基于网络药理学探讨消瘤藤治疗子宫肌瘤的作用机制.pdf

2023 年8月第29卷第8期August.2023 Vol.29 No.8基于网络药理学探讨消瘤藤治疗子宫肌瘤的作用机制*胡筱希1，黄建猷1,2，黄周锋1，陆国寿1,2，谭晓1，刘瑛1,2，黎骊1（1.广西壮族自治区中医药研究院，广西南宁530022；2.广西中药质量标准研究重点实验室，广西南宁530022）摘要目的：应用网络药理学方法搜索消瘤藤治疗子宫肌瘤的活性成分、靶基因及信号通路，探讨消瘤藤抗子宫肌瘤的作用机制。方法：采用95%乙醇加热回流提取消瘤藤药材，利用HPLC-LTQ/Orbitrap MS技术对消瘤藤提取物进行检测。通过对照品、分子量和质谱裂解规律对消瘤藤化学成分进行鉴定。运用Swiss TargetPrediction、GeneCards在线预测消瘤藤化学成分与“散瘀、消肿”相关的潜在靶点，在DAVID 6.8平台进行基因功能富集和KEGG通路富集分析，Cytoscape 3.6.0软件构建“成分-靶点-通路”网络，Autodock软件对核心成分与关键蛋白进行分子对接验证。结果：从消瘤藤中鉴定了14个化学成分，通过网络药理学预测出14种成分与“血瘀”“子宫肌瘤”相关潜在靶点23个，重要通路7条。结论：消瘤藤的活性成分在蛋白多糖、黏附斑激酶、Rap1及Ras通路具有关键作用，可能通过调节胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）、表皮生长因子受体（EGFR）等靶点，通过多通路的方式共同作用起到“散瘀、消肿”作用。关键词子宫肌瘤；消瘤藤；高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱；网络药理学；散瘀；消肿中图分类号R273文献标识码A文章编号1672-951X（2023）08-0126-06DOI：10.13862/43-1446/r.2023.08.025The Mechanism of Xiaoliuteng(Pileostegia Tomentella)in the Treatmentof Fibroid Based on Network PharmacologyAbstractObjective:To explore the active ingredients,target genes and signal pathways of Xiaoliuteng(Pileostegia tomentella)in the treatment of fibroid and to explore the anti-fibroid mechanism of Xiaoliuteng(Pileostegia tomentella)according to network pharmacology.Methods:The Xiaoliuteng(Pileostegia tomentella)wasextracted by reflux extraction using 95%ethanol as solvent.The chemical constituents were separated and identifiedby HPLC-LTQ/Orbitrap MS.The chemical components of Xiaoliuteng(Pileostegia tomentella)were identified byreference substance,molecular weight and mass spectrometry fragmentation pattern.The Swiss Target Predictionand GeneCards were used to predict the potential target related to the chemical components of Xiaoliuteng(Pileostegia tomentella)and dispersing blood stasis and reducing swelling.Gene ontology enrichment analysisand KEGG pathway enrichment analysis were performed on the DAVID6.8 platform,and the component-target-pathnetwork map was built by Cytoscape 3.6.0.Molecular docking of citrusinol with cytoskeletal protein was carriedout by Autodock.Results:Totally 14 major constituents were separated and identified by tandem mass spectrometer,and 23 potential target and 7 important pathways were predicted by network pharmacology among the 14 majorconstituents.Conclusion:The active ingredient from Xiaoliuteng(Pileostegia tomentella)played key roles inproteoglycans,focal adhesion,Rap1 and Ras signaling pathway.They may work together through multiple pathwaysby regulating targets such as insulin-like growth factor 1 receptor(IGF1R)and epidermal growth factor receptor引用：胡筱希，黄建猷，黄周锋，陆国寿，谭晓，刘瑛，黎骊.基于网络药理学探讨消瘤藤治疗子宫肌瘤的作用机制J.中医药导报,2023,29(8):126-131.*基金项目：广西自然科学基金（2020GXNSFAA259067，2022GXNSFBA035500）；广西中医药适宜技术开发与推广项目（GZSY20-04）；广西中药质量标准研究重点实验室自主研究课题（桂中自研2021003）通信作者：黄建猷，E-mail：1262023 年8月第29卷第8期August.2023 Vol.29 No.8子宫肌瘤是妇女常见的良性肿块，国医大师班秀文认为其属中医学“癥瘕”“带下”范畴1。子宫肌瘤的发生，多因经产时病邪入侵、七情过极、脏腑功能失调等原因，形成瘀血、痰饮、湿浊等有形之邪，停积胞宫，胶结不解，日积月累而逐渐形成肌瘤。治法以活血化瘀，软坚散结，攻坚破积，祛除消块为主2-3。消瘤藤又名肿瘤藤、山枇杷等，为虎耳草科植物星毛冠盖藤Pileostegia tomentella Hand.-Mazz.的藤茎，分布于浙江、江西、福建、湖南、广东、广西、贵州等地4-6。中华本草4认为其具有祛风除湿、散瘀止痛、消肿解毒的功能，主治腰腿酸痛、风湿麻木、跌打损伤、骨折、外伤出血、痈肿疮毒。广西金秀瑶族自治县瑶医医院将其用于子宫肌瘤等多种肿瘤疾病的治疗。消瘤藤用于治疗子宫肌瘤，有可能是通过“散瘀、消肿”的功效发挥作用，有别于现代医学“杀灭肿瘤”的治疗思路，具有一定的特色及新颖性。但消瘤藤在传统医学理论指导下的“散瘀、消肿”功效物质基础及分子作用机制方面的研究仍较为匮乏。本研究拟在前期消瘤藤化学成分研究7结合相关文献8-9的基础上，通过HPLC-LTQ/Orbitrap-MS分析结合网络药理学技术，对消瘤藤“散瘀、消肿”的分子机制进行分析，对其“散瘀、消肿”功效的物质基础及分子作用机制进行解释，为消瘤藤这一少数民族特色药材的开发利用打下基础。1材料1.1仪器HPLC-LTQ/Orbitrap MS（美国热电公司）；T500型电子天平（常数市双杰测试仪器厂）。1.2材料消瘤藤采自广西金秀县，由广西中医药研究院副主任药师严克俭鉴定为虎耳草科消瘤藤Pileostegia tomentellaHand.-Mazz的藤茎。乙腈、甲酸为色谱纯，其余为分析纯。2方法2.1样品制备将消瘤藤药材粉碎，过40目筛，精密称取粉碎后样品10 g，加入100 mL 95%乙醇回流30 min，共2次，过滤，合并滤液，回收溶剂，滤液蒸干后用无水乙醇定容于100mL容量瓶中，得到供试液质量浓度为100 mg/mL（以生药计）。2.2LC-MS条件XTerra C18色谱柱（2.1mm伊100mm，3.5滋m）；流动相A为0.1%甲酸+2.5 mmol/L乙酸铵水，流动相B为乙腈进行梯度洗脱（0耀15min，90%A耀70%A；15耀25min，70%A耀30%A；25耀30 min，30%A耀20%A；30耀32 min，20%A耀10%A；32耀37 min，10%A；37耀37.10 min，10%A 耀90%A；37.10耀40 min，90%A）；流速：0.2 mL/min；柱温：25 益；检测波长：282 nm。ESI离子源；正离子检测；毛细管温度：320 益；脱气溶剂温度：350 益；脱气溶剂气流量：10 L/min；扫描范围（m/z）：1502 000；雾化器压力：35 000 kpa；毛细管电压：4 kV；锥孔电压：100 V。2.3消瘤藤化学成分及疾病靶点预测通过HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析，得到消瘤藤的化学成分，化合物分子结构用Chemdraw软件绘制，以SDF文件格式保存，依次导入SwissTarget Prediction数据库（http:/www.swisstargetprediction.ch/）对靶点进行预测，选择排名前20位潜在的活性靶点。在GeneCards数据库（http:/www.genecards.org）、MalaCard数据库（malacard.org）及OMIM数据库（omom.org）检索与“血瘀”“子宫肌瘤”相关的靶点，取交集并与化合物靶点行比对，找出重复项，整理合并得到潜在相互作用靶点。2.4“成分-靶点”网络构建根据靶点预测结果，利用String平台（http:/string-db.org/）构建疾病-靶点蛋白相互作用关系，将结果导入Cytoscape 3.6.0软件建立成分-靶点相互作用网络并进行网络分析（Networkanalyzer）。2.5GO富集分析将预测靶点的Uniprot ID导入David 6.8（http:/david.ncifcrf.gov），选择Uniprot Accession，对消瘤藤的核心靶点可能存在的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）进行GO富集分析（0.05），根据值绘制柱状图。2.6KEGG通路富集分析利用DAVID 6.8导入消瘤藤靶点的Uniprot ID后进行KEGG通路富集分析，并根据富集程度和表1消瘤藤化学成分分析编号保留时间/min 一级质谱/（m/z）理论值/（m/z）二级质谱/（m/z）化合物中文名化合物英文名称14.02372.145 2372.142 0316.082 7紫丁香苷Syringin24.25325.092 0324.084 5163.039 6茵芋苷Skimmin35.70163.039 0163.031 6132.081 3伞型花内酯Umbelliferone45.92193.049 8192.042 2161.059 97-羟基-8-甲氧基香豆素7-hydroxy-8-methoxycoumarin56.06223.060 0222.052 8149.023 6秦皮啶Fraxidin67.27395.161 4394.189 2363.134 2，293.092 3马钱子碱Brucine711.10146.092 8146.036 7104.070 8-Coumarin811.13163.039 0162.031 6132.081 33-羟基香豆素3-Hydroxycoumarin911.48271.096 7270.089 2211.075 5，183.080 7异欧前胡素Isoimperatorin1014.55411.199 3410.184 1177.055 1伪马钱子碱Pseudobrucine1121.36342.169 7342.131 4301.140 6松柏苷Coniferin1224.92358.368 6358.340 0255.107 4，199.045 4当药苷Sweroside1326.77217.104 3217.110 2193.963 3，107.967 5-7-（ethylamino）-4，6-dimethylchromen-2-one1434.31577.463 0576.438 9415.171 3胡萝卜苷Daucosterol(EGFR)to dispell blood stasis and reduce swelling.Keywordsfibroid;Xiaoliuteng(Pileostegia tomentella);HPLC-LTQ/Orbitrap MS;network pharmacology;dispelling blood stasis;reducing swelling1272023 年8月第29卷第8期August.2023 Vol.29 No.8值并使用R语言对其可视化作图。筛选出主要信号通路导入Cytoscape 3.6.0进行“成分-靶点-通路”相互作用的构建并可视化。2.7分子对接验证结合“成分-靶点-通路”分析结果，选择节点数量多的关键靶点与其对应的成分进行分子对接，从PDB数据库下载相应的蛋白结构，除去原有的复合物配体后，采用AUTODOCK软件进行对接，并导出对接结果，采用PYMOL作图。3 结果3.1HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析结果消瘤藤提取物总离子流图见图1。查询国内外消瘤藤及植物化学成分研究相关文献报道10-15，同时借助Scifinder和Pubchem数据库，收集整理了消瘤藤中各化学成分的数据，根据一级质谱的准分子离子峰信息和二级质谱的结构碎片信息，推测出了14个化学成分的可能结构；通过与对照品的质谱信息进行比对，1、2、12号峰得到确证，分别是紫丁香苷、茵芋苷、当药苷。（见图2）所有化合物信息，已鉴定和已推测的化合物保留时间、一级质谱、二级质谱和分子信息见表1。图 1消瘤藤提取物总离子流图图 2紫丁香苷（A）、茵芋苷（B）、当药苷（C）对照品质谱图3.2消瘤藤化学成分及疾病靶点预测通过HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析，得到消瘤藤的化学成分14个，根据SwissTarget Prediction数据库靶点预测结果，选择排名前20位潜在的活性靶点，共获得280个基因靶点。在GeneCards、MalaCards及OMIM数据库中检索与“血瘀”“子宫肌瘤”相关的靶点，取交集共82个。（见图3）与化合物靶点进行比对，找出重复项，整理合并得到潜在相互作用靶点23个，可以看出消瘤藤主要从抗炎、调控肿瘤细胞凋亡及转移、抗凝血等方面发挥“散瘀、消肿”治疗子宫肌瘤的作用。（见表2）图 3疾病靶点交集韦恩图表 2潜在靶点预测Uniprot数 据 库 编 号靶 点通 用 名 称P10275雌 激 素 受 体（Androgen Receptor）ARP08069胰 岛 素 样 生 长 因 子（Insulin-like growth factor I receptor）IGF1RP31749丝/苏 氨 酸 蛋 白 激 酶 AKT（Serine/threonine-protein kinase AKT）AKT1Q16539丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 p38琢（MAPK kinase p38 alpha）MAPK14P04626人 表 皮 生 长 因 子 受 体 erbB-2（2Receptor protein-tyrosine kinase erbB-2）ERBB2Q136395-羟 色 胺 受 体 4Serotonin 4(5-HT4)receptorHTR4O14965丝 氨 酸/苏 氨 酸 蛋 白 激 酶 Aurora-A（Serine/threonine-protein kinase Aurora-A）AURKAP00533表 皮 生 长 因 子 受 体 erbB1（Epidermal growth factor receptor erbB1）EGFRP47989黄 嘌 呤 脱 氢 酶（Xanthine dehydrogenase）XDHQ92731雌 激 素 受 体 茁（Estrogen receptor beta）ESR2P35916血 管 内 皮 生 长 因 子 受 体 3（Vascular endothelial growth factor receptor 3）FLT4P22460电 压 门 控 钾 通 道 亚 基 Kv1.5（Voltage-gated potassium channel subunit Kv1.5）KCNA5P42336PI3-激 酶p110-alpha 亚 单 位（PI3-kinase p110-alpha subunit）PIK3CAP17931半 乳 糖 凝 集 素-3（Galectin-3）LGALS3P60568白 细 胞 介 素-2（Interleukin-2）IL2Q07817凋 亡 调 节 因 子 Bcl-X(Apoptosis regulator Bcl-X)BCL2L1P00734凝 血 酶（Thrombin）F2P35968血 管 内 皮 生 长 因 子 受 体 2（Vascular endothelial growth factor receptor 2）KDRP09917花 生 四 烯 酸 5-脂 氧 合 酶（Arachidonate 5-lipoxygenase）ALOX5P12931络 氨 酸 蛋 白 激 酶 SRC(Tyrosine-protein kinase SRC)SRCP08581肝 细 胞 生 长 因 子 受 体（Hepatocyte growth factor receptor）METP15121醛 糖 还 原 酶（通 过 同 源 性）(Aldose reductase by homology)AKR1B1P23219环 氧 合 酶-1（Cyclooxygenase-1）PTGS13.3“成分-靶点”网络构建根据靶点预测结果，利用String平台构建疾病-靶点蛋白相互作用关系，将结果导入Cytoscape3.6.0软件建立成分-靶点相互作用网络并进行网络分析（Networkanalyzer）。该网络由39个节点，45条边组成，拓扑学参数信息包括“接近中心度值（closeness）”“中介中心度值（betweenness）”“度值（degree）”。大部分化合物作用于多个靶点，而非仅仅通过一个靶点来发挥作用，如3-羟基香豆素（3-ABC1282023 年8月第29卷第8期August.2023 Vol.29 No.8Hydroxycoumarin）、7-羟基-8-甲氧基香豆素7-(ethylamino)-4,6-dimethylchromen-2-one、秦皮啶（Fraxidin）、伞形花内酯（Umbelliferone）等，度值（degree）均为5。（见表3）表 3“成分-靶点”网络拓扑学参数化 合 物接 近 中 心 度 值中 介 中 心 度 值等 级值3-羟基香豆素（3-Hydroxycoumarin）0.34782609 0.1584581457-羟基-8-甲氧基香豆素（7-Hydroxy-8-methoxycoumarin）0.34782609 0.097148624香豆素（Coumarin）0.23529412 0.000000001马钱子碱（Brucine）0.35555556 0.241973895伪马钱子碱（Pseudobrucine）0.25396825 0.066767473异欧前胡素（Isoimperatorin）0.23188406 0.023742322松柏醇（Coniferin）0.24615385 0.122983873伞形花内酯（Umbelliferone）0.39024390.419018825茵芋苷（Skimmin）0.41666667 0.000000001紫丁香苷（Syringin）0.24242424 0.062500002秦皮啶（Fraxidin）0.35555556 0.240500195胡萝卜苷（Daucosterol）0.83333333 0.9000000044,6-二甲基-7-乙基氨基香豆素0.35555556 0.159648625(7-(ethylamino)-4,6-dimethylchromen-2-one)3.4GO富集分析对消瘤藤的核心靶点可能存在的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）进行GO富集分析。其中0.05和错误发现率（FDR）4）的活性成分有7个，即3-羟基香豆素（degree=5）、马钱子碱（degree=5）、伞型花内酯（degree=5）、7-(ethylamino)-4,6-dimethylchromen-2-one（degree=5）、7-羟基-8-甲氧基香豆素（degree=4）、胡萝卜苷（degree=4）。节点度值排名靠前的主要以香豆素类为主。香豆素是一类具有苯骈琢-吡喃酮结构的化合物，可看作是顺式邻羟基桂皮酸脱水形成的内酯，绝大多数在C-7位有羟基或烃基。近年来，香豆素类化合物在抗肿瘤药物的研发方面展现出良好的应用前景。研究发现香豆素及其衍生物可抑制多种肿瘤细胞株的生长，并与多条转导通路有关21。GO生物学富集分析发现，消瘤藤的活性成分可影响蛋白激酶活性、细胞表面受体信号通路、蛋白质磷酸化、RNA聚合酶域启动子过程。这些生物学过程很可能涉及血瘀引起的子宫肌瘤的发病原因及治疗手段，同时消瘤藤可能通过改善这些生物学过程发挥其“散瘀、消肿”的作用。KEGG通路及“成分-靶点-通路”分析发现，消瘤藤活性成分潜在作用靶点在IGF1R、EGFR等生长因子的诱导因素中富集。近年来，有研究表明生长因子可以调节甾体激素在肿瘤细胞中的增殖和分化，并对雌激素诱导细胞的生长和分化以分泌的方式在组织局部起作用。子宫肌瘤发生的原因是生长因子的异常表达，肽类生长因子及其受体是肌瘤生长的调节因子22。胰岛素样生长因子1受体（insuline-like growth factors 1R，IGF1R）是小的单链多肽类因子，由70个氨基酸组成。动物实验证明IGF1R可在子宫肌细胞产生，且通过卵巢甾体激素控制其表达。IGF1R能促进正常子宫肌细胞和肌瘤的平滑肌细胞进行有丝分裂和分化。有研究表明，孕酮对子宫肌瘤的影响有双重性，一方面通过降低IGF1R抑制子宫肌瘤生长，另一方面表 6分子对接结果蛋白名称PDB编号化合物名称对接能/（kcal/mol）氨基酸胰岛素样生长因子1（IGF1R）2ZM33-羟基香豆素（3-Hydroxycoumarin）-5.47苯丙氨酸1259（PHE1259），络氨酸1161（TYR1161）磷脂酰肌醇-3-激酶（PIK3CA）4TV3松柏醇（Coniferin）-5.41络氨酸836（TYR836），丝氨酸629（SER629）表皮生长因子受体（EGFR）3G5Y3-羟基香豆素（3-Hydroxycoumarin）-4.63脯氨酸40（PRO40）表皮生长因子受体（EGFR）3G5Y伞形花内酯（Umbelliferone）-4.65色氨酸163（TRP163），赖氨酸142（LYS142），谷氨酸105（GLU105）1302023 年8月第29卷第8期August.2023 Vol.29 No.8则通过增加EGFR和Bcl-2来促进子宫平滑肌瘤生长。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）可刺激细胞增生并影响正常细胞及肿瘤细胞的分化。研究显示子宫肌瘤细胞EGF mRNA含量高于正常平滑肌，从而使离体子宫肌瘤细胞迅速生长23。上述消瘤藤“成分-靶点-通路”的网络信息及相关文献显示，消瘤藤可能通过调控蛋白多糖、黏附斑激酶、Rap1及Ras等多条信号通路发挥治疗子宫肌瘤的作用。研究发现，肿瘤的发生发展与蛋白多糖的过度激活密切相关24。蛋白多糖（Proteoglycans，PGs）是一种含有长而不分硫支共价结合重复二糖长链的糖蛋白，在细胞中和细胞外基质中含量丰富。近年来，蛋白多糖对生长因子信号的调控使glypican（及其他多聚糖）成为癌症治疗中极具吸引力的研究对象25，PGs通常在肿瘤血管生成中表现出促进或抑制肿瘤血管生成作用。综上所述，经HPLC-LTQ/Orbitrap-MS法及网络药理学技术分析发现，瑶药消瘤藤共有14个不同的活性成分通过对不同的靶点协同作用，起到“散瘀、消肿”的作用。研究结果对瑶药消瘤藤多成分、多靶点、协同作用的特点进行了一定程度上的解释，体现出其通过整体性、系统性来发挥治疗肿瘤作用的特点。本研究发现，消瘤藤可能从以下3个方面发挥“散瘀、消肿”作用治疗子宫肌瘤：（1）从消瘤藤“散瘀、消肿”的功能主治上探讨，其可通过改善血液流变学及血管正常化起到疏通经络、活血止痛、消肿抑瘤的作用。（2）通过调控IGF1R、EGFR等生长因子从而调节甾体激素在子宫肌瘤细胞中的增殖和分化。（3）通过调控蛋白多糖、黏附斑激酶、Rap1及Ras等多条信号通路发挥抗肿瘤作用。预测所得消瘤藤成分疾病靶点与已有文献较为接近，表明基于网络药理学与分子对接相结合的技术手段探讨其“散瘀、消肿”治疗子宫肌瘤的作用机制具有一定的准确性，同时也揭示了消瘤藤多成分、多靶点的特点，可为后续的相关研究提供参考。参考文献1 班秀文，班兆根.试论子宫肌瘤的治法J.中国医药学报，1995，10(4)：53-56.2 谭蕾，孟炜，张婷婷.子宫肌瘤发病的易患因素及化瘤方的疗效J.中国中西医结合杂志，2011，31(5)：635-638.3 魏建涛，张玮.益肾活血消癥方对子宫肌瘤肾虚血瘀证患者内分泌功能及血液流变学的影响J.现代中西医结合杂志，2018，27(17)：1882-1885.4 国家中医药管理局 中华本草 编委会.中华本草-9M.上海：上海科学技术出版社，1999：40-41.5 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