梓醇对神经血管单元保护作用机制研究进展_闫凤丽.pdf

90第25 卷 第 1 期 2023 年 1 月辽 宁 中 医 药 大 学 学 报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol.25 No.1 Jan.，2023(64 )：48.17 秦圣飞.脑卒中后睡眠障碍的研究进展 J .中国实用神经疾病杂志，2016，19(23 )：75-77.18 ZHANG W，LI F，ZHANG T.Relationship of nocturnal concentrations of melatonin，gamma-aminobutyric acid and total antioxidants in peripheral blood with insomnia after stroke：study protocol for a prospective non-randomized controlled trial J .Neural Regen Res，2017，12(8 )：1299-1307.19 NAM MH，CHO J，KWON DH，et al.Excessive astrocytic GABA causes cortical hypometabolism and impedes functional recovery after subcortical stroke J .Cell Rep，2020，32(1 )：107861.20 YU X，LI W，MA Y，et al.GABA and glutamate neurons in the VTA regulate sleep and wakefulness J .Nat Neurosci，2019，22(1 )：106-119.21 WEIGEND S，HOLST SC，TREYER V，et al.Dynamic changes in cerebral and peripheral markers of glutamatergic signaling across the human sleep-wake cycle J .Sleep，2019，42(11 )：28.22 HOLST SC，WERTH E，LANDOLT HP.Pharmacotherapy of sleep-wake disorders J 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100053）基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助课题（ZZ15-XY-PT-17，ZZ15-XY-LCQ-04）作者简介：闫凤丽（1989-），女，河南三门峡人，硕士在读，研究方向：中医治疗脑病的机制和研究。通讯作者：黄世敬（1964-），男，贵州道真人，主任医师，博士研究生导师，博士，研究方向：中医脑病、心身疾病的临床、基础与中药新药研发。E-mail：。摘要：梓醇是中药地黄的主要有效成分，对中枢神经系统疾病的防治有着广泛应用价值。作者搜集了近年来关于梓醇对神经血管单元保护作用的相关文献，并对其进行综述。该文主要从神经元、脑微血管和胶质细胞3个方面分别论述梓醇的不同作用机制，证明梓醇作为脑保护剂的巨大潜力。希望能够为中枢神经系统疾病的防治和中药地黄的开发提供一些思路和理论依据。关键词：梓醇；神经血管单元；神经元；脑微血管；神经胶质细胞中图分类号：R742 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2023)01-0090-05Research Progress on the Protective Mechanism of Catalpol on Neurovascular Units YAN Fengli1，2，HUANG Shijing2（1.Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine，Xianyang 712046，Shaanxi，China；2.Guanganmen Hospital，China Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100053，China）Abstract：Catalpol is the main effective component of Dihuang（Rehmannia Glutinosa），which has a wide application value in the prevention and treatment of central nervous system diseases.The author reviewed relevant literatures on the protective effect of catalpol on neurovascular units from CNKI，PubMed and other databases in recent years and reviewed them.In this paper，the different mechanisms of catalpol were discussed from neuron，brain microvessel and glial cell respectively，and the great potential of catalpol as brain protective agent was proved.Hope to provide some ideas and theoretical basis for the prevention and treatment of central nervous system diseases and the development of traditional Chinese medicine rehmannia glutinosa.Keywords：catalpol；neurovascular unit；neurons；cerebral microvessels；glial nerve cell中枢神经系统（CNS）疾病多病机复杂，治疗困难。以往研究只关注神经元的损伤和修复，其效果并不突出，而神经血管单元（NVU）的提出为CNS疾病的研究提供更为全面的框架。NVU是由神经元、微血管以及胶质细胞共同构成，不仅维系着脑内环境的稳态，还参与受损神经元的修复。梓醇是滋阴补肾类中药地黄的主要有效成分，能够抗肿瘤、降血糖、保护心脏和神经1。其中，梓醇对NVU的保护主要包括营养神经元、增强腺苷三磷酸（ATP）酶活性、抑制Ca2+超载和兴奋性氨基酸毒性、促进血管新生、抗炎、抗氧化、抗凋亡2-4等作用机制，对治疗中风、阿尔茨海默症（AD）、帕金森病（PD）、抑郁症、脑白DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2023.01.01991 25 卷 辽宁中医药大学学报 质病、多发性硬化（MS）等CNS疾病具有一定潜力。本文将进一步分述其作用机制，为中枢神经系统疾病的防治和地黄梓醇的开发利用提供一些思路和理论依据。见图1。图1 梓醇的化学分子结构1对神经元的保护作用1.1 上调神经生长因子（NGF）、脑源性神经生长因子（BDNF）和胶质源性神经生长因子（GDNF）的表达，营养神经元NGF、BDNF和GDNF都属于神经营养因子。NGF4是神经系统发育和生理过程中的关键因子，可以促进干细胞分化为神经、对抗细胞凋亡、维持神经细胞存活和增殖，在促进轴突生长和突触发生等方面发挥神经保护作用5。BDNF能够增加突触可塑性，促进神经细胞再生。GDNF是一种由胶质细胞分泌的特异性多巴胺（DA）能神经元营养因子。实验表明梓醇能够上调NGF、BDNF表达，提高永久性脑缺血（pMCAO）大鼠脑皮质神经元的存活率，加速神经功能恢复5。ZHU H F等6实验也再次证明梓醇可以提高pMCAO大鼠脑中BDNF的表达，促进脑神经的发生和新生神经元的存活。XU G等7则在PD模型小鼠实验研究中发现梓醇能够增加GDNF的表达，减弱多巴胺能神经元的变性，提高小鼠的运动能力。1.2 提高生长相关蛋白43（GAP-43）的表达，促进轴突延伸GAP-43是一种膜磷脂蛋白，被看作是神经可塑性的分子标志。它不仅能够促进轴突和突触的生长，还与学习和记忆能力关系密切。在发育过程中，大多数神经元的轴突延伸中都可发现GAP-43。祝慧凤等8发现pMCAO大鼠在应用梓醇后，GAP-43含量提高，受损的神经元功能得到恢复，突触病变减轻、突触数目明显增多。在体外细胞培养实验中，梓醇也能够提高GAP-43含量，促进大鼠皮质神经元轴突的延伸9。梓醇也可以提高老年大鼠海马CA3区和齿状回中GAP-43的含量，逆转由衰老所引起的记忆力缺损10。此外，梓醇还可以逆转一种神经毒素MPTP诱导的PD模型小鼠GAP-43蛋白表达降低，保护多巴胺能神经元11。1.3 上调微管蛋白（Tuj-1）和微管相关蛋白2（Map-2）的表达，保护神经结构的稳定性Tuj-1是微管的主要成分，参与构成细胞骨架，与细胞的分裂和胞内的运输有关。在实验中常用来标记新生神经元。Map-2在神经元各部位均可表达，可以调节微管的聚合和增加微管的稳定性，从而保护神经元轴突、树突的发生和延展性的调节。梓醇能够上调脑缺血大鼠Tuj-1和Map-2的表达，通过增加微管及相关蛋白有效保护神经元6，12。梓醇也可以刺激老年大鼠Map-2表达，延长Map-2阳性神经元的长度，逆转淀粉样蛋白（A）诱导的神经突触损伤，对AD等认知障碍有潜在缓解作用13。1.4 降低NgR和勿动蛋白A（Nogo-A）表达，消除神经生长限制状态Nogo-A可以在脑损伤后和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（Ogmp）以及髓鞘相关糖蛋白（MAG）一起产生轴突生长抑制因子，并构成了“限制性脑微环境”。其中Nogo-A的作用较强，能够限制受损的神经的生长，尤其是再生神经纤维的长距离生长14。而NgR则是三者的共同受体，对消除限制性脑环境所造成的抑制作用意义重大。万东等15实验发现梓醇能够降低脑缺血大鼠Nogo-A和NgR的表达，消除轴突生长抑制状态。2对脑血管的保护作用2.1 增加血管内皮生长因子（VEGF）的表达，促进血管新生VEGF是一种由神经细胞所分泌的营养因子，又被称为血管通透性因子，与血管生成、血管通透性和神经保护16-17有关。但却也是局灶性脑缺血早期血脑屏障破裂的部分原因。梓醇可以通过JAK2/STAT3通路刺激VEGF的表达，促进中风模型大鼠血管的新生18。梓醇也能够激活HIF-1/VEGF通路，促进缺血大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）的增殖20。梓醇还可通过上调PI3K/AKT信号增加VEGF的表达21，上调VEGF及VEGFR激活Notch信号通路22，促进脑梗死大鼠血管的新生及NVU形态的保护。2.2 增加促红细胞生成素（EPO）的表达，促进血管新生和防止血管水肿EPO是一种内源性的糖蛋白，可以逆转血管痉挛，刺激血管生成。此外，EPO还可以通过减少活性氧、调节炎症、调节神经传递等方面对CNS起保护作用23。EPO和VEGF具有协同作用，既能促进血管新生，又能保护神经元，还减少了由于VEGF表达增多所导致的血管渗透性增加以及血脑屏障（BBB）水肿。实验均表明梓醇既可以增加VEGF含量，又可以提高EPO的表达，促内皮细胞黏附、增殖和迁移，显著减少脑毛细血管水肿，增加脑缺血模型动物梗死区血管生成，分支血管向脑表面交叉和聚集，缓解神经功能障碍18，24-25。2.3 刺激血管生成素1（ANG-1）和Tie2的表达，促进血管成熟ANG-1是ANG家族成员之一，主要由周细胞、血管平滑肌细胞等血管旁支持细胞合成，可以与Tie2受体结合在血管内皮细胞膜上。ANG-1可以激活AKT，通过增进血管内皮细胞的新生和分布达到稳定血管、防止渗透的作用。ANG-1和VEGF协同作用，可以增加成熟血管的形成。此外，ANG-1也有一定的神经保护作用26。实验发现梓醇可以增加ANG-1和其受体Tie2的表达，从而增加脑缺血大鼠梗死灶周围血管的成熟稳定27。2.4 降低凋亡和自噬因子的表达，保护BMECsBMECs对维持BBB结构和功能的稳定性至关 重 要。Bax是Bcl-2基 因 家 族 中 一 种 促 细 胞凋亡基因，而Bcl-2 则能抑制细胞凋亡，两者的92 辽宁中医药大学学报 25 卷比值常表示细胞凋亡作用的强弱。细胞色素C（cytochrome-C）能够在凋亡信号刺激下由线粒体释放至细胞液后启动Caspase级联反应。cleaved Caspase-3是终末剪切蛋白酶Caspase-3的水解产物，参与细胞的凋亡。刘晨阳等28实验表明梓醇可以降低促凋亡蛋白Bax、cytochrome-C、cleaved Caspase-3和自噬效应蛋白（Beclin-1）以及自噬标志物（LC3-）的表达，同时上调Bcl-2的表达，通过抑制凋亡和自噬，保护BMECs免受A蛋白的损伤，进而保护BBB。2.5 增加紧密连接蛋白的表达，保护BBB紧密连接能够加强BMECs之间的黏附性，防止BBB通透性增大引发各种脑部疾病。梓醇能够上调紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1、ZO-2等的表达，增加BMECs间紧密连接，逆转由高血糖引起的BMECs损伤29。在脂多糖诱导的BBB通透性增加模型上30，梓醇可以抑制RhoA/ROCK2通路，提高紧密连接蛋白如claudin-5、occludin和ZO-1的表达，防止BMECs的分解，保护BBB。而在体外培养的BBB模型31中，梓醇也可上调ZO-1、occludin和claudin-5的表达，减轻了由A1-42诱导的BBB破坏，还增加了可溶性A清除率，对AD有潜在的治疗作用。3对胶质细胞的作用3.1 星形胶质细胞的作用3.1.1 调节胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，调控星形胶质细胞（AS）保护和活化GFAP是细胞骨架和AS支架的主要成分，对维持AS的结构和形状至关重要32。而且，只有成熟的AS才表达GFAP，因此在实验中被用于标记AS。谭灵莉等33用GFAP组化显示AS，结果相较于脑梗死模型组，梓醇组AS数目明显减少，胞体形态也趋于正常，提示梓醇可以降低AS的过度活化。在多发性硬化（MS）模型中34，梓醇同样可降低GFAP的表达，减少AS过度活化胶质瘢痕形成。但缺血性脑白质损伤大鼠在经梓醇注射后脑组织中GFAP表达减少，AS胞体变小，突触减少，提示梓醇可以减轻AS活化从而改善缺血后脑白质的损伤35。由上可知，梓醇既可以增加AS的表达，又可以抑制AS的过度激活，该现象可能与梓醇的用量有关，也可能与AS的状态有关，具体还有待进一步研究。3.1.2 增加超氧化物歧化酶（SOD）、降低丙二醛（MDA）活性，防止AS氧化损伤SOD是一种存在于细胞质和线粒体内外膜之间的抗氧化金属酶，可以降低活性氧（ROS），抑制氧化反应，反映机体的抗氧化能力。MDA不仅是脂质过氧化的重要指标，也是细胞损伤的间接反应，它能够使DNA和RNA发生交联，继而导致DNA和RNA的断裂和失活。梓醇能明显改善由过氧化氢（H2O2）所导致AS形态的改变、活力的降低和细胞膜完整性的破坏，其原理与梓醇能够抑制细胞内SOD活性的降低和MDA含量的升高有关36。实验也发现梓醇预处理可以增强SOD活性和降低MDA含量，提高缺血、缺氧体外培养的AS存活率，进一步阐明梓醇可以通过抗氧化保护AS37。3.1.3 降低一氧化氮（NO）和ROS的产生，减轻AS氧化损伤AS激活后可以释放NO和ROS，两者均可造成神经细胞的损伤。而NO由诱导性一氧化氮合酶（iNOS）生成，ROS则由环加氧酶2（COX-2）产生。实验证明梓醇预处理可以在mRNA水平上钝化iNOS、COX-2的转录，降低NO和ROS的含量以及iNOS的活性，阻止脂多糖联合干扰素诱导的AS细胞体积减小和突起延伸38。实验则在糖氧剥夺再灌注条件下验证了梓醇能够抑制ROS和NO的产生，降低iNOS的活性，改善体外培养的AS形态和存活率39。3.1.4 增加谷胱甘肽（GSH）及相关酶的活性，提高AS抗氧化能力GSH具有抗氧化能力，它有两种形式，分别为还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物；谷胱甘肽还原酶则可将GSSG催化还原生成GSH。在AS体外培养实验中，梓醇能够上调GSH、GPx含量39-40，提高谷胱甘肽还原酶活性40，从而保护AS免受H2O2诱导的氧化损伤。可见，梓醇有潜力预防和治疗由氧化应激所导致的神经退行性疾病。3.1.5 增加谷氨酸转运体（GLAST）的表达和提高Na+/K+-ATP酶活性，提高AS活性GLAST主要位于神经元和胶质细胞的细胞膜上，能逆浓度梯度从胞外向胞内摄取谷氨酸（Glu），以保护神经细胞受Glu的毒性损伤。ATP酶在维持脑细胞内离子平衡、细胞兴奋性和导电性以及调节神经递质释放和代谢等方面发挥着重要作用。Na+/k+-ATP酶不仅能产生能量供给细胞膜，还可以调控Na+和K+浓度，使得细胞在受到刺激时有能力发生兴奋，参与调节细胞膜内外水液吸收与排出。梓醇能够增加体外培养的AS内GLAST的表达，从而减少Glu毒性；提高Na+/k+-ATPase的活性，增加细胞的能量代谢，保护AS免受鱼藤酮的损伤41。可见梓醇对体外培养的PD模型有一定的保护作用。3.2 对小胶质细胞的作用3.2.1 抑制IBa-1的表达，抑制MG的过度活化IBa-1是小胶质细胞（MG）的标志性蛋白，与MG活化介导的吞噬作用和促炎作用密切相关。研究表明梓醇可以阻断MPTP处理后小鼠脑内IBa-1表达增高，提示梓醇可以降低MG过度活化增殖，抑制炎症反应11。而这一作用对脑缺血、PD和AD等均有防治作用。梓醇还可以减少抑郁症模型小鼠IBa-1的表达，防止小鼠海马M1表型小胶质细胞的极化，减轻抑郁行为42。3.2.2 降低肿瘤坏死因子（TNF-）、白介素1（IL-1）和NLRP3，减轻MG所引起的炎症反应TNF-作为TNF超家族的一员，能够促进炎症反应。TNF-由反应性AS和激活的MG释放，调节神经退行性疾病中的氧化应激和炎症。IL-1是一种由MG所分泌的细胞趋化因子。炎性小体NLRP3被称为炎症反应的核心，可因多种病原体或危险信号等原因激活，并在激活状态下参与免疫反93 25 卷 辽宁中医药大学学报 应。实验证明梓醇能够抑制MG的过度增殖，减少TNF-、IL-1和NLRP3的表达，减轻MPTP诱导的氧化应激，从而预防慢性炎症、改善帕金森等神经退行性变11。在抑郁症模型小鼠实验中也印证了梓醇可降低TNF-、IL-1和NLRP3的表达，减轻慢性应激刺激下MG激活所引发的炎症反应，改善小鼠抑郁行为42。3.2.3 抑制TLR4/NF-B通路，减轻MG过度激活Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一种跨膜蛋白，可以识别脂多糖，并通过与炎症反应相关的NF-B启动细胞内的信号转导，从而激活天然免疫过程。研究表明梓醇可以通过抑制TLR4/NF-B通路，进而抑制由脂多糖所引起的BV2小胶质细胞过度激活43。此外，梓醇还可以降低炎症介质NO和前列腺素E2（PGE2）的表达。3.2.4 通 过 TNFR 及 PI3K/Akt 通 路，调 控 MG的存亡PI3K/Akt通路是由磷脂酰肌醇3-激酶PI3K和下游蛋白激酶B（Akt）共同构成，可以调控细胞存亡。TNFR是TNF-的受体，它有两个类型：TNFR1和TNFR2，都能够激活信号通路PI3K/Akt。但它们作用相反，前者介导细胞凋亡，后者促进细胞存活。在MG的体外培养中，短时间的低氧环境会导致TNFRI/TNFR2小于1，具有MG保护作用；而当长时间低氧条件下，二者比值大于1，则介导MG凋亡44。而梓醇却可以扭转小胶质细胞的凋亡，使得TNFR1与TNFR2比率小于1。由此推测梓醇能够诱导活化TNFR和PI3K/Akt，参与小胶质细胞的调节。3.3 对少突胶质细胞的作用3.3.1 增加髓鞘碱性蛋白（MBP）的表达，保护少突胶质细胞（OLG）MBP在CNS中由OLG合成，可以营养和维持髓鞘结构和功能，也是神经髓鞘所特有的脂蛋白，常用来标记OLG。CAI Q Y等45研究表明梓醇能够上调缺血性脑白质损伤大鼠MBP免疫组化染色，减轻OLG的损伤和髓鞘的破坏。梓醇也可以增加脑缺血大鼠MBP的表达，减少髓鞘的损伤46。此外，自发性高血压病大鼠47和多发性硬化模型小鼠48相关实验也证实了梓醇可提高MBP的表达，保护髓鞘。足见，梓醇对脱髓鞘性疾病如脑白质病、多发性硬化和多动症均一定的治疗作用。3.3.2 增加少突胶质细胞前体细胞（OPC）的增殖分化和迁移，促进OLG的新生当OLGs受损时，是不能进行自我修复的。而OPC却可以分化出新生OLGs完成轴突的再髓鞘化。当CNS髓鞘损伤时，OPC增殖并从脑室下区迁移至脱髓鞘区，当数量积累到一定程度后就可以分化成OLGs，最后形成髓鞘包绕在轴突附近。体外培养实验显示，梓醇有助于OPC的增殖、迁移和分化，促进OLGs的再生，恢复轴突的再髓鞘化49。李娜等50研究显示，梓醇可以逆转由一种自由基引发剂AAPH所诱导的OPC氧化损伤，保护OPC的生理功能以补充OLGs。进一步研究发现，梓醇促进OPCs的增殖、分化和轴突再髓鞘化的功能与上调Olig1和Olig2表达48，下调ERK1/2（p-ERK1/2）通路52和抑制NOTCH1信号通路53有关。3.3.3 抑制Ca2+超载，减少OLG前体细胞的凋亡细胞内Ca2+超载可引发Ca2+缓冲细胞器即线粒体的损伤，继而产生氧化应激，最终会导致细胞死亡。CAI Q等51实验证明梓醇可以逆转由缺血、缺氧所诱发的前髓鞘性少突胶质细胞（PreOLs）内Ca2+超载，减轻线粒体的损伤，减少ROS的过量产生，有效保护PreOLs，防止髓鞘形成缺陷。有实验则进一步验证梓醇可通过提升Na+/Ca2+转换器3（NCX3）的活性，减少细胞内Ca2+内流，并且可以通过抑制ERK1/2和PARP-1的激活防止线粒体损伤，保护体外培养的PreOLs存活及分化成熟，保护髓鞘再恢复54。3.3.4 上调p-CREB/Bcl-2通路，降低Caspase-3的表达，减少OLG的凋亡磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（p-CREB）由环磷酸腺苷反应原件结合蛋白（CREB）被激酶磷酸化而成，是一种有活性的转录因子，可以调节多种细胞因子的转录水平，包括促进Bcl-2蛋白的表达。Caspase-3能对细胞凋亡起关键作用，但这一过程可被Bcl-2阻断。实验证明梓醇能够提高p-CREB和Bcl-2的表达，减少Caspase-3的表达，从而减少低灌注引起的OLG凋亡和髓鞘的破坏，改善大鼠脑白质病变和记忆力障碍45。4讨论综上所述，梓醇对NVU的保护具有多靶点、多环节、多途径的特点。除此之外，梓醇还有能透过血脑屏障的优势，静脉注射和口服给药均可应用。可见梓醇作为NVU的保护剂，在老龄化社会中有着巨大开发前景。但目前关于梓醇的研究仅以啮齿科动物和体外细胞培养为主，今后还需进一步扩展临床研究，加快中药现代化开发应用，不断提高CNS疾病的临床疗效。参考文献 1 黄传君，赵方正，张才擎.生地黄有效成分梓醇药理作用机制研究进展 J .上海中医药杂志，2017，51(2 )：93-97.2 LIU Y R，LEI R Y，WANG C E，et al.Effects of catalpol on ATPase and amino acids in gerbils with cerebral ischemia/reperfusion injury J .Neurol Sci，2014，35(8 )：1229-1233.3 ZHENG X W，YANG W T，CHEN S，et al.Neuroprotection of catalpol for experimental acute focal ischemic stroke：Preclinical evidence and possible mechanisms of antioxidation，anti-inflammation，and antiapoptosis J .Oxid Med Cell Longev，2017，2017：5058609.4 刘明，刘洋，张易，等.梓醇上调NGF、BDNF及mRNA表达伴随缺血性脑卒中大鼠神经功能恢复 J .中华中医药杂志，2011，26(5 )：977-981.5 BRACCI-LAUDIERO 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