基于特征蛋白的僵蚕配方颗粒鉴定方法.pdf

Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med基于特征蛋白的僵蚕配方颗粒鉴定方法刘姣1，蒋超1，黄凯伟2，李洁1，赵玉洋1*，金艳1，张恬1，张辉2，袁媛1*1.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；2.华润三九现代中药制药有限公司，广东 深圳 518029摘要 目的：为保障临床用药的安全性和有效性，建立僵蚕配方颗粒的鉴定方法。方法：采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），分离不同加工方式的僵蚕样品蛋白，对提取方法、缓冲液 pH、料液比、反应温度、反应时间、专属性、适应性进行考察。同时利用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）分析寻找稳定且丰度较高的蛋白作为鉴定僵蚕配方颗粒的蛋白标志物。结果：SDS-PAGE 最佳提取条件为取僵蚕样品适量，按料液比 110 加入 0.1 mol L1 NaAc 缓冲液（pH=5），30 振荡提取 1.5 h。可分离出特征性条带约 4050 kDa，该条带主要为僵蚕基原动物家蚕 Bombyx mori Linnaeus 的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、抗糜蛋白和抗胰蛋白等，可作为僵蚕鉴别的蛋白标记。根据 SDS-PAGE 分析条带的相对分子质量大小、蛋白在僵蚕药材和提取物中的特异性和稳定性，确定 Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂为鉴定僵蚕配方颗粒的特异性蛋白。结论：基于差异蛋白建立了可用于僵蚕配方颗粒生成过程的质量控制、僵蚕配方颗粒的 SDS-PAGE 蛋白鉴定的指纹图谱方法。关键词 僵蚕配方颗粒；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；质量检测中图分类号 R286 文献标识码 A 文章编号 1673-4890（2023）08-1692-09 doi：10.13313/j.issn.16734890.20221115003Identification Method for Jiangcan Formula Granules Based on Characteristic ProteinsLIU Jiao1,JIANG Chao1,HUANG Kai-wei2,LI Jie1,ZHAO Yu-yang1*,JIN Yan1,ZHANG Tian1,ZHANG Hui2,YUAN Yuan1*1.National Resource Center for Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;2.China Resources Sanjiu Medical&Pharmaceutical Co.,Ltd.,Shenzhen 518029,ChinaAbstract Objective:To establish an identification method for Jiangcan Formula Granules to ensure the safety and effectiveness of the clinical medication.Methods:Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)was used to separate the proteins in different processed Jiangcan(Bombyx Batryticatus)samples,and the extraction method,pH of buffer solution,solid-to-liquid ratio,reaction temperature,reaction time,specificity,and adaptability were investigated.Meanwhile,liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)was used to find stable and abundant proteins as protein markers for identifying Jiangcan Formula Granules.Results:The optimal extraction conditions for SDS-PAGE were determined as follows.An appropriate amount of Jiangcan samples were added with 0.1 mol L1 NaAc buffer(pH 5)in a solid-to-liquid ratio of 1:10,shaken,and extracted for 1.5 h at 30 C.A characteristic band with a relative molecular mass of about 40-50 kDa was separated and was mainly composed of serine protease inhibitors,antitrypsin,and anti-chymotrypsin from Bombyx mori Linnaeus,which could be used as protein markers for identifying Jiangcan.According to the relative molecular mass,specificity,and stability of the bands analyzed by SDS-PAGE,serpins(serine protease 专题 基金项目 国家自然科学基金项目（81891013，81891010）；中央本级重大增减支项目（2060302）；中国中医科学院科技创新工程项目（CI2021A041）*通信作者 赵玉洋，助理研究员，研究方向：中药鉴定与分子生药学；Tel：[phone]，E-mail：袁媛，研究员，博士生导师，研究方向：中药鉴定与分子生药学；Tel：[phone]，E-mail：y_1692Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Medinhibitors)were determined as the specific proteins for identifying Jiangcan Formula Granules.Conclusion:established an SDS-PAGE protein fingerprint method based on differential proteins that can be used for quality control in the production of Jiangcan Formula Granules and for identifying Jiangcan Formula Granules.It can also provide a reference for establishing quality standards for other animal-based formula granules.Keywords Jiangcan Formula Granules;SDS-PAGE;quality detection僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕 Bombyx mori Linnaeus 45龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant 而致死的干燥体，味咸、辛，性平，归肝、肺、胃经，具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结等功效1。僵蚕配方颗粒是僵蚕饮片经炮制并按标准汤剂的主要质量指标加工制成的颗粒，其保持了僵蚕饮片的性味与功效，且不需煎煮、调配方便、使用可随证组方，临床用量大。由于动物药中小分子物质的种类远少于植物药且特异性差，导致多味动物药以同一小分子化合物为指标性成分缺乏专属性2-3。饮片加工成为配方颗粒后失去了形态、显微鉴别特征，为解决上述问题，已有研究者采用特异性聚合酶链式反应（PCR）4-5、DNA指纹图谱6等方法对配方颗粒进行鉴别。现有僵蚕配方颗粒、炒僵蚕配方颗粒、蜜麸炒僵蚕配方颗粒质量标准多采用薄层色谱法与对照药材进行对比、高效液相色谱法测量尿苷、鸟苷、尿嘧啶（贵州省中药配方颗粒质量标准（第十批）北京市中药配方颗粒标准（第二批）海南省中药配方颗粒质量标准（第二批）或芦丁、槲皮素、山柰酚、紫云英苷等7-9进行质量控制，缺乏专属性。在失去形态鉴别和显微特征的情况下，如何证明和表征僵蚕配方颗粒的原料基原为蚕蛾科昆虫家蚕是目前配方颗粒工业化生产的难题。动物药蛋白含量高且种类丰富，可筛选获得高特异性的标志蛋白用于专属性鉴别研究。近年来，已有大量报道将多肽、蛋白用于中药质量评价10-17。本研究拟通过液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对僵蚕配方颗粒特异性条带进行定性定量分析，寻找稳定且丰度较高的蛋白作为僵蚕配方颗粒的蛋白标志物，并建立十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析鉴别方法，此方法简单易行，不需特殊设备，可为规范僵蚕及其产品质量提供参考。参照本研究建立的SDS-PAGE蛋白指纹图谱方法，也可进一步建立僵蚕配方颗粒中白僵菌的鉴别方法及其他动物药材配方颗粒的真伪鉴别方法。1材料1.1仪器Mini-PROTEAN Tetra System 型 电 泳 槽、PowerPac 系列电泳仪均购于 Bio-Rad 公司；2100型扫描仪（UMAX公司）；Lynx 6000型冷冻离心机、Orbitrap Fusion Lumos组合式质谱仪、Ultimate 3000型 RSLC 纳升级高效液相色谱仪均购于 Thermo Fisher公司；BLY-200E型脱色摇床（博徕研科技有限公司）；5420型离心机（Eppendorf公司）。1.2试剂4%12%SurePAGE 蛋白预制胶（金斯瑞生物科技有限公司，批号：C35122205）；考马斯亮蓝G-250、MS 级 甲 酸（Sigma 公 司，批 号 分 别 为DY0432、94318-50ML-F）；溴酚蓝、硫脲、尿素、三氯乙酸（上海麦克林生化科技有限公司，批号分别为C12943636、C13661159、C13483667、C14121317）；冰乙酸、乙醇（西陇科学股份有限公司，批号分别为B2108161、B2111059）；丙酮（北京化工厂，批号：20190319）；LC-MS级水、乙腈、三氟乙酸（TFA）；吲哚乙酸（IAA）（Thermo Scientific公司，批号分别为W6-4、A996-4、85183、A39271）；Trypsin酶（Promega公司，批号：V5111）；二硫苏糖醇（DTT，Vetec 公司，批号：V900830-5G）；Blue Plus Protein Marker（北京全式金生物技术有限公司，批号：Q10531）。1.3样品18批僵蚕药材、18批僵蚕饮片、3批僵蚕提取物（批号：5220601Y5220603Y）、18批僵蚕标准汤剂 冻 干 粉（批 号 分 别 为 2103001Y2103015Y、220601Y220603Y）、6批僵蚕配方颗粒成品分别由华润三九医药股份有限公司、北京康仁堂药业有限公司、江阴天江药业有限公司、广东一方制药有限公司提供，样品信息见表 1。另采集了不同动物药材，共7种，用于检测建立鉴别方法的专属性。僵蚕药材和其他7种动物药经中国中医科学院中药资源1693Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med中心蒋超副研究员鉴定分别为家蚕、水蛭、鳖甲、紫河车、蛤蚧、土鳖虫、全蝎、海龙（尖海龙），样品保存于中国中医科学院中药资源中心。其他7种动物药样品信息见表2。以上海奈启生物科技有限公司生产的僵蚕对照药材为僵蚕配方颗粒阳性对照（批号：NQ1089-2205）。2方法2.1蛋白提取取适量僵蚕配方颗粒，研磨成粉末，取粉末0.1 g，加入 0.1 mol L1 乙酸钠溶液（pH=5）1 mL，30 振荡提取1.5 h，13 000 r min1离心10 min（离心半径为52.5 mm），取上清液置20 保存备用。取上清液450 L置2 mL离心管中，加入三氯乙酸50 L，混匀后10 000 r min1离心10 min（离心半径为31.1mm），弃上清液，沉淀中加丙酮300 L，混匀后10 000 r min1离心10 min（离心半径为31.1 mm），弃去上清液，沉淀用蛋白裂解液100 L（取尿素21.02 g、硫脲7.61 g，加水溶解并定容至50 mL）溶解。2.2SDS-PAGE取溶解液25 L至1个新的2 mL离心管中，再加入溴酚蓝指示液5 L并混合均匀，沸水浴处理10 min备用。分离胶体积分数为12%，加样后60 V恒压电泳至溴酚蓝指示液，距胶板底部边缘12 cm时结束电泳。凝胶片以考马斯亮蓝染色液处理45 min，弃去染色液，以脱色液处理至凝胶背景透明且条带清晰。取凝胶片在凝胶成像仪上检视，分析样品蛋白差异。2.3LC-MS/MS分析凝胶在扫描仪上扫描后，将 4050 kDa的条带用洁净的刀片切下放入离心管中，参照文献18方法将切下的条带进行胶内酶解除盐。样品使用Ultimate 3000 型 RSLC 纳升级高效液相色谱系统，采 用 Thermo Scientific PN 164535 Trap、Thermo Scientific PN 164941分析柱，参考文献15的方法进行液相及质谱参数设置。2.4质谱数据的蛋白数据库搜寻分析SEQUEST HT搜索引擎在数据库进行搜索和匹配。为了提高分析结果质量，降低假阳性率（FDR），采用Proteome Discoverer对检索结果进行过滤：可信度在 99%以上的肽段-谱图匹配（PSMs）为可信PSMs，至少包含1个unique肽段（特有肽段）的蛋白为可信蛋白，仅保留可信肽段和蛋白，并进行FDR验证，去除FDR1%的肽段和蛋白。表1僵蚕样品信息编号123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142品名僵蚕药材僵蚕饮片僵蚕配方颗粒批号210100121010022101003210100421010052101006210100721010082101009210101021010112101012210101321010142101015YC220429001YC220429002YC2204290032103001Y2103002Y2103003Y2103004Y2103005Y2103006Y2103007Y2103008Y2103009Y2103010Y2103011Y2103012Y2103013Y2103014Y2103015Y220601Y220602Y220603Y2207001Y2207002Y2207003Y产地四川省凉山州会东县四川省凉山州会东县四川省凉山州会东县云南省曲靖市师宗县云南省曲靖市师宗县云南省曲靖市师宗县广西壮族自治区河池市环江县广西壮族自治区河池市环江县广西壮族自治区河池市环江县山东省日照市莒县山东省日照市莒县山东省日照市莒县江苏省海安市江苏省海安市江苏省海安市广西壮族自治区河池市环江县广西壮族自治区河池市环江县广西壮族自治区河池市环江县四川省凉山州会东县四川省凉山州会东县四川省凉山州会东县云南省曲靖市师宗县云南省曲靖市师宗县云南省曲靖市师宗县广西壮族自治区河池市环江县广西壮族自治区河池市环江县广西壮族自治区河池市环江县山东省日照市莒县山东省日照市莒县山东省日照市莒县江苏省海安市江苏省海安市江苏省海安市广西壮族自治区河池市环江县广西壮族自治区河池市环江县广西壮族自治区河池市环江县华润三九医药股份有限公司华润三九医药股份有限公司华润三九医药股份有限公司北京康仁堂药业有限公司江阴天江药业有限公司广东一方制药有限公司1694Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med3结果与分析3.1SDS-PAGE鉴定条件的确定与耐用性考察3.1.1提取溶剂为选出同时适宜僵蚕药材、标准汤剂冻干粉、配方颗粒的蛋白提取方法，对0.1 mol L1乙酸钠缓冲液（pH=5）、0.1 mol L1 Tris-HCl缓冲液（pH=9）、ddH2O不同提取溶剂的蛋白提取效果进行对比。结果显示，药材均有明显条带，标准汤剂冻干粉条带丰度较低，配方颗粒样品条带不清晰，僵蚕药材、标准汤剂冻干粉、配方颗粒的共有条带为 4050 kDa；相比其他 2 种溶剂，0.1 mol L1乙酸钠缓冲液（pH=5）提取的僵蚕药材、标准汤剂冻干粉、配方颗粒成品均能产生清晰可辨的条带。因此选择 0.1 mol L1乙酸钠缓冲液（pH=5）作为溶剂（图1）。3.1.2缓冲液pH使用不同pH缓冲液对僵蚕蛋白进行提取，分别设置缓冲液pH为4、5、6。结果表明，缓冲液pH为46时，僵蚕药材、饮片、标准汤剂冻干粉、提取物、配方颗粒均能出现目的条带；当缓冲液pH=5时，僵蚕各样品的目的条带比缓冲液pH=4条件下更清晰，比缓冲液pH=6条件下的提取分离效果更好，因此，选择缓冲液pH=5（图2）。3.2料液比分别对料液比110、120、140进行考察，结果表明，当料液比为110时，僵蚕各样品的目的条带比其他条件下的更清晰且丰度最高，因此选择料液比110为蛋白提取溶剂的最适料液比（图3）。3.3振荡温度采用不同振荡温度对僵蚕蛋白进行提取，分别设置温度为30、40、50、60。结果表明，随着温度的提高样品条带亮度逐渐变弱。当振荡温度为30 时，僵蚕各样品的目的条带比其他条件下的更清晰且丰 度 更 高，因 此 选 择 僵 蚕 蛋 白 提 取 温 度 为30（图4）。3.4振荡时间分别选用1.5、3.0、6.0、12.0 h对僵蚕蛋白进行提取，结果表明经1.512.0 h缓冲液振荡提取均能获得目标蛋白，且条带清晰。考虑实验操作的便捷性，选择振荡1.5 h作为提取时间（图5）。3.5上样量对已制备完成的蛋白电泳样品，分别取样品2、4、8、16 L进行上样，结果表明，样品上样量为注：M.Blue Plus Protein Marker；B.空白对照（以ddH2O为模板）；1.药材；2.标准汤剂冻干粉；3.饮片；4.提取物；5.配方颗粒；图3图6同。图2缓冲液pH对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响表2其他动物药样品信息编号1234567名称水蛭鳖甲紫河车蛤蚧土鳖虫全蝎海龙（尖海龙）采集号/批号201808250932018051502120180618001121587-201201121533-201303121044-201104121485-200501来源亳州药材市场亳州药材市场亳州药材市场中国食品药品检定研究院中国食品药品检定研究院中国食品药品检定研究院中国药品生物制药检定所注：M.Blue Plus Protein Marker；B.空白对照（以 ddH2O 为模板）；1.配方颗粒；2.药材；3.标准汤剂冻干粉。图1提取溶剂种类对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响1695Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med216 L，均能呈现较清晰的条带；当上样量为4 L时各泳道样品条带清晰且互不影响，因此选择4 L为样品上样量（图6）。3.6专属性根据以上结果，确定僵蚕配方颗粒蛋白提取的条件为取适量僵蚕对照药材样品，按料液比110加入0.1 mol L1 乙酸钠缓冲液（pH=5），30 振荡提取1.5 h，电泳样品上样量为4 L。使用该方法对僵蚕对照药材及其混伪品进行鉴定，僵蚕对照药材能扩增出特异性条带，混伪品均无条带，表明所建立的僵蚕配方颗粒SDS-PAGE鉴别方法具有很好的专属性（图7）。图3料液比对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响图4振荡温度对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响图5振荡时间对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响图6上样量对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响1696Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med3.7适用性使用该方法对18批僵蚕药材、18批僵蚕饮片、18批配方颗粒标准汤剂、3批提取物和3批配方颗粒进行鉴别，以验证方法的适用性。结果表明，所有样本蛋白供试品与僵蚕对照药材的电泳图谱在4050 kDa相应的位置上均有1条蛋白条带（图8）。3.8僵蚕特征蛋白的分析鉴定对4050 kDa目标条带进行蛋白提取及酶解，并利用LC-MS/MS对回收产物进行鉴定（图9），使用注：M.Blue Plus Protein Marker；B.空白对照（以ddH2O为模板）；1.僵蚕对照药材；2.蛤蚧；3.紫河车；4.土鳖虫；5.水蛭；6.全蝎；7.鳖甲；8.海龙。图7使用僵蚕配方颗粒鉴别方法鉴别僵蚕混伪品注：M.Blue Plus Protein Marker；B.空白对照（以ddH2O为模板）；S.僵蚕对照药材；118.僵蚕药材；1936.僵蚕饮片；3754.僵蚕标准汤剂冻干粉；5557.僵蚕提取物；5863.僵蚕配方颗粒。图8僵蚕配方颗粒适用性考察1697Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin MedUniProt中 Beauveria bassiana 和 Bombyx mori的蛋白组作为参考数据库。结果表明该产物中含有僵蚕基原动物家蚕的抗糜蛋白酶、抗胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂丝蛋白、丝胶等，相对定量值排名前10的蛋白见表3，其中主要成分Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制蛋 白、抗 糜 蛋 白 和 抗 胰 蛋 白 总 量 约 占 7.58%、36.98%、9.63%，3 类 蛋 白 占 该 条 带 总 蛋 白 的54.20%，可代表该鉴别条带。Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂作为僵蚕的特异性蛋白在僵蚕药材和提取物中含量较稳定，可作为僵蚕鉴别的蛋白标记。4结语中华人民共和国药典2020年版（一部）共收载了51味动物药，多采用显微鉴别、化学鉴别和含量测定方法进行质量控制19。当前僵蚕鉴定研究主要针对药材2-4,20-21，对于经加工处理后的僵蚕制品，如提取物、配方颗粒等仍缺少准确、简便、快速的鉴定方法。本研究通过 SDS-PAGE，优化了蛋白提取条件，筛选适合的缓冲液pH、料液比、提取温度、振荡时间，用于分离不同加工方式僵蚕样品的蛋白。在此基础上，建立了僵蚕配方颗粒SDS-PAGE鉴别方法，并对其鉴别专属性及适应性进行了分析。同时利用LC-MS/MS分析对僵蚕配方颗粒的蛋白标志物进行筛选。SDS-PAGE分离出的僵蚕配方颗粒特征性条带为4050 kDa，该条带主要含有僵蚕基原动物家蚕的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、抗糜蛋白和抗胰蛋白，其可作为僵蚕鉴别的蛋白标记。利用LC-MS/MS分析结果也可进一步区分家蚕和感染白僵菌的家蚕。注：A.僵蚕提取物样品总离子流色谱图；B.僵蚕药材样品总离子流色谱图；C.特异性蛋白的定性肽段的二级质谱图。图9僵蚕样品总离子流色谱图及定性肽段二级质谱1698Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂在动植物及微生物体内广泛存在，根据其序列同源性和作用机制可将其分为经典类、非经典类、Serpin类22，在植物、动物、微生物中其氨基酸长度、序列和结构存在一定差别23-26，可作为物种鉴别的标记。结合SDS-PAGE分析条带的相对分子质量大小、特征性蛋白在僵蚕药材和提取物中的特异性和稳定程度，可将丝氨酸蛋白酶抑制蛋白 Serpin-2作为僵蚕配方颗粒的特异性蛋白。采用所建立的SDS-PAGE对多批僵蚕药材、提取物、配方颗粒等进行检验，结果显示，所检测的63批样品电泳谱图均在4050 kDa出现特异性条带，表明本研究建立的僵蚕SDS-PAGE鉴别方法对药材、提取物、配方颗粒均具有良好的适用性，可为僵蚕药材及相关加工品检测提供新的方法，可为完善僵蚕质量控制体系、保障临床应用提供参考。参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部 M.北京：中国医药科技出版社，2020：392.2 CHEN P，LI W，LI Q，et al.Identification and quantification of nucleosides and nucleobases in geosaurus and leech by hydrophilic-interaction chromatography J.Talanta，2011，85（3）：1634-16413 徐莹，陈晨，沈玉萍，等.动物药鉴定的研究现状与对策探讨 J.中草药，2014，45（4）：578-5814 胡力，赵玉洋，袁媛，等.地龙（参环毛蚓）配方颗粒的位点特异性PCR鉴别 J.中国实验方剂学杂志，2022，28（17）：119-1265 赵玉洋，秦雯，李源森芋，等.紫河车饮片干浸膏粉及配方颗粒的位点特异性 PCR 鉴别 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bassiana蛋白编码H9IXK0C7ASM9Q03383P80034H9JKA2Q9NGS0P07856H9JDX3Q17240A0A2S7YH86相对分子质量/kDa41.943.444.541.437.741.7119.438.7123.335.6蛋白名称Antichymotrypsin-1Antitrypsin isoform 1Antichymotrypsin-1Antichymotrypsin-2Antichymotrypsin-2Serpin-2Sericin 1SERPIN domain-containing proteinSericin1BTransaldolase僵蚕药材相对定量值/%70.968.462.087.179.638.82.436.669.9198.5僵蚕提取物相对定量值/%129.1131.6138.0112.9120.4161.2197.6163.4130.11.51699Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Medcharacterization of the phosphoproteome of gastric cancer from endoscopic biopsy specimens J.Theranostics，2020，10（5）：2115-212919 边学峰，李晶峰，金力群，等.对2020年版 中国药典中动物药质量标准的商榷 J.吉林中医药，2021，41（6）：809-81620 闻崇炜，刘莹，张林松，等.一种适用于发现僵蚕药材差异蛋白质的简便方法：CN113138224A P.2021-07-2021 黄佳滢，刘莹，徐悦，等.僵蚕药材酸溶性蛋白质的分 离 提 取 及 鉴 定J.生 物 资 源，2021，43（1）：57-63 22 赵萍.家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂研究 D.重庆：西南大学，200823 HELLINGER R，GRUBER C W.Peptide-based protease inhibitors from plants J.Drug Discov Today，2019，24（9）：1877-188924 HARISH B S，UPPULURI K B.Microbial serine protease 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