算群体间的Kimura 双参数遗传距离,利用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建单倍型系统发育树,系统树中节点的自举置信水平应用自引导估计,循环次数为1 000 次。采用 Network 软件构建单倍型网络图,用以展示单倍型之间的进化关系。使用 DanSP 5软件18计算群体的单倍型数量、单倍型多样性(haplotye diversity,Hd)、核苷酸多样性(nucleotide diversity,Pi)、平均核苷酸差异数(K)等遗传多样243水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(6)性参数。采用 Arlequin 3.5 软件19进行分子方差分析(AMOVA),计算群体间的遗传分化指数(Fst),开展 Tajimas D 及 Fus Fs中性检验和构建核酸错配分布曲线,评估翘嘴鲌群体的历史动态。2 结果2.1 Cyt b 基因序列变异及遗传多样性本研究获得翘嘴鲌的 Cyt b 基因全序列,其长度为 1 141 bp。4 种碱基的平均含量分别为 A(29.4%)、T(26.6%)、C(29.4%)和 G(14.6%),碱基 A+T 含 量(56.0%)大 于 G+C 含 量(44.0%),具有明显的碱基组成偏倚性。210 条Cyt b 序列中共发现 31 个变异位点,其中有 11 个单突变位点,20 个简约信息位点。6 个群体 210 尾翘嘴鲌共定义了 26 个单倍型,整个群体的单倍型多样性和核苷酸多样性分别为 0.7350.032 和 0.001 90.000 1,平均核苷酸差异数为 2.118(见表 2)。6 个群体中,马浪岗群体(MLG)的遗传多样性最高(Hd为 0.7880.064,Pi为 0.00210.0002),高渡群体(GD)的遗传多样最低(Hd为 0.6180.096,Pi为 0.001 50.000 3)。洪泽湖翘嘴鲌的遗传多样性具有典型的高单倍型多样性和低核苷酸多样性模式。表 2 洪泽湖翘嘴鲌群体遗传多样性参数群体样品数量变异位点单倍型数量单倍型多样性(Hd)核苷酸多样性(Pi)平均核苷酸差异数(K)HZ3517140.7080.0860.002 00.000 32.329GD3412110.6180.0960.001 50.000 31.695GLH3414120.7870.0650.002 00.000 32.242XKH3313100.7710.0670.001 80.000 32.098LH3615100.7330.0730.001 90.000 32.009MLG3815120.7880.0640.002 10.000 22.344总体21031260.7350.0320.001 90.000 12.1182.2 群体单倍型组成及系统发育6 个群体定义了 26 个单倍型,其中洪泽群体拥有 14 个单倍型,高渡群体拥有 11 个单倍型,顾勒河和马浪岗群体各拥有 12 个单倍型,新开河和临淮群体各有 10 个单倍型。26 个单倍型中,共享单倍型有 18 个,独享单倍型有 8 个。其中,共享单倍型 Hap3 和 Hap6 为 6 个群体共有,个体数量分别有 17 个和 105 个,占整个群体的比例合计为 58.1%;共享单倍型 Hap1、Hap2、Hap4、Hap8、Hap1112、Hap1417 和 Hap1924 为部分群体共有,个体数量共有 80 个,占整个群体的比例合计为 38.1%;独 享 单 倍 型 Hap5、Hap7、Hap9、Hap10、Hap13、Hap18、Hap25 和 Hap26 为各自群体独有,个体数量均只有 1 个,占整个群体的比例合计为 3.8%(见表 3)。整体来看,共享单倍型的个体数量多,占群体的比例高,暗示 6 个群体间存在广泛的基因交流。表 3 洪泽湖 6 个翘嘴鲌群体单倍型组成单倍型群体HZGDGLHXKHLHMLGHap121Hap211Hap3132443Hap4112Hap51Hap6192115151817Hap71Hap81111Hap91Hap101Hap1112Hap12121Hap131Hap141111Hap151221Hap162232Hap1711422Hap181 Hap192143Hap2011Hap21121Hap2222Hap23153Hap2411Hap251Hap2613432023,50(6)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)利用红鳍原鲌(Cultrichthys erythropterus)和蒙古鲌(Culter mongolicus)作为外类群,基于邻接法构建单倍型系统发育树(见图 1)。结果显示,所有单倍型聚为一个进化分支,分支的置信限水平为100%。单倍型在6 个群体中呈混杂分布模式,图 1 洪泽湖翘嘴鲌群体单倍型 NJ 系统树没有形成与群体地理位置相对应的谱系关系。单倍型网络结构图也得出类似结果(见图 2),说明6 个群体间没有明显的遗传分化。图 2 洪泽湖翘嘴鲌群体单倍型网络结构图2.3 群体间遗传结构6 个群体间的遗传距离为 0.001 60.002 0,遗传距离均值为 0.001 9,表明群体间遗传差异较小,亲缘关系较近(见表 4)。分子方差分析结果显 示,群 体 内 个 体 间 的 分 子 变 异 占 比 为100.33%,群体间遗传变异占比为-0.33%,遗传分化指数 Fst值为-0.003 3(P=0.624 6)(见表 5),表明整个翘嘴鲌群体没有出现遗传分化。两两群体间的 Fst值为-0.017 70.018 2,且统计检验结果均不显著(见表 4),显示群体间没有形成显著的遗传分化。表 4 洪泽湖翘嘴鲌 6 个群体间的遗传距离(对角线下)和遗传分化指数(对角线上)群体HZGDGLHXKHLHMLGHZ-0.012 6-0.000 8-0.015 2-0.008 6-0.017 7GD0.001 70.018 20.012 9-0.002 50.011 0GLH0.002 00.001 80.011 60.008 4-0.012 0XKH0.001 90.001 60.001 9-0.012 5-0.002 2LH0.001 90.001 60.001 90.001 80.000 6MLG0.002 00.001 80.002 00.001 90.001 9443水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(6)表 5 洪泽湖翘嘴鲌群体分子方差分析变异来源自由度方差和变异组分变异比例遗传分化指数群体间 54.700-0.003 5 Va-0.33-0.003 3群体内204216.6811.062 2 Vb100.33合计209221.3811.058 6100 注:Va 和 Vb 分别表示群体间变异和群体内变异。表 6 洪泽湖翘嘴鲌群体的中性检验中性检验HZGDGLHXKHLHMLG总体Tajimas D-1.447 2-1.342 9-1.123 0-1.116 8-1.444 6-1.104 8-1.683 2P 值0.0610.0850.1370.1550.0570.1310.014Fu Fs-6.360 3-4.745 9-4.308 1-2.678 8-2.648 63.667 8-13.532 9P 值0.0030.0080.0140.0490.0840.0430.0012.4 群体历史动态采用 Tajimas D、FuFs中性检验和核苷酸错配分布曲线分析翘嘴鲌群体的历史动态。结果显示,6 个群体的 Tajimas D 检验值统计均无显著性差异(P0.05),除临淮群体(LH)外,FuFs检验值统计均有显著性差异(P0.05)(见表 6),且 6 个群体的核苷酸错配分布曲线呈现出单峰模式(见图 3),表明 6 个群体显著偏离中性进化。从整体来看,其 Tajimas D 和 FuFs的检测值分别为-1.683 2 和-13.532 9,统计分析具有显著性差异(P0.05),且核苷酸分布曲线也具有典型的单峰模式(见图 3),表明翘嘴鲌在进化过程中发生了群体扩张事件。图 3 洪泽湖翘嘴鲌群体核苷酸错配分布曲线3 讨论3.1 翘嘴鲌的遗传多样性遗传多样性是生物多样性的基础,也是评价生物种质资源状况及制定种质资源保护措施的重要依据。单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)是衡量群体遗传多样性的重要指标,其数值越大,表明群体遗传变异越丰富,遗传多样性也越高20-21。相比较而言,核苷酸多样性考虑各种单倍型在群体中所占的比例,能更为精确地反映群体多态性程度22。本研究结果显示,洪泽湖翘嘴鲌的平均单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.7350.032 和 0.001 90.000 1,6 个群体的单倍型多样性在(0.6180.096)(0.7880.064),核苷酸多样性为(0.001 50.000 3)(0.002 10.000 2)。Grant 等23根据单倍型多样性和核苷酸多样性大小,将单倍型多样性和核苷酸多样性之间的关系分为 4 种类型:高 Hd高 Pi、高 Hd低Pi、低 Hd高 Pi和低 Hd低 Pi。据此判定,洪泽湖翘嘴鲌的遗传多样性属于高 Hd(Hd0.5)低 Pi(Pi0.005)类型,这种遗传多样性模式暗示翘嘴鲌的遗传多样性较低23。多年来,受过度捕捞、环境污染、非法采砂等不利因素的影响,洪泽湖环境生态质量下降,翘嘴鲌渔业资源量明显减少,其适宜的栖息环境大幅缩减,个体小型化和种群低龄化趋势加剧,遗传多样性丧失。已有研究结果显示,我国许多水体的野生翘嘴鲌资源遗传多样性具有高 Hd低 Pi共存现象11,13,24-26,表明翘嘴鲌遗传多样性较低是一个普遍现象,需要采取措施恢复翘嘴鲌资源量及提高其遗传多样性。3.2 翘嘴鲌的历史动态鱼类群体的遗传多样性模式与群体的历史动态有密切的联系。Grant 等23提出了一个较简单的模式,即利用 Hd、Pi来推测群体的历史动态:当Hd0.5、Pi0.005 时,表示群体稳定,具有较悠久的进化历史;当 Hd0.5、Pi0.005 时,表示群体是经历瓶颈效应后迅速扩张而来的;当 Hd0.5、Pi0.005 时,表明群体经历了轻微的瓶颈效应,几乎没有影响到核苷酸变异;当 Hd0.5、Pi0.005 时,表明群体近期经历了瓶颈效应。本研究结果显示,翘嘴鲌群体的单倍型多样性较高5432023,50(6)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)(Hd0.5),而核苷酸多样性较低(Pi0.005),由于积累核苷酸多样性所需的时间比积累单倍型所需的时间漫长,表明洪泽湖翘嘴鲌群体是从一个有效种群数量较小的种群经快速扩张而来的,但是仍然没有达到积累核苷酸变异所需要的时间。通常情况下,有 2 种方法可用于推测群体的历史动态:(1)核苷酸错配分布曲线。若分布曲线呈单峰分布,表明群体经历了种群扩张;若分布曲线呈双峰分布,表明群体没有经历过种群扩张,较为稳定27-28。(2)Tajimas D 和 FuFs中性检验。若中性检验值为负值且统计分析结果为显著,表明群体可能经历了种群扩张29-30。本研究结果显示,洪泽湖翘嘴鲌群体的 Tajimas D 和 FuFs中性检验值均为负值,统计检验结果具有显著性差异(P0.05,均表明翘嘴鲌群体间没有出现遗传分化,群体的分子系统发育树和单倍型网络结构图也支持上述观点。从群体的单倍型组成来看,群体间有多个共享单倍型,且共享单倍型的个体数量占比较高,说明群体间存在广泛的基因交流。对于鱼类而言,地理阻隔或同一水域中存在不同的栖息环境可能会限制基因交流,从而使群体间产生遗传分化现象32。本研究中的 6 个群体虽处于洪泽湖的不同水域,水域生态环境也存在一定的差异33-34,但群体所在的地理位置较近,没有形成有效的地理隔离,而翘嘴鲌游泳能力强,活动范围广,也助推了群体间的基因交流。此外,近年来渔业主管部门在洪泽湖开展了翘嘴鲌增殖放流活动,大量人工养殖群体的加入容易导致群体遗传结构的单一和均质化,这一现象 在 其 他 水 域 的 增 殖 放 流 种 类 中 均 有 发现35-37。根据翘嘴鲌的遗传结构特点,应将 6 个群体作为一个进化单位进行管理和保护。3.4 翘嘴鲌资源保护对策对鱼类群体遗传多样性和遗传结构的研究可以为渔业资源管理措施及物种保护策略的制定提供重要的数据支撑。研究结果显示,洪泽湖翘嘴鲌的遗传多样性具有高单倍型多样性和低核苷酸多样性共存现象,表明翘嘴鲌遗传资源较为贫乏。本研究洪泽湖翘嘴鲌 6 个群体间没有显著的遗传分化,因此可将洪泽湖不同水域的翘嘴鲌群体作为一个整体进行管理和保护。针对洪泽湖翘嘴鲌的遗传多样性现状,应当采取措施,加大对翘嘴鲌的保护力度:(1)强化渔业资源管理,加大执法力度,严厉打击非法捕捞,禁止电、毒、炸等作业方式;(2)控制环境污染,开展生态环境治理,恢复水生植被,构建人工鱼巢,为翘嘴鲌生存和繁殖提供良好的生态环境;(3)科学规范地进行翘嘴鲌增殖放流,提高翘嘴鲌的成活率,开展放流群体和野生群体的遗传评估,跟踪监测翘嘴鲌资源变化,逐步提高翘嘴鲌的遗传多样性。参考文献1林明利,张堂林,叶少文,等.洪泽湖鱼类资源现状、历史变动和渔业管理策略J.水生生物学报,2013,37(6):1118-1127.2毛志刚,谷孝鸿,龚志军,等.洪泽湖鱼类群落结构及其资源变化J.湖泊科学,2019,31(4):1109-1119.3倪勇,伍汉霖.江苏鱼类志M.北京:中国农业出版社,2006:283-289.4覃亮,熊邦喜,王基松,等.鲌属鱼类在天然水域中的生态功能及资源增殖对策J.湖北农业科学,2009,48(1):233-236.5刘恩生,吴林坤,曹萍,等.太湖鲌鱼数量变化规律及生态效应分析J.水利渔业,2007,28(3):70-73.6汪鄂洲,李全宏,徐念,等.基于 CO和 Cyt b 序列的丹江口水库鲢群体遗传结构分析J.水生态学杂志,2022,43(4):103-110.7吕国庆,李思发.鱼类线粒体 DNA 多态研究和应用进展J.中国水产科学,1998,5(3):94-99.8边力,王鹏飞,陈四清,等.基于线粒体 Cyt b 基因序列的绿鳍马面鲀 6 个野生群体的遗传结构分析J.中国水产科学,2018,25(4):827-836.9李大命,唐晟凯,刘燕山,等.基于 Cyt b 基因的江苏省湖鲚种群遗传多样性和遗传结构分析J.中国农学通报,2021,37(20):144-151.10王利华,罗相忠,王丹,等.基于 CO和 Cytb DNA 条形码在鲌属鱼类物种鉴定中的应用J.淡水渔业,2019,49(4):22-643水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(6)28.11李大命,刘洋,唐晟凯,等.基于 Cytb 基因的滆湖鲌类国家级水产种质资源保护区 3 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sequences.The results showed that the full length of Cyt b gene was 1 141 bp,and the A+T base composition(56.0%)was higher than the C+G combination(44.0%).A total of 31 variable sites were identified and 26 haplotypes were defined,and the average haplotype diversity index(Hd)and average nucleic acid diversity index(Pi)was 0.7350.032 and 0.001 90.000 1,respectively.The haplotype diversity index and the nucleic acid diversity index of six populations ranged from 0.6180.096 to 0.7880.064 and from 0.001 50.000 3 to 0.002 10.000 2,respectively.The genetic diversity of C.alburnus showed high Hd and low Pi pattern,which suggested that its genetic diversity was low.The results of molecular variance analysis showed that genetic variations between different geographical populations in the Hongze Lake were mainly within group;The values of genetic differentiation index(Fst)were-0.017 7-0.018 2,which indicated that there was no significant genetic differentiation among populations.The NJ phylogenetic tree of haplotypes and haplotype network both showed that all haplotypes clustered into one branch,and there was absence of specific geographical genetic structure.The values of Tajimas D and FuFs neutral tests of C.alburnus were both significantly negative,and the mismatch distribution curve was obvious unimodal,both of which suggested C.alburnus had experienced popu-lation expansion in the history.Overall,there was no significant g