基于转录组测序的辅助鉴定南方大豆皱叶症分子标记开发.pdf

6期1587陈文杰（1982-），副研究员，主要从事大豆遗传育种及耐逆境机制研究工作。主持国家自然科学基金项目“新型大豆皱叶基因CL12的图位克隆及其对产量性状影响”和“大豆皱叶症关键致病因子分析及其诱发的皱叶分子机制”2项、广西自然科学基金项目“大豆皱叶症抗基因鉴定及功能标记开发”1项，作为主要成员参与省部级项目8项；获广西科技进步奖二、三等奖各1项；以第一完成人育成已通过广西农作物品种审定委员会审定的大豆新品种1个，作为主要参与者育成已通过广西农作物品种审定委员会审定的大豆新品种8个；获第一发明人授权发明专利7件，实用新型专利7件；在 中国油料作物学报 南方农业学报 大豆科学 等期刊发表科技论文35篇，其中以第一作者发表中文核心期刊论文14篇。基于转录组测序的辅助鉴定南方大豆皱叶症分子标记开发陈文杰1，梁江1，韦清源1，汤复跃1，郭小红1，陈渊2*（1广西农业科学院经济作物研究所，广西南宁530007；2广西农业科学院重点实验室，广西南宁530007）摘要：【目的】基于转录组测序（RNA-Seq）开发辅助鉴定南方大豆皱叶症（SSCLD）的分子标记，为快速鉴定生产上遇到的大豆皱叶是否为SSCLD提供技术支撑。【方法】利用转录组测序技术分析遗传背景相近的皱叶大豆和正常叶大豆材料在皱叶症诱导环境下的差异表达基因（DEGs），从中去除核苷酸序列高度相似的同源序列，筛选出表达差异较大的DEGs进行分子标记开发，利用皱叶大豆材料和逆境处理试验评价分子标记的表达专一性，并利用不同类型的皱叶表型样本对分子标记进行表达专一性及可靠性验证。【结果】7株皱叶植株样本和5株正常叶植株样本的测序碱基错误率为0.02260.0238，Q20和Q30分别在99.00%和99.90%以上的碱基数量占总碱基数量均大于95.00%，GC含量为45.60%46.24%，表明转录组测序数据质量较好。皱叶大豆材料较正常叶大豆材料有1063个DEGs上调表达，85个DEGs下调表达。根据基因的表达量和同源性，共筛选8个DEGs用作开发分子标记的候选基因，均表现为明显上调表达。8个候选基因的实时荧光定量PCR检测结果与转录组数据基本相符。此外，所筛选基因中有6个基因表达在不同程度上受干旱、水渍、冷害、荫蔽和盐胁迫等逆境胁迫诱导，其中，种植于皱叶症土壤中的皱叶型株系叶片GLYMA_18G033400基因的相对表达量均高于其在正常土壤中受干旱、水渍、冷害、荫蔽和盐等逆境胁迫后的相对表达量。根据GLYMA_18G033400基因序列设计分子标记qCL-18G033400，并用该分子标记对19份不同皱叶类型的叶片样品进行实时荧光定量PCR检测，结果发现，以Ct值小于10.00作为SSCLD的判定标准，分子标记鉴定结果同田间鉴定结果一致。【结论】利用转录组测序技术开发的分子标记qCL-18G033400可辅助鉴定SSCLD。关键词：大豆；皱叶症；分子标记；开发；转录组；辅助鉴定中图分类号：S565.1文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）06-1587-11收稿日期：2023-03-05基金项目：国家自然科学基金项目（32060490，32260451）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-04-CES30）；广西自然科学基金项目（2019GXNSFAA185009）通讯作者：陈渊（1971-），https:/orcid.org/0000-0003-0876-0154，研究员，主要从事大豆栽培和遗传育种研究工作，E-mail：第一作者：陈文杰（1982-），https:/orcid.org/0000-0002-3317-4205，副研究员，主要从事大豆遗传育种及耐逆境机制研究工作，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（6）：1587-1597ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.001优秀青年学者论坛54卷南 方 农 业 学 报 15880引言【研究意义】大豆 Glycine max（L.）Merr.是豆科大豆属的一年生草本植物，是我国重要的粮、油、饲兼用作物，在我国国民生产中具有重要的作用。南方大豆产区是我国重要的高蛋白大豆产区之一，为大豆蛋白加工提供优质的原料。近年来广西、广东、福建和贵州等地大豆生产中出现类似但非大豆病毒病引起的叶片皱缩病症，称为南方大豆皱叶症（Southern soybean crinkle leaf disease，SSCLD），发生严重时大豆可减产40%左右（陈文杰等，2022a），严重影响该产区大豆的生产。引发大豆皱叶的因素有病毒、除草剂、金属离子、基因突变等，其中病毒、除草剂等引起的大豆皱叶与 SSCLD的叶片形态上存在相似性，受大豆品种等差异因素的影响，很难准确辨别生产上遇到的皱叶类型是否为SSCLD（陈文杰等，2022b）。然而，SSCLD叶片表型具有表达专一性，推测SSCLD叶片中存在特异表达基因，该基因可用于开发辅助鉴定SSCLD的分子标记。因此，开发辅助鉴定南方大豆皱叶症分子标记，以期快速判定皱叶类型是否为SSCLD，对大豆皱叶症检测和防治及安全生产具有重要的研究意义。【前人研究进展】鉴定由病毒引起的皱叶症状时，可根据病毒保守序列设计特异分子标记，再对其进行PCR扩增进行判断。目前此类鉴定方法已很成熟，广泛用于豆类（涂丽琴等，2019；吉颖等，2022）、马铃薯（魏瑶等，2020）、辣椒（龚明霞等，2022）和黄瓜（车海彦等，2020）等作物上。随着酶联免疫吸附法（Enzyme-Development of molecular markers based on transcriptomesequencing for assisting the identification of southern soybeancrinkle leaf diseaseCHEN Wen-jie1，LIANG Jiang1，WEI Qing-yuan1，TANG Fu-yue1，GUO Xiao-hong1，CHEN Yuan2*（1Cash Crops Research Institute，GuangxiAcademy ofAgricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China；2Key Laboratory of GuangxiAcademy ofAgricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China）Abstract：【Objective】Molecular markers based on transcriptome sequencing（RNA-Seq）for assisting the identifica-tion of southern soybean crinkle leaf disease（SSCLD）was developed to provide technical support for quickly identifyingwhether the soybean leaves encountered in production were SSCLD.【Method】Transcriptome sequencing technology wasused to analyze differentially expressed genes between crinkle leaf and normal leaf soybean materials with similar geneticbackground in the crinkle leaf-induced soil environment.Homologous sequences with highly similar nucleotide sequenceswere removed，DEGs with large expression differences were selected for molecular marker development，the expressionspecificity of molecular markers was evaluated by using crinkle leaf soybean material and stress treatment test，and the ex-pression specificity and reliability of molecular markers were verified by different types of crinkle leaf phenotype samples.【Result】The sequencing base error rate of seven crinkle leaf plants and five normal leaf plants were 0.0226-0.0238，thenumbers of bases in Q20 and Q30 were 99.00%and 99.90%，and the GC contents were 45.60%to 46.24%，indicatinggood quality of transcriptome sequencing data.Transcriptome data showed that 1063 genes were up-regulated and 85genes were down-regulated in leaves from the crinkle leaf type material，compared to that from normal leaf type material.Based on the expression level and homology of the genes，eight genes were screened according to the expression leveland the identification of the homology in soybean genome，and both of them were up-regulated genes.Real-time fluores-cence quantitative PCR analysis of the eight candidate genes generally agreed with the transcriptome data.The expressionlevels of six of these genes showed varying degrees of interference by diverse abiotic stress，including dry stress，water log-ging stress，cold stress，shade and salt stress，and the expression level of GLYMA_18G033400 in crinkle leaves fromthe crinkle leaf-induced environment was higher than that from normal soil under dry stress，waterlogging stress，coldstress，shade and salt stress.Molecular marker qCL-18G033400 was designed according to the GLYMA _ 18 G033400gene sequence，and used to perform real-time fluorescence quantitative PCR on 19 leaf samples of different crinkle leaftypes.The results showed that Ct value less than 10.00 was used as the determination criterion of SSCLD，and the identi-fication results were consistent with the field identification results.【Conclusion】Molecular marker qCL-18G033400 deve-loped using transcriptome sequencing can assist in the identification of SSCLD.Key words：soybean；crinkle leaf disease；molecular marker；development；transcriptome；auxiliary identificationFoundation items：National Natural Science Foundation of China（32060490，32260451）；Special ConstructionProject of China Agriculture Research System（CARS-04-CES30）；Guangxi National Science Foundation（2019GXNS-FAA185009）6期1589linked immunosorbent assay，ELISA）和胶体金免疫层析法（Gold immunochromatography assy，GICA）等免疫学检测技术的快速发展，使得病毒病的检测快速便捷（王佳等，2021；董旭旭等，2022）。因此，病毒感染所导致的皱叶症（Samertwanich et al.，2001；Ramon et al.，2014；王大刚等，2018；Yang et al.，2019）可通过免疫学检测法和分子标记法（赵小慧等，2021）检测，但SSCLD并非由病毒感染所致，无法利用这2种方法检测。本研究团队前期根据田间皱叶形态建立SSCLD鉴定方法（陈文杰等，2020）。该方法需将被鉴定大豆种质的种子种植于稳定诱发SSCLD的土壤中，根据大豆不同时期叶片形态表现进行鉴定。对于其他地区生产上出现的皱叶症状，单从形态上有时较难判定是否为SSCLD类型。【本研究切入点】目前针对大豆皱叶的研究还比较少，具体何种因素导致SSCLD尚不清楚。SSCLD表型上具有表达专一性，推测SSCLD发生时会有特异表达基因，这些基因可用于开发分子标记进行辅助鉴定SS-CLD，但目前鲜见开发辅助鉴定SSCLD分子标记的研究报道。【拟解决的关键问题】利用转录组测序（RNA-Seq）技术分析遗传背景相近的皱叶大豆和正常叶大豆材料在皱叶症诱导环境下的差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs），从中去除核苷酸序列高度相似的同源序列，筛选出表达差异较大的DEGs进行分子标记开发，利用皱叶大豆材料和逆境处理试验评价分子标记的表达专一性，并利用不同类型的皱叶表型样本对分子标记进行表达专一性及可靠性验证，以期开发分子标记用于辅助鉴定SSCLD。1材料与方法1.1试验材料供试的大豆品种为桂春8号（正常叶，皱叶症级为0）和粤春2017-1（皱叶，皱叶症级为7）有性杂交衍生的杂合异质系材料GY_C（皱叶症诱导环境下表现皱叶）和GY_N（皱叶症诱导环境表现正常叶）（陈文杰等，2022a）以及近杂合异质系材料F2：7，即从F2代取杂合单株进行株行种植，收获皱叶单株，再进行株行种植，然后选择分离的株行收获皱叶单株继续进行株行种植，按照此方法一直种至F2：6代的植株，单株收获F2：6代中皱叶植株，得到F2：6代皱叶单株的种子F2：7，以上材料均由广西农业科学院经济作物研究所提供。主要试剂：总RNA提取试剂盒（RNAsimpleTotal RNA Kit）和反转录试剂盒 FastKing RT Kit（With gDNase）均购自天根生化科技（北京）有限公司；2Es Taq MasterMix购自于康为世纪生物科技有限公司；2ChamQTMUnivarsal SYBR qPCR MasterMix购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。主要设备仪器：LightCycler 480II实时荧光定量PCR仪（Roche，美国）1.2试验方法1.2.1F2：7代皱叶症田间鉴定试验F2：6代皱叶单株的种子F2：7于2020年3月8日播种于广西农业科学院明阳基地（东经1081411，北纬223630，海拔105.64 m，红壤土），多年试验证明该地块为大豆皱叶症表现稳定的地块。选择皱叶和正常叶分离的株行（图1），于始花期分别取7株皱叶植株（C_3、C_6、C_10、C_11、C_18、C_23和C_24）和5株正常叶植株（N1_1、N1_3、N1_5、N1_6和N1_7）的顶部嫩叶2 g左右，分别用锡箔纸包好后置于液氮保存，随后送至上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序。采用Illumina TruseqTMRNA sample prep Kit进行文库构建，即提取总RNA后Oligo dT富集mRNA，然后对富集后的mRNA进行片段化处理，随后利用反转录酶反转录合成cDNA，片段两端连接adaptor后利用Illumina NovaSeq 6000平台进行测序。测序完成后，图像信号经Base Calling得到Raw bases，数据质控得到Clean data，使用TopHat2（http:/tophat.cbcb.umd.edu/）与大豆参考基因组Wlliams82.a4.v1（https:/phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Gmax_Wm82a4_v1）进行对比得到mapped data（Kim et al.，2013），使用Cufflinks（http:/cole-trapnelllab.github.io/cufflinks/）将 mapped reads 进 行 组 装 拼 接（Trapnell et al.，2010），使用RSEM获得每个样本基因/转录本的Read Counts（Li and Deweg，2011），然后对其进行TPM（Transcripts per million reads）转换，进而得到标准化的基因/转录本表达水平。TPM转换方式：先将读数计数除以每个基因的长度（以千碱基为单位），得到每千碱基Reads（Reads per kilobase，RPK）。计 算 各 样 本 中 所 有 的 RPK 值，然 后 将 其 除 以1000000，得到每百万缩放因子（Per million scalingfactor），最后将RPK值除以每百万缩放因子即可得到TPM。1.2.2逆境处理试验为验证在皱叶和正常叶中表达差异的基因是否具专一性，2021年712月利用皱叶材料GY_C进行干旱（Drought stress treatment，DST）、水渍（Water logging treatment，WLT）、冷害（Cold stress treatment，CST）、荫蔽（Shading treat-ment，ST）和盐胁迫（Salt stress treatment，SST）等逆境处理试验。试验采用盆栽方法，逆境处理使用土陈文杰等：基于转录组测序的辅助鉴定南方大豆皱叶症分子标记开发54卷南 方 农 业 学 报 1590为营养土（皱叶材料表现正常），设置1个营养土对照（CKN）和1个皱叶土壤对照（CKC），重复3次。皱叶种子播种于花盆（口径底径高为21.5 cm17.3 cm14.8 cm），每盆播种45粒，待真叶期每盆留2株，随后分别进行干旱、水渍、冷害、荫蔽和盐胁迫处理。干旱胁迫处理参考王兴荣等（2021）的方法，即第6片复叶期开始处理，停止正常供水3 d后取顶部嫩叶。水渍处理参考孙慧敏等（2010）的方法，即第3片复叶期开始水渍处理15 d后取顶部嫩叶。冷害处理参考盖志佳等（2019）的方法，即第6片复叶期开始处理，3 培养箱中处理12 h后取顶部嫩叶。荫蔽处理参考刘婷等（2016）的方法，即第6片复叶期在透光率为50%的遮阳网下处理5 d后取顶部嫩叶。盐胁迫参考严勇亮等（2021）的方法，即第6片复叶期开始处理，置于1.5%的NaCl溶液中处理3 d后取顶部嫩叶。CKN和CKC均于第6片复叶期取顶部嫩叶。嫩叶用锡箔纸包好置于液氮中保存备用。用RNAsimple TotalRNA Kit提取嫩叶样品总RNA，然后用FastKing RTKit（With gDNase）进行反转录合成cDNA。1.2.3皱叶样品采集及田间鉴定试验2021年79月分别在南宁、贵港和贺州等地取不同大豆皱叶类型的大豆植株，取嫩叶后提取其总RNA，然后反转录合成cDNA备用。同时用标牌标记好植株成熟后收获该单株，2022年春季在广西农业科学院明阳基地田间鉴定各材料的皱叶症级，鉴定方法参考陈文杰等（2020），即始花期连续调查10株的皱叶症级，根据以下公式计算皱叶病症指数（DI）：DI（%）=（NR）/（MT）100式中，N表示病害某一级别的植株数；R表示病害的相对病级数值；M表示病害的最高病级数值；T表示调查的总株数。然后根据皱叶症指数划定皱叶症分级：0级为高抗（HR），DI=0；3级为抗（R），0DI30%；5级为中抗（MR），30%DI60%；7级为感（S），60%90%。1.3DEGs筛选为了筛选DEGs，对各基因的TPM值进行t检验，筛选皱叶和正常叶的DEGs。筛选条件：TPM-CminTPM-Nmax或TPM-CmaxTPM-Nmin、TPM-Cmin/TPM-Nmax5或TPM-Nmin/TPM-Cmax5。其中，TPM-Cmin表示某基因中皱叶个体TPM最小值；TPM-Nmax表示某基因中正常叶个体TPM最大值；TPM-Cmax表示某基因中皱叶个体TPM最大值；TPM-Nmin表示某基因中图 1F2：6代皱叶单株株行种植的植株在始花期田间的皱叶表现Fig.1Wrinkled leaf performance of the F2：6generation crinkle leaf plants planting in single row in the field at beginning of floweringA、B和C为皱叶和正常叶分离的株行；D和E为纯合的皱叶株行A，B and C were rows separated from crinkle and normal leaves；D and E were homozygous crinkle leaf6期1591正常叶个体TPM最小值。1.4DEGs同源性比对分析因大豆属于古四倍体，大多数基因属于同源序列，导致扩增该基因难以保证其表达专一性。因此，设计分子标记时需删掉候选基因中核苷酸序列高度相似的基因。将筛选得到的基因cDNA预测序列提交到NCBI数据库上进行BLAST比对，以获得大豆基因组内的核苷酸序列高度相似的序列，从候选基因中删除这些序列。核苷酸序列高度相似的基因判定规则：Query cover80.00%且Percent identity80.00%；不存在高度相似基因满足条件：NQPTPM-Nmax的基因有540个，下调的DEGs中TPM-CmaxTPM-Nmin的基因有39个。下调的DEGs中无TPM-Nmin/TPM-Cmax5.00的基因，上调的DEGs中在正常叶中不表达的共有13个，但其中11个基因的TPM平均值小于1.00，可作为备选基因。最终筛选出9个表达差异较大的DEGs（表4），且均表现为明显表 1供试所用引物序列Table 1Primer sequences used in the test基因编号Gene IDGLYMA_13G167100GLYMA_04G244000GLYMA_07G229500GLYMA_09G130800GLYMA_15G160600GLYMA_18G033400GLYMA_04G242400GLYMA_15G156200Actin11上游引物Forward primer5-TAAGTGACACTAAGCGGTAT-35-AACGACAATGTAGCCTTCAAC-35-CCACAGTTTAAAGTGCATTC-35-GTGTAGTGTCCAAGCTAAGAA-35-GATACTGTTCACAACCTCAAC-35-GCTTGTCTCCTAATAATTGCTC-35-CCTCATCCACATCCAAGTATC-35-TATCTCCATAGCAAGCATGA-35-GGTGGTTCTATCTTGGCATC-3下游引物Reverse primer5-CTTGTACTGCTGAAGTCATC-35-GAGAACAGACACCAGGAGATT-35-TTCTCCAAAGTCCTCTATCC-35-TGATGGAGAGGAAGAGATAGT-35-GGCTAATCTTGGATTCTCTTG-35-CCAGAGTGGAATAAACTTGAC-35-ATCGGAAGAGAATGTGTCAAG-35-TGTGAATAAGGTGATTGGTG-35-CTTTCGCTTCAATAACCCTA-3退火温度（）Annealing temperature6064626460646064626460646064606460-64陈文杰等：基于转录组测序的辅助鉴定南方大豆皱叶症分子标记开发54卷南 方 农 业 学 报 1592样本SampleN_1N_3N_5N_6N_7C_10C_11C_18C_23C_24C_3C_6Total reads481556484456769647817526422859144074293448149604476189024533504649603440499298764199755045105078比对到参考基因组上的Reads总数Total mapped reads45748279（95.0%）41812880（93.82%）45388849（94.92%）39970166（94.52%）38670561（94.91%）45356840（94.2%）44852328（94.19%）43151796（95.18%）47183425（95.12%）47607439（95.35%）39769849（94.7%）42748424（94.78%）多处比对上参考基因组的Reads总数Multiple mapped reads1707598（3.55%）1754219（3.94%）1870427（3.91%）1189545（2.81%）1746024（4.29%）1826286（3.79%）1692587（3.55%）1254181（2.77%）1865709（3.76%）1311140（2.63%）1781647（4.24%）1734328（3.85%）唯一对比上参考基因组的Reads总数Uniquely mapped reads44040681（91.45%）40058661（89.88%）43518422（91.01%）38780621（91.71%）36924537（90.63%）43530554（90.41%）43159741（90.64%）41897615（92.42%）45317716（91.36%）46296299（92.72%）37988202（90.45%）41014096（90.93%）表 3转录组测序数据的参考基因组对比分析结果Table 3Comparative analysis results of transcriptome sequencing data of reference genome括号里面的数值代表相应Reads占Total reads的百分比The values in parentheses represented the percentage of corresponding Reads in total reads图 2皱叶和正常叶材料在皱叶症诱导环境下DEGs筛选及分析Fig.2Analysis of DEGs in crinkle leaf and normal leaf materials under crinkle leaf-induced environmentA：为皱叶和正常叶材料间的Venn图，其中GY_C_leaf表示皱叶基因集，GY_N_leaf表示正常叶基因集，圆圈交叉区表示不同样本共同表达的基因，交叉区外表示各样本的DEGs；B：皱叶和正常叶材料间DEGs的火山图A：Venn diagram between the crinkle leaf and normal leaf materials，GY_C_leaf represented the crinkle leaf gene set，GY_N_leaf represented thenormal leaf gene set，the circled cross area represented the genes co-expressed by different samples，and the outside of the cross area represented theDEGs between samples；B：Volcanic map of DEGs between the crinkle leaf and normal leaf materialsAB表达上调。提取上述9个DEGs的cDNA序列，并在NCBI数据库中进行BLAST比对，结果显示仅有GLYMA_15G156200基因在大豆基因组中存在2个高度相似基因（表4），且与GLYMA_09G049500基因的Query cover和Percent identity分别为88.00%和92.27%。因此选样本SampleN_1N_3N_5N_6N_7C_10C_11C_18C_23C_24C_3C_6Raw reads485745404503736248244614426293044110435248604220480204424571200850035296503529984238252645511342Raw bases733475554068006416627284936714643702490462067571527339237220725108674269025132087555329696760330269863997614266872212642Clean reads481556484456769647817526422859144074293448149604476189024533504649603440499298764199755045105078Clean bases715054334066172780057091029900629659894960654205137164122179709038877967349252077381504895743054988662492411006703705471错误率Error rate（%）0.02280.02280.02260.02380.02270.02290.02260.02260.02270.02270.02260.0227Q20（%）98.9898.9799.0498.5798.9998.9199.0199.0499.0199.0099.0299.01Q30（%）96.4496.4496.6695.2696.4996.2396.5796.6596.5696.5296.5996.55GC含量（%）GC content45.8745.8646.0745.5746.2445.7145.9545.6046.1445.6945.9446.07表 2转录组测序质控数据统计表Table 2Transcriptome sequencing quality control data statistics table1351（4.0%）32100（94.1%）660（1.9%）log2Fold Change-lg Padj6期1593基因 GeneGLYMA_18G033400GLYMA_15G160600GLYMA_09G130800GLYMA_07G229500GLYMA_04G244000GLYMA_15G156200GLYMA_04G242400GLYMA_15G160600GLYMA_13G167100TPMN_100.1701.940.180.141.150.171.05N_300.6300.510.040.100.440.630.82N_50.3000.440.140.040.790.301.13N_600.8601.810.090.050.620.860.93N_70000.940.210.051.1400.91C_106.2016.084.8627.212.242.2111.0216.087.83C_116.3530.552.7816.902.892.868.0330.557.83C_188.6529.791.8431.182.482.329.0329.795.85C_235.3510.425.6411.285.814.0213.1810.426.46C_248.8035.374.3430.201.582.7610.9035.379.55C_31.974.762.1610.351.421.156.464.767.17C_63.855.081.0517.402.161.506.705.086.63t检验t test0.00040.01020.00200.00060.00370.00030.00000.01020.0000TPM-Cmin1.974.761.0510.351.421.156.464.765.85TPM-Nmax00.8601.940.210.141.150.861.13TPM-Cmin/TPM-Nmax-5.53-5.346.768.215.625.535.18TPM-Cmin-TPM-Nmax1.973.901.058.411.211.015.313.904.72NQP000002000表 4DEGs的TPM及其与同源基因评价参数值Table 4TPM value of DEGs and parameter values for their homologous gene evaluation择余下的8个DEGs用作开发分子标记的候选基因。2.3辅助鉴定SSCLD的分子标记开发根据筛选出的8个候选基因cDNA序列信息设计引物，以温度梯度PCR筛选引物的最佳退火温度。以皱叶症诱导环境下的皱叶材料（GY_C）和正常叶材料（GY_N）株系叶片cDNA为模板，对8个候选基因进行实时荧光定量PCR检测，结果（表5）显示，与正常叶材料相比，皱叶材料叶片中8个候选基因的表达量均明显增加，其中差异倍数最小的是GLY-MA_13G167100基因，仅为2.55倍；差异倍数最大的是GLYMA_18G033400基因，达66.26倍。表达差异较小可能会影响SSCLD的鉴定效果。因此，选择表达差异较大的GLYMA_18G033400、GLYMA_09G130800、GLYMA_15G160600、GLYMA_15G156200、GLYMA_04G242400和GLYMA_07G229500共6个基因开发的分子标记进行后续专一性评价试验