感受态制备、蓝白斑筛选.ppt

分分 子子 医医 学学 实实 验验1n 感受态细胞的制备感受态细胞的制备n 质粒转化入大肠杆菌及初步筛选质粒转化入大肠杆菌及初步筛选 2复习：基因克隆示意图复习：基因克隆示意图3基因克隆基因克隆操作过程：操作过程：分分分离载体和目的基因分离载体和目的基因 切切限制酶切载体与目的基因限制酶切载体与目的基因接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 4基因工程基因工程5一、感受态细胞及重组体转化一、感受态细胞及重组体转化6重组重组体体转转入受体菌入受体菌受体细胞受体细胞转化（转化（转化（转化（transformationtransformation）转染（转染（转染（转染（transfectiontransfection）转导（转导（转导（转导（transductiontransduction）7转化转化转化转化是是是是将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。转染转染转染转染是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞;转导转导转导转导则是指病毒从被感染的细胞则是指病毒从被感染的细胞(供体供体)释放出来，再释放出来，再次感染另一细胞次感染另一细胞(受体时受体时)，发生供体细胞与受体，发生供体细胞与受体细胞之间的细胞之间的DNA转移及基因重组。转移及基因重组。重组重组DNADNA分子导入受体细胞的手段分子导入受体细胞的手段8转化方法转化方法 CaClCaClCaClCaCl2 2 2 2诱导转化诱导转化诱导转化诱导转化 电穿孔电穿孔电穿孔电穿孔 PEGPEGPEGPEG介导转化介导转化介导转化介导转化 人工体外包装人工体外包装人工体外包装人工体外包装特殊处理特殊处理特殊处理特殊处理受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞细胞膜特性细胞膜特性细胞膜特性细胞膜特性改变改变改变改变9CaClCaCl2 2处理处理受体细菌受体细菌受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2 感受态细感受态细感受态细感受态细菌菌菌菌重组体转入细重组体转入细重组体转入细重组体转入细菌菌菌菌10感感受受态态(competent)：宿宿主主细细胞胞处处于于容容易易吸吸收收外外源源性性DNA的的状状态态，处处于于感感受受态态的的细细胞胞称为感受态细胞称为感受态细胞.正正常常细细胞胞都都有有细细胞胞膜膜（细细菌菌还还有有细细胞胞壁壁）作作屏屏障障，对对外外源源分分子子选选择择性性接接受受。在在实实验验中中通通过过一一定定的的理理化化条条件件使使细细胞胞通通透透性性增增大大，处处于于感感受受态。态。11 制备感受态细胞和转化的常用方法制备感受态细胞和转化的常用方法CaClCaCl2 2转化程序法转化程序法转化程序法转化程序法：传统方法传统方法,转化效率能达到转化效率能达到5 1062 107转化子转化子/g质粒质粒DNA，简单、快速、，简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。重复性好、菌株适用范围广。电穿孔转化法、脂质体电穿孔转化法、脂质体(liposome)法、胞核的显法、胞核的显微注射法微注射法(microinjection)；磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；12 CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理法制备感受态细胞和转化的原理一一般般受受体体菌菌对对重重组组DNA分分子子的的摄摄取取能能力力很很低低，难难以以转转化化成成功功。当当细细菌菌处处于于冰冰冷冷（0）0.050.1M的的CaCl2低低渗渗溶溶液液中中，菌菌体体的的细细胞胞膨膨胀胀成成球球形形，细细胞胞膜膜的的通通透透性性增增加加，对对DNA的的摄摄取取能能力力增增强，转化效率提高（感受态细菌）。强，转化效率提高（感受态细菌）。13同同时时在在转转化化体体系系中中的的DNA形形成成的的抗抗DNase的的羟羟基基-钙钙磷磷酸酸复复合合物物能能粘粘附附于于细细菌菌表表面面，经经过过42短短时时间间热热休休克克（heatshock）处处理理，促促进进感感受受态态细细胞胞吸吸收收DNA复复合合物物。在在丰丰富富培培养养基基上上生生长长1小小时时后后，球球状状细细胞胞复复原原并并分分裂裂增增殖殖，重重组组子子中中的的基基因因在在转转化化细细 菌菌 中中 得得 到到 表表 达达，在在 选选 择择 性性 培培 养养(selectiveculture)平板上即可筛选出所需的转化子。平板上即可筛选出所需的转化子。140.1mol/LCaCl0.1mol/LCaCl2 20重组体重组体重组体重组体感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞15转化转化(transformation)：在分子克隆技术中，转化在分子克隆技术中，转化特指质粒特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。的过程。区别转化、转染区别转化、转染(transfection)与转导与转导(transduction)转化与感受态细胞转化与感受态细胞16二、感受态细胞制备及重组体二、感受态细胞制备及重组体转化的实验操作及注意事项转化的实验操作及注意事项172024/5/21 周二18细菌转移到一冰冷的细菌转移到一冰冷的1.5ml的的EP管，管，40C，4000rpm5min弃上清，沉淀中加入冰冷的弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/LCaCl2300l300l，重悬菌体，冰浴重悬菌体，冰浴20min40C，4000rpm5min弃上清，将管倒置于滤纸上弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净使液体流干净沉淀中加入冰冷的沉淀中加入冰冷的0.1mol/LCaCl2100l100l，重悬菌体。重悬菌体。冰浴冰浴10min19冰浴冰浴10min后后每管加入质粒每管加入质粒5 l轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置20min试管放入试管放入420C的水浴中，放置的水浴中，放置9090s s，不要摇动试管不要摇动试管不要摇动试管不要摇动试管迅速将试管转移到冰浴，冷却迅速将试管转移到冰浴，冷却12min20取出试管后，每管加入取出试管后，每管加入LB培养基培养基800 l，置于置于370C摇床（摇床（100150r/min），），温和震荡温和震荡45min用无菌弯头玻璃铺菌器将用无菌弯头玻璃铺菌器将200 l菌液铺于含菌液铺于含Amp的琼脂平板表面的琼脂平板表面室温放置室温放置20min，使液体被吸收（发汗）使液体被吸收（发汗）倒置平皿，倒置平皿，370C培养，培养，12小时可见菌落生长小时可见菌落生长21三、重组体的筛选三、重组体的筛选22重组体克隆的重组体克隆的筛筛选与鉴定选与鉴定 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNADNADNADNA的阳性克隆。的阳性克隆。的阳性克隆。的阳性克隆。23筛选的依据：筛选的依据：基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。筛选的方法：筛选的方法：抗药性标志的选择抗药性标志的选择插入表达筛选插入表达筛选-半乳糖苷酶系统筛选（半乳糖苷酶系统筛选（-互补）互补）(-半乳糖苷酶能将半乳糖苷酶能将X-gal转变为不溶性的深蓝沉淀）转变为不溶性的深蓝沉淀）24(插插入入失失活活法法)抗抗药药性性标标记记选选择择目目录录25菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法内切酶图谱鉴定内切酶图谱鉴定PCR筛选重组子筛选重组子Southern印迹杂交和菌落原位杂交印迹杂交和菌落原位杂交DNA序列分析序列分析免疫化学检测法免疫化学检测法26原理：基因载体上含有原理：基因载体上含有-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZ)的的基因，当外源基因，当外源DNA插入到载体的插入到载体的LacZ基因上后将基因上后将造成造成-半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的X-gal(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷）产生蓝色产半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有物，结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有X-gal-IPTG（异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷）培养基的颜色硫代半乳糖苷）培养基的颜色变化直接观察出来。变化直接观察出来。蓝白斑实验蓝白斑实验27 互互补补的的检检测测目目录录U6U628原原位位杂杂交交目目录录29Southern印迹印迹目目录录30鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出目目录录31预预 期期 结结 果果32pUC119pUC119含空载体含空载体含空载体含空载体pUC119pUC119的蓝的蓝的蓝的蓝色菌落色菌落色菌落色菌落含含含含pUC119-u6pUC119-u6的白色菌落的白色菌落的白色菌落的白色菌落pUC119-u6pUC119-u6培养基：培养基：AmpAmpX-galX-gal培养基：培养基：AmpAmpX-galX-gal33342024/5/21 周二35