基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫MIC3抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 6 期2023 年 6 月Vol.45，No.6Jun.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211011基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫 MIC3 抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估张韧哲，孙倩，李婉婧，黄欣怡，张儒新，曾欢，郑亚东，宋厚辉，王璞*，程昌勇*(浙江农林大学 动物科技学院动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室，浙江 杭州 311300)摘要：本实验室前期构建的基于毒力基因改造的减毒单增李斯特菌(LM-1)被证实是一种较为安全的疫苗载体。为构建表达鸡柔嫩艾美耳球虫()毒力蛋白MIC3的重组减毒单增李斯特菌(LM)疫苗候选株并评估其对雏鸡的免疫保护效果，本研究在LM-1基础上采用同源重组的方法将MIC3蛋白关键功能区(aa159aa252)编码基因(475 bp756 bp)定点整合至LM-1基因组中，并与LM溶血素O(LLO，其编码基因为)融合表达获得重组LM-1-MIC3菌株并经PCR鉴定；western blot检测LM-1-MIC3中MIC3和LLO的表达；测定细菌体外生长曲线检测LM-1-MIC3的体外生长能力；将野生菌株EGO-e、LM-1、LM-1-MIC3分别感染雏鸡72 h和144 h后，分别剖杀，取各组雏鸡肝脏和脾脏，经菌落计数对雏鸡肝脾载菌量进行测定并评估LM-1-MIC3在雏鸡体内的增殖能力；将野生株EGD-e、LM-1和LM-1-MIC3感染雏鸡并结合临床症状及致死率评估LM-1-MIC3对雏鸡的安全性；将LM-1-MIC3免疫雏鸡并建立感染模型，研究其对雏鸡抗球虫感染的免疫保护效果。PCR鉴定结果显示正确构建重组菌株LM-1-MIC3；western blot结果显示LM-1-MIC3分泌的融合蛋白LLO-MIC3能够在培养上清液中大量表达；细菌体外培养结果显示LM-1-MIC3体外生长能力与EGD-e和LM-1无显著差异，表明融合LLO的MIC3不会影响LM-1的生长；雏鸡肝脾载菌量测定结果显示，与EGD-e组相比，各时间段LM-1-MIC3组雏鸡肝脾载菌量均极显著降低(0.01)，感染LM-1-MIC3后雏鸡均存活且无明显临床症状，表明LM-1-MIC3对雏鸡致病力高度减弱，可以作为减毒疫苗载体；免疫保护试验结果显示在攻虫10 d后，LM-1-MIC3免疫组雏鸡的存活率高于LM-1免疫组及PBS对照组，且该组鸡无明显临床症状，剖杀后盲肠病变评分极显著低于LM-1和PBS组(0.001)，表明LM-1-MIC3对雏鸡有良好的免疫保护效果。本研究构建了重组减毒株LM-1-MIC3，并证实该重组菌对雏鸡具有较好的免疫保护效果，为减毒LM载体疫苗在防控重要动物传染病中的研究与应用奠定了科学基础。关键词：柔嫩艾美耳球虫；减毒单增李斯特菌；疫苗；免疫预防中图分类号：S852.6文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)06-0628-07Immunoprotective evaluation of an attenuated-basedvaccine bydelivering the MIC3 antigenZHANG Ren-zhe,SUN Qian,LI Wan-jing,HUANG Xin-yi,ZHANG Ru-xin,ZENG Huan,ZHENG Ya-dong,SONG Hou-hui,WANG Pu*,CHENG Chang-yong*收稿日期：2022-11-07基金项目：浙江省自然科学基金面上项目(LY22C180001)；浙江农林大学大学生创新创业训练项目(DKDY2022008、DKDY2022005)；浙江农林大学校级学生科研训练项目(S202210341063)作者简介：张韧哲(1997-)，男，湖南醴陵人，硕士研究生，主要从事预防兽医学方向研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding author(College of Animal Science and Technology&College of Veterinary Medicine,Zhejiang A&F University,Key Laboratory ofApplied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province,Zhejiang Provincial Engineering Research Center forAnimal Health Diagnostics&Advanced Technology,Zhejiang International Science and Technology Cooperation Base for Veterinary Medicineand Health Management,China-Australia Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics,Hangzhou 311300,China)Abstract:Attenuated(LM-1)based on the virulence gene modification constructed in our laboratoryhas been proved to be a relatively safe vaccine vector.To construct a recombinant attenuatedvaccine candidate strainexpressing the invasive virulence protein MIC3 of(),and evaluate its immune-protective effect on chicks.In this study,homologous recombination was used to integrate the MIC3 protein key function region(aa159-aa252)coding gene(476bp-756bp)into the genome of LM-1,and then merge the genes LLO and MIC3 to obtain the recombinant attenuatedLM-1-MIC3 strain.the fusion expression of MIC3 and LLO in LM-1-MIC3 strain were detected by western blot.The growthcurves of bacteriawas measured to detect the growth ability of LM-1-MIC3.The proliferation ability of LM-1-MIC3 inchicken was evaluated by detecting the bacterial load in liver and spleen.The safety of infected wild strains EGD-e,LM-1 andLM-1-MIC3 was evaluated in combination with clinical symptoms and mortality of chicken.The mild strains EGD-e,LM-1 andLM-1-MIC3 infected chicks for 72 hours and 144 hours,respectively.The chicks were slaughtered and the livers and spleens wereremoved from each group.The protective effect of LM-1-MIC3 againstinfection was detected by oral immunization ofchicken with LM-1-MIC3.The result of PCR showed that the LM-1-MIC3 strain was successfully constructed.Western blot resultsshowed that LLO-MIC3,a fusion protein secreted by LM-1-MIC3,was highly expressed in the culture supernatant.The result ofculture showed that the growth curve of LM-1-MIC3 was consistent with that of wild type of LM EGD-e and LM-1,indicating that MIC3 did not affect the growth of LM-1.The bacterial load in liver and spleen of chicken after LM-1-MIC3infection was significantly decreased compared with that after EGD-e infection(0.01).The chicken infected with LM-1-MIC3 allsurvived and showed no obvious clinical symptoms,indicating that LM-1-MIC3 has a highly weakened pathogenicity to chicks,andcan be used as a attenuated vaccine carrier.The survival rate of chicken 10 days after LM-1-MIC3 immunized chicken was higherthan LM-1 and PBS immunized with no obvious clinical symptoms,and after LM-1-MIC3 immunized cecal lesion value wassignificantly lower than that of LM-1 and PBS immunized(0.001),which indicated that oral immunization of chicken withLM-1-MIC3 showed significant protection againstinfection.In conclusion,the recombinant attenuated LM-1-MIC3 wasconstructed,and showed a promising immune protection effect againstinfection,which laid a scientific foundation for thefuture development and application of attenuated-based vaccines in the prevention and control of importantanimal infectious diseases.Key words:;attenuated;vaccine;immuno-protection鸡球虫病严重危害养禽业，目前国内外通常采用抗球虫药控制球虫感染，但抗球虫药的残留问题难以得到解决，且新药研发成本高、研发周期长，限制了抗球虫药的应用1-2。目前球虫疫苗是替代药物防治球虫病的有效措施，随着DNA重组技术的发展和应用，细菌活载体疫苗的研制日益成为防治球虫病的研究热点3-4。有报道称，雏鸡注射鸡柔嫩艾美 耳 球 虫()ADF 基 因 重 组 卡 介 苗pMV261-ADF和pMV361-ADF后，对的抵抗力稍有增强5-6。雏鸡口服表达5401重组蛋白的减毒鼠伤寒沙门菌后，体内淋巴细胞增殖水平上升，并产生了球虫抗体7。表达MIC3和AMAI蛋白的减毒沙门氏菌活载体疫苗能够对球虫的感染提供一定的抵抗作用8。减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的艾美耳球虫DNA疫苗能够提高雏鸡免疫应答水平从而产生一定的免疫效果9。但目前并无抗的对雏鸡有较强免疫保护效果的减毒细菌疫苗。单增李斯特菌(，LM)是一种革兰阳性胞内寄生菌，该菌可以引起人和动物的脑膜炎、败血症等10。LM被细胞吞噬后，在吞噬体内LM分泌毒力因子溶血素(LLO)，进而逃逸至细胞胞浆，因此LM能够诱导宿主强烈的CD8+T细胞免疫和CD4+T细胞免疫应答11-12。因此LM具有作为疫苗张韧哲，等.基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫 MIC3 抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估第 6 期629载体递呈抗原的潜力13-14。目前，以重组LM作为疫苗载体递呈病毒或肿瘤抗原已被广泛研究，如流感病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、人类乳 头瘤 病毒 HPV-16 E7、人类 免疫 缺陷病 毒 HIVgag、酪氨酸酶相关蛋白(Trp2)、前列腺特异性抗原(PSA)、HER-2/neu等15-16。此外，LM-LLO-E7目前已被应用于临床试验，实验中接受重组减毒LM疫苗的患者体内产生了较强的特异性免疫应答，存活时间高于未接受疫苗的患者，以上研究显示重组减毒LM具有很好的应用前景17。本实验室前期构建了重组减毒LM株LM-1，发现其表达的LLO突变体蛋白几乎无溶血活性，且其在小鼠模型中的致病力显著低于野毒菌株EGD-e。本研究利用同源重组的方法将MIC3关键抗原功能区(aa159aa252)编码基因整合至LM-1的(LLO编码基因)基因下游并克隆至穿梭载体pKSV7中构建重组质粒，并转化LM-1感受态细胞，通过42 和氯霉素筛选获得表达LLO-MIC3融合蛋白的重组减毒LM，饲喂雏鸡后对其免疫保护效果进行评价，为预防提供新思路。1材料与方法1.1主要实验材料LM野生株EGD-e、大肠杆菌DH5琢感受态细胞、LM-1(本实验室前期构建的毒力基因改造的LM)、LM-1基因组、LM-1感受态细胞、温敏穿梭载体pKSV7均由本实验室保存；雏鸡购自杭州萧山东海养殖有限责任公司；BHI培养基购自Oxoid公司(英国)；羊LLO多抗为本实验室自制；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；氯霉素、SDS、三氯乙酸、DAB缓冲液、包涵体蛋白提取试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限公司；羊抗兔IgG购自爱必信上海生物科技有限公司；HiScriptRIII RT SuperMix for qPCR、FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。1.2引物的设计与合成从NCBI数据库下载LMLLO编码基因序列(987033)、基因序列(KM018021)，利用Snapgene软件在基因C端500 bp和下游500 bp处分别设计引物TYB-A-a/b和TYB-B-a/b，以扩增基因上下游同源臂片段A和B。同时在基因两端设计引物MIC3-F/R，以扩增获得MIC3关键功能区aa159aa252编码基因(475 bp756 bp)片段(MIC3aa159aa252)。在上游同源臂片段A的上游80 bp处设计引物A-front，作为重组菌株的遗传标记。另合成pKSV7通用引物pKSV7-fwd/rev，作为pKSV7质粒丢失的遗传标记。以上引物均由擎科生物科技有限公司合成(表1)。1.3重组质粒的构建与鉴定以LM-1基因组为模板，TYB-A-a/b和TYB-B-a/b为引物进行PCR扩增，以获得基因上游同源臂片段A和下游同源臂片段B；利用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation KitV2提取子孢子RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，MIC3-F/R为引物进行PCR扩增，以获得片段；经重叠延伸PCR将上游同源臂片段A和下游同源臂片段B与MIC3片段融合，并克隆于质粒pKSV7中，转化至大肠杆菌DH5琢感受态细胞中，提取质粒，由北京擎科生物科技股份有限公司测序鉴定正确后的重组质粒命名为pSL1690(图1)。1.4重 组 菌 株 LM-1-MIC3 的 筛 选 与 鉴 定将pSL1690电转化LM-1感受态细胞中，并涂布于含有氯霉素的BHI固体培养基上(pKSV7载体中含氯霉素抗性基因)，于42 同源重组。对生长的菌落连续表 1引物信息引物名称Primer namesTYB-A-aTYB-A-bTYB-B-aTYB-B-bMIC3-FMIC3-RA-frontpKSV7-fwdpKSV7-rev引物序列(5-3)Primer sequencesCCAAGCTTGCATGCCGGAGACTTACGCGATATTTTGAAAAAAGGCCCTGTCCAGCCGCCGGAGCCGCCTAAGCTAATTGTAAAAGTAATAAAAAATTAAGAATAAAACCGCTTAACACACACACATGATTACGAATTAAATCTTTTGCTTCGCAGGAATCTGGCGGCGGCTGGACAGGAAGTGCGCACAGTTTTACAATTAGCTTTTGTCGCTGTCAATGACCTCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACAGCGGATAACAATTTCACACAGGA用途Application扩增基因上游同源臂Amplify the uphomoarm of hly gene扩增基因下游同源臂Amplify the downhomoarm of hly gene扩增基因Amplify thegene鉴定重组菌株Verify the recombinantstrain图1重组质粒的构建策略(aa159-aa252)(aa159-aa252)LM-1LM-1-MIC3Homologous recombinationABABpSL1690中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年630传代后，挑选单菌落，分别以A-front/TYB-B-b和pKSV7-fwd/rev为引物进行PCR鉴定，阳性菌送测序；将鉴定正确的阳性菌涂布于无抗BHI固体培养基上，于30 对同源重组的pKSV7质粒进行丢失(pKSV7温敏质粒30 传代过程中从LM中丢失)。对生长的菌落连续传代后，挑选单菌落，以A-front/TYB-B-b为引物进行PCR鉴定，核酸电泳出现目的条带。以pKSV7-fwd/rev为引物进行PCR鉴定，电泳后无融合片段(A+B+MIC3)条带则表明质粒已丢失，完成重组菌株LM-1-MIC3的筛选与鉴定。1.5重组蛋白LLO-MIC3表达的western blot的鉴定取LM-1-MIC3单菌落接种于5 mL BHI培养基中，37 振荡培养过夜。以1颐100的比例接种于200 mL BHI培养基中，37 振荡培养8 h。取培养上清液以1颐10的比例加入三氯乙酸沉淀分泌蛋白，冰浴过夜，用1 mLDAB缓冲液重悬沉淀，获得分泌蛋白；将LM-1-MIC3菌液离心后的沉淀加入1 mL LM裂解液(100 mLddH2O中加入2 mL Triton X-100，1 g SDS，终浓度为100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/LEDTA)重悬，超声破碎后上清即为胞质蛋白。利用BCA试剂盒测定各蛋白浓度，用PBS将两种表达形式的LLO-MIC重组蛋白调整至相同浓度。以羊LLO多抗(1颐500)为一抗，羊抗兔IgG(1颐10 000)为二抗，对重组蛋白LLO-MIC进行western blot检测。1.6重组菌株 LM-1-MIC3生 长曲 线的测 定将EGD-e、LM-1及LM-1-MIC3菌株37 振荡培养过夜。每隔1 h取样测定OD600nm值，连续检测12 h，利用Graph-pad Prism软件绘制各菌株生长曲线。1.7重组菌株LM-1-MIC3感染雏鸡后的肝脾载菌量测定PBS重悬EGD-e、LM-1、LM-1-MIC3菌液，调整浓度为109cfu/mL。取10日龄雏鸡分为4组，每组10只，分别口服上述3种菌株和PBS(对照组)，1 mL/只，其中每组5只感染72 h，5只感染144 h，感染结束后剖杀雏鸡，并在无菌环境下摘取肝脏和脾脏(若中途死亡则立即剖检雏鸡取样)破碎匀浆，10倍倍比稀释(101105)后将其涂布于无抗BHI平板上，37 静置培养过夜，进行菌落计数，结果表示为log10cfu，各菌株感染后肝脾载菌量均值利用 检验进行分析。动物试验均在甲醛熏蒸后洁净的动物房进行。1.8重组菌株LM-1-MIC3对雏鸡的致病性试验取10日龄雏鸡分为3组，每组10只，分别口服接种EGD-e、LM-1、LM-1-MIC3菌液(109cfu/mL)，1 mL/只。观察其临床表现，每隔12 h记录雏鸡的临床症状及死亡情况，分析重组菌株LM-1-MIC3对雏鸡的致病性。1.9重组菌株LM-1-MIC3免疫后对雏鸡抗感染的免疫保护效果通过本实验室前期预试验已知，雏鸡首次免疫LM-1-MIC3 7 d后达到一免血清IgG抗体效价峰值(1颐3 200)，首免7 d后二次免疫，7 d达到二免血清IgG抗体效价峰值(1颐51 200)，且高抗体水平可维持14 d，此外主要感染20日龄以内的雏鸡。因此，本研究取5日龄雏鸡分为3组，每组10只，分别口服LM-1、LM-1-MIC3以及PBS，首次免疫7 d后二免。二免7 d后每只鸡口服接种5伊105个卵囊，攻虫10 d后计算并观察雏鸡的存活率和临床表现，剖杀取盲肠观察病变并计算病变值。病变值计算方法如下，0分：无明显病变；1分：盲肠壁有少量瘀点，肠壁不增厚，内容物正常；2分：盲肠内容物明显带血，肠壁稍增厚；3分：盲肠明显肿大且出血；若雏鸡攻虫10 d内死亡记4分。2结果2.1重组菌株LM-1-MIC3的鉴定结果以LM-1基因组为模板，TYB-A-a/b和TYB-B-a/b为引物PCR扩增获得536 bp的基因的上游同源臂片段A和522 bp的下游同源臂片段B；以cDNA为模板，MIC3-F/R为引物PCR扩增获得302 bp的片段，通过重叠延伸PCR将A、B和片段融合，并连接至质粒pKSV7中，经测序鉴定正确构建重组质粒pSL1690。将重组质粒电转入LM-1感受态细胞后，于氯霉素抗性和42 进行同源重组，传10代后，以A-front/TYB-B-b为引物 进行 菌 落 PCR 鉴 定，得 到1 395 bp的片段(图2A)，以pKSV7-fwd/rev为引物对菌落进行PCR鉴定，得到1 409 bp的片段(图2B)，表明此时已完成同源重组。挑取无抗BHI培养基上的阳性菌落在30 继续传10代后，以A-front/TYB-B-b为引物进行菌落PCR鉴定，得到1 395 bp的片段，以pKSV7-fwd/rev为引物对菌落进行PCR鉴定，与传代前相比缺失了1 409 bp融合片段(图2C)，表明此时pKSV7质粒已丢失，且正确构建重组菌株LM-1-MIC3。张韧哲，等.基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫 MIC3 抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估第 6 期6312.2重组蛋白LLO-MIC3表达的western blot鉴定结果将获得的LM-1-MIC3的分泌蛋白、胞质蛋白后，通过western blot鉴定上述重组蛋白LLO-MIC3的表达。结果显示，分泌蛋白和胞质蛋白均在预期大小90 ku(LLO约为78 ku，MIC3aa159aa252约为12 ku)处有特异性条带，且分泌蛋白条带更为明显(图3)，表明LM溶血素LLO能与MIC3融合表达且分泌于细菌培养上清液中。2.3重组菌株LM-1-MIC3生长曲线的测定结果各菌株生长曲线测定结果显示，LM-1、LM-1-MIC3与EGD-e的生长趋势基本一致无明显差异(图4)，表明重组减毒菌株LM-1基因组与抗原片段MIC3的融合不会影响其体外生长能力。2.4重组菌株LM-1-MIC3感染雏鸡后的肝脾载菌量测定结果各菌株感染雏鸡后的肝脾载菌量测定结果显示，雏鸡在感染LM-1及LM-1-MIC3 72 h和144 h之后，肝脾载菌量均极显著低于感染EGD-e的雏鸡(0.01)(图5)，PBS组仅检测到少量杂菌，图中未展示，表明LM-1-MIC3在雏鸡脏器内的增殖能力极显著低于EGD-e(0.01)。2.5重组菌株LM-1-MIC3对雏鸡致病性试验结果观察并计算EGD-e、LM-1及LM-1-MIC3感染雏鸡的发病和死亡率。结果显示，雏鸡感染EGD-e 96 h内全部死亡，期间有精神沉郁、食欲废绝、被毛凌乱等临床症状，而雏鸡感染LM-1-MIC3和LM-1后96 h内未出现死亡(图6)，且无明显临床症状。表明LM-1-MIC3对雏鸡的致病性很弱，安全性较好。M：DNA Marker；1：质粒丢失前的菌株(A-front/TYB-B-b为引物)；2：质粒丢失前的菌株(pKSV7-fwd/rev为引物)；3：重组菌株LM-1-MIC3(A-front/TYB-B-b为引物)；4：重组菌株LM-1-MIC3(pKSV7-fwd/rev为引物)；N：阴性对照M:DNA Marker;1:Strain before plasmid loss(A-front/TYB-B-b asprimers);2:Strain before plasmid loss(pKSV7-fwd/rev as primers);3:LM-1-MIC3(A-front/TYB-B-b as primers);4:LM-1-MIC3(pKSV7-fwd/rev as primers);N:Negative control图2重组菌株LM-1-MIC3的PCR鉴定结果1500bp1000bp750bp500bp1500bp1000bp750bp500bp1395bp1409bpM1NM2NAB1500bp1000bp750bp500bpM34N1395bpC1：胞质蛋白；2：分泌蛋白1:Cytoplasmic protein;2:Secretory protein图3LLO-MIC3表达的western blot鉴定结果90ku78ku12图4EGD-e、LM-1和LM-1-MIC3的生长曲线1.51.00.50EGD-eLM-1LM-1-MIC3Time(hours)151050*:0.01，*:0.001.The same as below.图5EGD-e、LM-1及LM-1-MIC3感染后72 h(A)和144 h(B)雏鸡肝脾载菌量的检测结果86420SpleenLiverA1086420SpleenLiverB中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年632图6雏鸡感染EGD-e、LM-1及LM-1-MIC3后96 h内的存活曲线ABA：各组雏鸡存活率；B：各组雏鸡盲肠外观病变A:Survival rates of chicken in groups LM-1-MIC3,LM-1 and PBS;B:Cosmetic cecal lesions of chicken in groups LM-1-MIC3,LM-1 and PBS图7LM-1-MIC3对雏鸡的攻毒免疫保护效果评估组别GroupPBSLM-1LM-1-MIC30 分0 points0071 分1 point0012 分2 points0203 分3 points5404 分4 points542张韧哲，等.基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫 MIC3 抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估第 6 期633LM-1LM-1-MIC3EGD-eHours post infection1005001005002.6重组菌株LM-1-MIC3对雏鸡抗感染的免疫保护效果对雏鸡2免后14 d攻虫。结果显示攻虫10 d后，LM-1-MIC3免疫组、LM-1免疫组和PBS组雏鸡存活率分别为80%、60%和50%(图7A)。LM-1-MIC3免疫组鸡无明显临床表现，剖杀后取盲肠无明显病变，PBS组和LM-1免疫组鸡出现精神沉郁、食欲减退、震颤等临床症状，剖杀后盲肠出血、肿大(图7B)。比较各组病变评分(表2)，结果显示LM-1-MIC3免疫组雏鸡盲肠评分极显著低于PBS组和LM-1免疫组的评分(0.001)(图8)。综上所述表明，LM-1-MIC3对雏鸡有较强的抗感染的免疫保护效果。3讨论减毒LM是一种胞内菌，能够诱导宿主强烈的CD8+T及CD4+T细胞免疫应答，产生大量的IFN-酌、IL-18、IL-12等细胞因子，因此具有很好的疫苗佐剂效应17-18。目前市售疫苗主要为活疫苗，存在毒力返强的风险，因此研制更为安全的重组疫苗势在必行。在本研究中，参考其它减毒LM疫苗的构建方法，利用同源重组法构建分泌LLO-MIC3融合蛋白的重组菌株LM-1-MIC3，为后续重组减毒菌株发挥抗球虫作用奠定重要基础19。生长曲线测定结果显示LM-1-MIC3和野生株的生长趋势无显著差异，表明外源抗原MIC3插入LM-1基因组内，不会改变细菌体外生长能力，且雏鸡感染后LM-1-MIC3在脾脏和肝脏内定植的数量显著低于野生株，表明LM-1-MIC3能够在宿主细胞内增殖并有效诱导机体免疫应答，同时降低其对宿主细胞及盲肠的损害10-11。这是减毒LM作为载体递送抗原的基础，也为鸡球虫感染的免疫保护提供参考依据13。LM具有致病性，因此对其进行了疫苗安全性试验12。结果显示，雏鸡感染野生株96 h后全部死亡，而LM-1-MIC3未引起雏鸡死亡且无明显临床表现，提示LM-1-MIC3对雏鸡致盲肠病变评分对应雏鸡数(只)Number of chicken corresponding to lesion score图8雏鸡免疫后盲肠病变评分的比较543210*表 2雏鸡免疫后盲肠病变评分的比较PBSLM-1LM-1-MIC3Oocysts infection time(days)010050051015LM-1PBSLM-1-MIC312345678910111213141516171819病性显著降低，可以作为潜在的预防鸡球虫感染的侯选菌株15。本研究免疫攻毒保护性试验结果显示LM-1-MIC3免疫组雏鸡攻虫10 d存活率显著高于PBS对照组和LM-1免疫组雏鸡，但未达到100%，推测因具有多个保护性抗原，单个抗原无法对雏鸡达到完全免疫保护作用，因此之后拟采用多抗原共同免疫以加强保护效果3。本研究构建了能够表达MIC3的重组菌株LM-1-MIC3，并初步对其体外生长、增殖能力和安全性进行了分析，并进一步评价了攻击鸡球虫后LM-1-MIC3的免疫保护效果。显示该重组减毒LM分泌表达的LLO-MIC3融合蛋白具有良好免疫原性，其体外生长能力与野生株一致，毒力相较野生株显著降低，安全性好，且对免疫雏鸡攻击鸡球虫后有较好的免疫保护效果，这为后续抗鸡球虫研究提供了重要实验依据，也为鸡球虫候选疫苗的研发提供了新思路。参考文献：MARK C J,CAROLYN P,CELIA O B,et al.Protecting chick-ens against coccidiosis in floor pens by administeringoocysts using gel beads or spray vaccination J.Avian Dis,2013,57(3):622-626.李建梅，刘梅，戴亚斌，等.毒害与巨型及毒害与柔嫩艾美耳球虫间在免疫方面的相互影响J.中国预防兽医学报，2015，37(10)：796-801.CAI HAI-MING,LUO SHENG-JUN,ZHOU QING-FENG,etal.Effects ofand coccidiosis vaccine on growthindices and intestinal microbiota of broilers J.Poult Sci,2022,101(11):102091.YAN ZHI-QIANG,CHEN QIAN-LIN,FU LI-ZHI,et al.Effectof Qing Chang oral liquid on the treatment of artificially infect-ed chicken coccidiosis and the cellular immunity J.Vet MedSci,2022,8(6):2504-2510.ZHAO YUE-LAN,LIU YI-WEI,LIU LI-YUAN,et al.Expres-sion and identification of 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