基于网络药理学探讨四妙丸治疗腰椎间盘突出症的作用机制.pdf

临床用药研究基于网络药理学探讨四妙丸治疗腰椎间盘突出症的作用机制朱智涛1,陈 锋2,袁 宁1,陈祖鹏1(1.广西中医药大学,广西南宁 530001;2.广西中医药大学附属瑞康医院,广西南宁 530011)摘 要 目的:采用网络药理学的研究方法,对四妙丸用于治疗腰椎间盘突出症(LDH)的药理作用以及机制问题进行研究和探讨。方法:借助 TCMSP 平台筛选出四妙丸活性药物成分及靶标预测。从 OMIM 数据库、GeneCards 数据库、Drugbank数据库中检索出疾病靶标。采用 R 软件确定了四妙丸-LDH 的交集靶点并利用 STRING 网站进行蛋白互作。利用 Cytoscape软件构建了药物成分-交集靶点网络。最后在 R 软件将交集靶标进行富集分析。结果:分析研究显示共挖掘到了四妙丸中活性药物成分 75 种及预测靶点 2 902 个、399 个 LDH 疾病相关靶点,取交集后得到四妙丸-LDH 交集靶点 45 个,分析得到MAPK14、MAPK1、IL6、ESR1、FOS 和 JUN 可能为核心靶点,汉黄芩素、槲皮素可能为四妙丸治疗 LDH 的关键活性化合物。GO富集分析得到 GO 条目 2 004 个,KEGG 分析得到 AGE-RAGE 信号通路、TNF 信号通路、IL-17 信号通路等可能为作用通路。结论:四妙丸中有多个对 LDH 有抑制作用的药效成分,多成分多靶标共同作用是其作用机制。关键词 四妙丸;网络药理学;腰椎间盘突出症;药物作用机制基金项目:国家自然科学基金资助项目项目编号:81960879;中华预防医学会科研资金支持项目项目编号:20190224;陈锋广西名老中医工作室建设项目项目编号:桂中医药发 2021 号;广西中医药大学 2021 年研究生教育创新计划项目课题 项目编号:YCXJ2021098通讯作者:陈 锋Study on the Mechanism of Simiao Pill in Treating Lumbar Disc ZHU Zhi-tao1,CHEN Feng2,YUAN Ning1,et al(1.Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,China;2.Ruikang Hospital Affilated to Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530011,China)Abstract:Objective The pharmacological effects and mechanism of Simiao Pill(SMW)in the treatment of lumbar disc herniation(LDH)were studied and discussed using the pharmacological research method of network platform.Method With the help of the data-base and analysis platform of traditional Chinese medicine system(TCMSP),the active drug components of SMW were screened and their targets were predicted.Retrieve LDH disease targets from the database.The Venn atlas was constructed by R software,and the target of SMW in treating LDH was determined.The component disease analysis network was constructed by using the Cytoscape soft-ware.At the same time,the STRING website was used to form an interaction network between proteins,and the core target was deter-mined in the Cytoscape software.The target is enriched and analyzed in R software to determine the biological function and core path-way of SMW in treating LDH.Results Analysis and research showed that 75 kinds of active drug ingredients,2 902 predicted targets and 399 LDH disease related targets in SMW were discovered.After the intersection,45 SMW LDH intersection targets were obtained.Topological analysis showed that MAPK14,MAPK1,IL-6,ESR1,FOS,JUN may be the core target.Hanbaicalin and quercetin may be the key active compounds of SMW in the treatment of LDH.There are 2 004 GO entries obtained by GO enrichment analysis.KEGG analysis revealed that the AGE-RAGE signaling pathway,TNF signaling pathway,IL-17 signaling pathway,and other potential path-ways may be involved.Conclusion In SMW,there are several active ingredients that have inhibitory effect on LDH,and the mecha-nism of action is the joint action of multiple components and multiple targets.Key Words:Simiao Pill;Network pharmacology;Lumbar disc herniation;Mechanism of drug action 腰椎间盘突出症(LDH)是常见的脊柱疾病之一,其因主要是腰椎的退行性病变,椎间盘纤维环破裂,椎间盘的正常结构遭到破坏,其中的髓核突出,从而压迫脊髓及神经根,出现腰腿痛、下肢放射痛等症状的腰部综合征1-2。根据流行病学调查,LDH发病率较高,约占人口的 1.00%,多见于 2040 岁中青年人群,好发于 L4L5 及 L5S1 椎间3-4。随着智能信息化的渗透,久坐的工作方式较为常见,LDH 发病率也因此逐年升高,患病人群的生活质量受到了严重影响,也增加了家庭和社会的经济负担5。使用中药方剂治疗 LDH 的方法繁多,目前主要有四妙丸、左归丸、右归丸、身痛逐瘀汤、甘姜苓术8643吉林医学 2023 年 12 月第 44 卷第 12 期汤、独活寄生汤等方剂。牛膝、苍术、薏苡仁、黄柏组成四妙丸,是清湿热、舒经络名方之一。目前尚无应用网络药理学方法来研究四妙丸对治疗 LDH 作用机制,因此,本研究目的在于分析四妙丸的药理作用,为临床上使用四妙丸治疗 LDH 提供可靠依据。1 资料与方法1.1 文章中运用的数据库和软件工具:见表 1。本研究经过本院医学伦理委员会同意。表 1 文章中运用的数据库和软件工具名称网址版本中药系统数据库及分析平台(TCMSP)http:/ 数据库https:/www.uniprot.orgOMIM 数据库https:/omim.orgGeneCards 数据库https:/www.genecards.orgDrugbank 数据库https:/www.drugbank.ca/String 线上分析平台https:/string-db.orgPubChem 数据库https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.govRCSB 蛋白质数据库http:/www.rcsb.orgR 语言软件https:/www.r-project.org4.12Strawberry Perl 软件http:/5.30.2.1Cytoscape 软件https:/cytoscape.org3.8.01.2 分析四妙丸的化合物及作用靶点蛋白:使用TCMSP 选取出四妙丸药物的化合物成分,收录标准为:口 服 利 用 度(OB%30%)、类 药 性(DL 0.18);再参考相关文献及中华人民共和国药典,对虽然不符合筛选标准但有明确生物活性及药理作用报道的化合物也纳入候选化合物。筛选出来的化合物在 DrugBank 数据库进行靶点收集,并通过 Uni-prot 数据库进行简称注释。1.3 选取 LDH 的疾病靶点:从 OMIM 数据库、Gen-eCards 数据库、Drugbank 数据库中检索出关键词“Lumbar disc herniation”,收集 LDH 发病机制靶点。1.4 四妙丸和 LDH 的交集靶点的确定:将 LDH 疾病发病靶点和四妙丸标准化处理后的预测靶点通过R 软件导入 Venny 作图平台,通过映射疾病-四妙丸靶点来构建韦恩图。映射出交集靶点可能为四妙丸治疗 LDH 的作用靶点。1.5 四妙丸治疗 LDH 主要活性化合物筛选:分别整理四妙丸药物的活性化合物与作用靶点的相互作用关系,应用 Cytoscape 软件构建四妙丸治疗 LDH的“活性化合物-作用靶点”网络并进行相关分析,并选取出关键活性化合物。1.6 构建蛋白互作网络图及核心靶点筛选:将 1.4中获得的作用靶点导入 String 线上分析平台进行蛋白互作网络分析,参数的设置保持默认,构建出作用靶点互作网络。再利用 CytoHubba 插件,筛选出四妙丸治疗 LDH 的核心靶点。1.7 四妙丸治疗 LDH 作用靶点功能及信号通路分析:利用 R 软件对筛选出交集靶点进行基因本体(GO)富 集 分 析、京 都 基 因 与 基 因 组 百 科 全 书(KEGG)富集分析,得出生物过程、分子功能、细胞组成、通路信息。2 结果2.1 四妙丸的方药组成及其药性分类:对四妙丸的4 味中药进行药性分析,在归经分类上,多行于肾经、肝经、脾经。功效上多属化湿药。性味分类上,多属于苦味、甘味。见表 2。表 2 四妙丸组成药物的药性分类组成药物归经分类药物功效分类性味分类薏苡仁脾、胃、肺利水消肿药甘、淡黄柏肾、膀胱清热燥湿药苦、寒苍术 脾、胃、肝化湿药辛、苦牛膝肝、肾活血通经药苦、甘2.2 四妙丸的化学成分及靶点预测:结合 TCMSP筛选后,可得到四妙丸活性药物成分 75 种,其中黄柏 37 种、牛膝 20 种、苍术 9 种、薏苡仁 9 种。经DrugBank 数据库匹配后,可得到四妙丸 2 902 个预测靶点,分别为苍术 276 个,黄柏 1 346 个,牛膝1 034 个,薏苡仁 246 个。2.3 LDH 疾病靶点以及与四妙丸交集靶点的确定:分别在 GeneCards、OMIM 及 Drugbank 数据库中收集到疾病靶点 380 个、31 个及 9 个,综合数据去重剔除后,得出 LDH 的相关发病机制靶点共 399个。见图 1。并得出四妙丸与 LDH 的交集靶点,共45 个。见图 2。2.4 四妙丸治疗 LDH 主要活性成分筛选结果:四妙丸治疗 LDH 的“活性化合物-交集靶点”网络显示。见图 3。其中有 48 种化合物成分没有找到对应疾病靶点,故未参与分析,得到 27 种有效化合物成分。共四妙丸 4 种组成药物的 27 个活性成分通过调控45 个靶点治疗 LDH,度值排名前2 的活性化合物,即关键活性化合物为槲皮素(quercetin)、汉黄芩素(wogonin)。9643吉林医学 2023 年 12 月第 44 卷第 12 期图 1 LDH 疾病靶点的韦恩图图 2 四妙丸与 LDH 靶点的韦恩图注:牛膝的化合物成分;:苍术的化合物成分;:薏苡仁的化合物成分;:黄柏的化合物成分;:“药物-疾病”的交集靶点;如圆形内有多种颜色,表示此化合物成分存在于多种中药中,具体见相关颜色。图 3 四妙丸治疗 LDH“活性化合物-交集靶点”网络2.5 共同靶点蛋白互作(PPI)网络构建及分析:对交集靶点构建蛋白互作网络(PPI)网络。见图 4。使用 Cytoscape 的插件 CytoHubba 筛选出 6 个作为核心 靶 点,分 别 为 促 分 裂 原 活 化 的 蛋 白 激 酶(MAPK)14、MAPK1、白细胞介素(IL)-6、雌激素受体(ESR)1、FOS 核蛋白转录因子和 JUN 原癌基因。见图 5。2.6 交集靶点的 GO 富集分析及 KEGG 分析:交集靶点 GO 富集分析得到 GO 条目 2 004 个。其中生物过程 1 881 个,细胞组成 25 个,分子功能 98 个。富集程度前 10 见图 6。交集靶点 KEGG 富集分析得到 137 条信号通路,富集程度最高的前 20 条信号通路见图 7。图 4 LDH 与四妙丸交集靶点的互作网络图0743吉林医学 2023 年 12 月第 44 卷第 12 期图 5 四妙丸治疗 LDH 的核心靶点图 6 四妙丸治疗 LDH 交集靶点富集的 GO 分析结果图图 7 四妙丸治疗 LDH 交集靶点富集的 KEGG 通路气泡图3 讨论 LDH 引起的腰腿痛和下肢放射性麻木疼痛是促使患者就诊的重要原因,有学者认为当脊髓神经根受到压迫时,主要表现不是疼痛而是麻木,而炎性反应是腰腿痛的主要原因。中医方面,LDH 归于“腰痛病”“痹证”的范畴,病机多为“经脉闭阻,腰府失养”,而四妙丸源自成方便读,有清湿热、利湿浊、通经活络的功效,是治疗腰痛病、痹症等疾病的经典方剂之一。四妙丸由黄柏、薏苡仁、苍术、牛膝组成,该方药方组成较少,但其药力专一、药性平稳、组方精炼。现代药理研究表明该方具有抗炎抑菌、调节免疫、解热镇静、镇痛等多种药理作用6。研究得出四妙丸治疗 LDH 的关键化合物是槲皮素、汉黄芩素。槲皮素研究表明槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗病毒作用7-8。孙军等9发现槲皮素对氧化应激损伤有着改善作用。有研究表明汉黄芩素能抗炎是因减少前列腺素 E2 的表达10-11。有前期研究表明汉黄芩素能通过下调肿瘤坏死因子-(TNF-)水平达到抑制炎性反应作用12,而 TNF-与炎性反应关系紧密。因此,四妙丸中关键活性化合物的抗炎镇痛、抗氧化应激的作用可能在治疗LDH 发挥了重要作用。PPI 网络结果显示,四妙丸治疗 LDH 的核心靶点为 MAPK14、MAPK1、IL6、ESR1、FOS 和 JUN。MAPK14 作为 MAPK 家族中的成员之一,其表达异常与炎性反应密切相关。当机体受到炎性因子、紫外线照射等刺激后,p38MAPK 通路得到激活,炎性级联反应也随之启动13。IL-6 作为机体重要的调节因子,分泌到血清中,并通过 IL-6 受体 诱导转录炎性反应。有研究发现 ESR1 基因的表达可能会增加膝骨关节炎的患病风险14。FOS 是神经功能活动的代谢性标志物,参与感觉形成的信息传递、调控和整合15。另有实验证实,FOS 的阳性表达与伤害性刺激信号的传入密切相关16。JUN 存在于神经细胞中,参与疼痛信息的传递过程,能对神经传递物质、神经冲动、激素和外部刺激等信息做出反应,进行特异性表达的特点17。可见,四妙丸可能在抑制炎性反应、阻碍伤害性刺激信号的传导等过程中发挥重要作用,具有抗炎、抑制神经功能活动的作用。其具体作用机制还需进一步研究。GO 富集分析结果提示,其生物过程体现在对细菌源性分子的反应、对氧化应激的反应等。以上反映在 LDH 发病过程中较为常见。KEGG 富集的通路分析发现涉及多条信号通路,主要包括 AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路等。AGE-RAGE 通路能激活 NF-KB,进而刺激促氧化靶基因的表达,加速炎性反应因子的分泌,而大量的炎性细胞因子的表达能触发相对应的炎性反应,造成1743吉林医学 2023 年 12 月第 44 卷第 12 期持续性细胞损伤及功能紊乱18。TNF 称为肿瘤坏死因子,是引起椎间盘退变的主要炎性反应物质之一19。IL-17 是作为近年来发现的一组促炎因子之一,参与体内的炎性反应20。可见四妙丸可能在抗炎、抑制氧化应激反应等途径上有效地治疗 LDH,且与目前已知研究结果一致。综上所述,四妙丸治疗 LDH 是可能是通过调控MAPK14、MAPK1、IL6、ESR1 和 FOS 的产生,抑制炎性反应、抗氧化应激反应、阻碍伤害性刺激信号的传入来实现的,该治疗过程中槲皮素及汉黄芩素的消炎镇痛及修复氧化应激损伤的功能可能其中发挥了重要的作用。文章分析出多个药物有效成分、多个治疗靶点及多条信号通路,这也体现出中药复方多成分-多靶点-多通路治疗疾病的特点,为中医药临床治疗 LDH 及进一步研究其相关机制提供了参考。网络药理学的兴起是“中医药传承创新发展”的体现,开辟了中医药研究的新思路与方法。中医药的经验诊疗与循证医学的有机结合是网络药理学的表现形式,也是一种新型研究方式。同时,作为一门仍处于初期阶段的新兴学科,仍存在很多不足与局限性:受各种平台数据库、相关软件算法的限制,有小部分药物有效化合物未能找到相对应的靶点,也没有明确配伍后药物有效成分是否会发生药代动力学等性质的改变,如是否能将单味中药活性成分叠加作为复方活性成分,而中药在煎制过程中是否有药性变化。中药活性成分确定筛选标准是口服生物利用度、类药性,但却忽视了中药活性成分存在着口服生物利用度低的问题。如人参中的人参皂苷类,口服生物利用度低,但是人参作为拯危救脱、补肺脾气要药,在中医药治疗疾病中有着举足轻重作用,以口服生物利用度作为标准排除人参皂苷类显然不合理。需进一步完善和验证基因组代谢途径,以空间关联为基础将药物化合物、靶点、病理-生理过程、疾病进行进一步研究。需要用动物试验、临床试验等来验证研究的合理性、降低同质化与偏倚性。网络药理学是符合中医药的发展原则,随着研究的不断深入以及分析手段的更新,现代化技术与中医药能更好地有机结合。至此本研究有以下3 点建议:网络药理学涉及药理学、临床医学、病理学、人工智能、生物信息学等多种学科,虽然涉及领域广,但同时单一领域的研究有所不足,需有所侧重。中药制剂需要与新型制作工艺相结合,如固体分散技术、纳米技术、自微乳化释药系统、磷脂复合技术等,以达到物尽其效。目前一些新兴起研究方法例如单细胞组学、空间组学尚未与中医药系统药理学进行交会,需突破技术屏障,结合新型研究方法,在原有的研究方法上推陈出新,同时这也需要多学科研究者共同努力。4 参考文献1Deyo RA,Mirza SK.Clinical practice.Herniated lumbar intervertebral disk J.N Engl J Med,2016,374(18):1763-1772.2 Wang JN,Zhao XJ,Liu ZH,et al.Selective phosphodies-terase-2A inhibitor alleviates radicular inflammation and me-chanical allodynia in non-compressive lumbar disc herniation ratsJ.Eur Spine J,2017,26(7):1961-1968.3 吴亚东,齐晓艳,韦庆申,等.基于中医“因虚致瘀”论治结合微创手术对腰椎间盘突出症疗效及血 TNF-、IL-1水平的影响J.中国中西医结合外科杂志,2020,26(3):536-541.4 贺 彬,吴大胜.臭氧髓核溶解术治疗 LDH 的临床分析J.中国疼痛医学杂志,2020,26(7):545-548.5 Ji D,Xing WH,Li F,et al.Correlation of EYS polymor-phisms with lumbar disc herniation risk among Han Chinese pop-ulationJ.Mol Genet Genomic Med,2019,7(9):e890.6 刘亚梅,刘建梅.四妙丸加减对痛风性关节炎的治疗效果及对实验室指标的影响J.世界中医药,2018,13(6):1428-1431.7 Li Y,Yao J,Han C,et al.Quercetin,inflammation and 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例,对照组行常规治疗,观察组在常规治疗基础上联合氨溴索药物进行治疗,比较治疗效果、病症消失时间、肺功能指标、炎性因子、不良反应等指标。结果:观察组治疗有效率为 93.68%,对照组为 77.89%,观察组明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。观察组呼吸困难消失时间、咯嗽消失时间、咳痰消失时间均明显短于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。治疗后,观察组肺活量(FVC)、1 s 用力呼气容量(FEV1)以及最大通气量(MVV)等指标均明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);治疗后,观察组 C 反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)等炎性因子指标均明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。观察组不良反应为 5.23%,对照组为 15.79%,观察组明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05),可以比较分析。纳入标准:本次入选实验研究患者经临床检查均已确诊为慢性阻塞性肺疾病4,临床不良症状表现为脓性痰、痰量增多、呼吸困难等;患者采用影像学检查、实验室检查等方式,已确诊为肺部感染,可以排除肺脓肿、支气管扩张、肺结核、肺癌、肺栓塞等疾病;患者的年龄超过 60 周岁,个人资料齐全;患者的意识清楚,能够独立完成实验,并且对研究药物不存在过敏症状。排除标准:患者处3743吉林医学 2023 年 12 月第 44 卷第 12 期