基于网络药理学探讨桃核承气汤治疗脓毒症的潜在分子机制.pdf

网络药理学研究基于网络药理学探讨桃核承气汤治疗脓毒症的潜在分子机制吴科锐刘云涛华艳朗许 健王大伟(.广州中医药大学第二附属医院广东 广州.广州中医药大学广东 广州.广州中医药大学第一附属医院广东 广州)摘要 目目的的 基于网络药理学探讨桃核承气汤治疗脓毒症可能的活性成分、关键靶点及作用通路 方方法法 通过、数据库检索并筛选出桃核承气汤的活性成分及作用靶标检索、数据库获取脓毒症相关疾病靶标通过交集分析获得两者的共同靶标确定为桃核承气汤治疗脓毒症的潜在靶标应用 .软件构建中药 活性成分 潜在靶标调控网络 通过 .数据库对潜在靶标进行 分析并获取关键靶标应用 数据库对关键靶标进行 富集分析通过 .软件的 和 插件进行关键靶标的 通路富集分析 结结果果 最终获得 药物活性成分 个作用靶标 个脓毒症相关靶标 通过取交集获得桃核承气汤治疗脓毒症可能的潜在靶标 个对 网络进行分析最终获得 个关键靶标 富集分析在生物学过程、分子功能两个方面分别获得 个聚类结果在细胞组分方面获得了 个聚类结果 通路富集分析共获得 个相关通路 结结论论 桃核承气汤可能通过槲皮素、山柰酚、谷甾醇、芒柄花素、紫杉叶素、儿茶素、常春藤素等活性成分作用于、等靶标蛋白调节 、细胞分化、样受体、型凝集素受体、等相关通路进而影响炎症反应、细胞凋亡、免疫调节、血管屏障构建等生物过程而发挥治疗脓毒症的作用关键词 桃核承气汤脓毒症网络药理学分子机制:./.中图分类号.文献标识码 文章编号 ()通信作者 刘云涛 :.基金项目国家自然科学基金项目()广东省自然科学基金项目()广州市科技计划项目()广州市科技局基础与应用基础研究专题市校(院)联合资助项目()脓毒症()是指宿主对感染的反应失调导致危及生命的器官功能障碍综合征具有高致死率、高致残率等特点 据统计其住院病死率 为 由于病理机制复杂给脓毒症的临床救治带来诸多困难成为重症监护病房患者死亡的主要原因之一 中医药在脓毒症临床救治中受到一定关注 桃核承气汤出自伤寒论具有解毒逐瘀之效是脓毒症临证治疗中常用的方剂之一 研究显示桃核承气汤有助于控制脓毒症患者感染、凝血紊乱对降低病死率有一定的作用在常规治疗基础上联合桃核承气汤可降低脓毒症患者血清炎症因子水平抑制炎症反应 动物实验研究亦发现桃核承气汤可能通过减少 和 的表达进而下调 、等炎症因子的表达减轻脓毒症大鼠小肠组织炎性损伤 然而目前对桃核承气汤治疗脓毒症分子机制的研究仍处于初步探索阶段尚缺乏深入发掘 本研究拟立足于脓毒症的生物信息学相关数据应用网络药理学的研究方法对桃核承气汤治疗脓毒征潜在的分子机制进行挖掘为进一步阐明桃核承汤治疗脓毒症的药理机制提供参考为进一步挖掘桃核承气汤的药用价值奠定基础现代中西医结合杂志 ()材料与方法 桃核承气汤活性成分及作用靶标预测检索中药系统药理学分析平台(:/./.)、中医百全书数据库(:/././)获取桂枝、桃仁、大黄、甘草的活性成分及其对应的作用靶标 检索 数据库时以口服生物利用度()及类药性().为标准筛选中药的活性成分 检索 数据库时仅纳入类药性分级为中等及以上的活性成分 由于以上数据库未收录芒硝故通过检索中药分子机制的生物信息学分析工具(:/./)、中医药综合数据库(:/./)补充获取芒硝的化学成分及其作用靶标 通过.数据库(:/./.)及 数据库(:/./)将靶标蛋白名转化成对应的基因符号 脓毒症相关靶标预测以“”为检索词检索 数 据 库(:/./)获取、三个基因表达谱 以.为筛选标准通过 插件分析筛选出脓毒症与正常对照组的差异表达基因 检索 数据库(:/./)及 数 据 库(:/./)获取脓毒症相关疾病基因将以上获得的基因整合去重后确定为脓毒症的相关靶标基因 中药 活性成分 潜在靶标网络构建筛选桃核承气汤作用靶标与脓毒症相关靶标的共同靶标确定为桃核承气汤治疗脓毒症的潜在靶标 筛选出潜在靶标对应的活性分子及中药应用.软件(:/./)构建中药 活性成分 潜在靶标网络 蛋白质 蛋白质互作()网络构建 通过.数据库构建潜在靶标的 网络设置互作分数.隐藏游离靶标 将结果导入.软件对网络进行拓扑分析筛选网络中的关键节点 基因本体()富集分析将关 键 靶 标 输 入 (:/./)数据库进行 功能分析包含生物过程、细胞组分、分子功能三个方面 设置 为.为.为.对富集条目进行聚类 利用 数据分析平台(:/./)对富集分析结果进行可视化 京都基因与基因组百科全书()通路富集分析 通过 .软件的 和 插件进行关键靶标的 通路富集分析以.为阈值筛选富集的通路并进行聚类分析初步了解桃核承气汤治疗脓毒症可能的信号通路 结 果 药物活性成分及作用靶标的预测结果通过检索、数据库共获得桂枝相关活性成分 个大黄相关活性成分 个桃仁相关活性成分 个甘草相关活性成分 个芒硝相关活性成分 个整合去除相同的活性成分后共得到桃核承气汤相关的药物活性成分 个整合四个数据库获得的药物活性成分作用靶标最终共获得桃核承气汤相关活性成分作用靶标 个 脓毒症相关靶标预测结果整合、三个基因序列差异表达分析的结果去除重复后共得到差异表达基因 个检索、数据库分别获得脓毒症相关疾病基因 个、个 整合以上 个数据库获得的基因去除重复后共获得脓毒症相关靶标基因 个 中药 活性成分 潜在靶标网络构建结果 获取中药活性成分相关靶标基因与脓毒症相关靶标基因的交集共得到 个共同基因见图 个潜在靶标基因中 个与桂枝 个活性成分相关联 个与大黄 个活性成分相关联 个与桃仁 个活性成分相关联 个与甘草 个活性成分相关联 个与芒硝 个活性成分相关联 分别将对应的中药、活性成分及潜在靶标导入 .软件构建网络结果见图 菱形节点代表中药箭形节点代表药物活性成分椭圆形节点代表靶标 活性成分节点的颜色越深代表其作用的潜在靶标越多 大黄的活性成分中作用靶标最多的前 位分别为山柰酚()、()儿茶素()和 谷甾醇()其作用靶标分别有 个、个和 个 甘草的活性成分中作用靶标最多的前 位分别为槲皮现代中西医结合杂志 ()素()、山柰酚()和芒柄花素()其作用靶标分别有 个、个和 个 桂枝的活性成分中作用靶标最多的前 位分别为 谷甾醇()、紫杉叶素()和儿茶素()其作用靶标分别有 个、个、个 桃仁的活性成分中作用靶标最多的前 位分别为 谷甾醇()、儿茶素()和常春藤素()其作用靶标分别有 个、个和 个 芒硝两个活性成分为硫酸镁()和 硫酸钠()前者有 个潜在作用靶标而后者有 个潜在作用靶标图 桃核承气汤与脓毒症共同靶标韦恩图图 大黄 活性成分 潜在靶标网络 网络构建结果将 个潜在靶标基因输入.数据库选择物种为智人构建 网络 将网络导入 .软件对网络进行分析后以连接度()、介度()、紧密度()作为网络关键节点筛选指标筛选出连接度大于网络节点连接度 倍中位数且介度大于网络节点介度中位数、紧密度大于网络节点紧密度中位数的所有节点 最终共筛选得到 个关键节点 这些节点在网络中起着关键作用故可能是桃核承气汤治疗脓毒症的潜在关键靶标将 个关键节点对应的靶标基因再次输入 数据库以相同的方法构建 网络将结果导入.软件进行可视化结果见图 网络由 个节点 条边构成节点平均 为.节点的 越大则该节点越大颜色越深蛋白与蛋白之间的互作分数越大则节点之间现代中西医结合杂志 ()图 甘草 活性成分 潜在靶标网络图 桂枝 活性成分 潜在靶标网络连线越粗颜色越深 其中节点 排名前 的蛋白分别为()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、()推测这些靶标蛋白可能是桃核承气汤治疗脓毒症关键靶标中的重要部分 富集分析结果 个关键靶标基因输入 数据库进行 富集分析及 条目的聚类分析 在生物过程方面获取了前 个聚类对每个聚类中.最小的条目进行展示见图 个 条目分别是 结合转录因子活性的调节、对脂多糖的反应、炎症反应、白细胞分化、细胞对脂质的反应、细胞迁移的正调控、凋亡信号通路、现代中西医结合杂志 ()图 桃仁 活性成分 潜在靶标网络图 芒硝 活性成分 潜在靶标网络图 关键靶标的 网络现代中西医结合杂志 ()肽基丝氨酸磷酸化、细胞黏附的调节、肽基酪氨酸磷酸化、细胞蛋白质定位的调节、对生长因子的反应、活性氧代谢过程的正调控、细胞分化的负调控、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、对活性氧的反应、神经元死亡、对肽的反应、脂质定位的调节、水解酶活性的正调控 在分子功能方面获取了前 个聚类对每个聚类中.最小的条目进行展示见图 个 条目分别是 结合转录因子结合、细胞因子受体结合、激酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、磷酸酶结合、蛋白激酶活性、核心启动子序列特异性 结合、核受体活性、抑制转录因子结合、一氧化氮合酶调节活性、激素受体结合、激活转录因子结合、激酶活性、整合素结合、蛋白酶结合、蛋白质同二聚化活性、肿瘤坏死因子受体超家族结合、组蛋白脱乙酰酶结合、蛋白激酶 活性、支架蛋白结合 在细胞组分方面获取了前 个聚类对每个聚类中.最小的条目进行展示见图 个 条目分别是膜筏、囊泡腔、聚合酶转录调节复合物、受体复合物、细胞质核周区、富含 的颗粒、核膜、髓鞘、主轴、早期内体、谷氨酸能突触、体、核基质、内质网腔 通路富集分析结果通过图 潜在靶标的 生物过程富集分析.软件的 和 插件进行 个关键靶标的 通路富集分析结果聚类得到 个类别见图 每个类别中.最小的通路分别为 信号通路()、细胞分化()、丙肝()、样受体信号通路()、型凝集素受体信号通路()、乙肝()、信号通()、百日咳()、阿米巴病()、信号通路()及幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导()讨 论“热、毒、瘀、腑实、虚”是脓毒症发生发展过程中的重要病理因素以活血通腑法为代表的桃核承气汤在脓毒症的临床救治中使用取得了一定的疗效 为初步认识其治疗脓毒症的活性成分潜在靶点及可能的分子机制本研究通过网络药理学方法进行了分析 结果显示桃核承气汤可能通过多个活性成分作用于多个靶标调节多个信号通路而发挥治疗脓毒症的作用在药物成分上槲皮素、山柰酚、谷甾醇、芒柄花素、紫杉叶素、儿茶素、常春藤素等活性成分具有广泛的作用靶点可能在桃核承气汤抗脓毒症中发 挥重要的作用槲皮素、山柰酚、芒柄花素、紫杉现代中西医结合杂志 ()图 潜在靶标的 分子功能富集分析图 潜在靶标的 细胞组分富集分析叶素都属于黄酮类成分 黄酮类化合物具有一定的抗炎、抗氧化活性 既往研究发现山柰酚可降低脓毒症小鼠肺组织及血浆中的细胞因子 、和 的表达可能通过抑制氧化应激等作用减弱小鼠脓毒症诱导的急性肺损伤 在脓毒症动物模型中槲皮素可通过抑制 等促炎因子的释放发挥一定的抗炎作用可能通过激活磷脂酰肌醇 激酶()/蛋白激酶()/通路抑制心肌组织中 、等炎症因子的表达从而降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()现代中西医结合杂志 ()图 关键靶标的 通路富集分析脓毒症小鼠心肌组织炎症和氧化应激反应减轻心肌损伤 谷甾醇、儿茶素在脂多糖()诱导炎症反应模型中均显示出相应的抗炎作用 儿茶素的干预可显著抑制炎症模型中一氧化氮合酶()、环氧合 酶()、末 端 激 酶()的表达降低 、的 的水平可能通过抑制 和 调节途径而发挥抗炎活性 谷甾醇可阻止炎症因子(、)的释放下调 信号转导通路的活化从而减轻 诱导的小鼠急性肺损伤及炎症反应通过对作用靶标 网络进行分析最终共筛选得到桃核承气汤治疗脓毒症可能的关键靶标 个其中、等作用靶标可能是桃核承气汤治疗脓毒症关键靶标中的重要部分 通过文献研究发现这些靶蛋白主要参与炎症反应、细胞凋亡、免疫调节及血管屏障构建等、均属于丝裂原活化蛋白激酶家族的成员 家族广泛参与脓毒症各阶段的病理过程与炎症因子释放、内皮细胞活化、白细胞迁移及免疫细胞凋亡密切相关其对抗炎与促炎的复杂调控可能对脓毒症过程中炎症反应失衡具有重要意义其参与介导内皮细胞活化是脓毒症患者血流动力学紊乱组织灌注不足的机制之一 是信号转导与转录激活子的亚基之一 编码转录因子 这是转录因子家族 ()的一个亚单位而 是真核生物炎症反应的关键调控蛋白 、是脓毒症发生发展过程中关键的炎症因子当机体发生感染时位于单核细胞或巨噬细胞细胞膜或细胞器膜表面的模式识别受体通过识别病原体相关的分子模式从而激活随后的信号通路如 、/等从而介导 、等炎症介质的产生 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶而/信号通路的激活可以有效抑制细胞凋亡及炎症反应从而增强宿主对脓毒症的抵抗力 基因编码转录因子 研究发现脓毒症期间 调节 细胞中的转录因子 启动子活性从而介导 在 细胞中高表达 的稳态及高表达对 细胞分化、发育等过程至关重要而脓毒症期间 细胞对细胞活化的有效调节又是脓毒症免疫抑制的关键因素 是人表皮生长因子受体之一在炎症反应中 磷酸化能激活下游 信号通路、/信号通路最终激活 等转录因子促进 、等炎症因子的释放 研究表明在脓毒症期间 可能通过促进炎症因子现代中西医结合杂志 ()的产生及细胞凋亡介导相关的肾损伤 基因编码转录因子 在脓毒症细胞模型中、的表达升高而在 基因沉默的脓毒症模型中两者的表达降低且细胞的增殖受抑制 研究表明 可能通过抑制细胞凋亡和诱导细胞增殖参与 诱导的脓毒症过程并可能降低 诱导的脓毒症炎症反应 属于配体 酪氨酸激酶受体系统在脉管系统中广泛表达参与正常血管屏障的构建 在脓毒症期间 表达升高导致血管内皮屏障破坏和组织炎症血管渗漏和血容量不足、组织水肿、微循环流量改变最终导致对关键靶标的 富集分析结果显示桃核承气汤可能通过影响转录因子活性调节、对脂多糖反应、炎症反应、细胞分化、细胞凋亡等生物学过程调节转录因子结合、细胞因子受体结合、酶的结合、酶的活性等分子功能而发挥抗脓毒症效应其作用位点主要位于膜筏、囊泡腔、聚合酶转录调节复合物、受体复合物、细胞质核周区等细胞组分上进一步对作用通路进行分析发现 信号通路、细胞分化、样受体信号通路、型凝集素受体信号通路、信号通路等可能是桃核承气汤治疗脓毒症的关键通路 这些信号通路与炎症反应、细胞凋亡、免疫调节等机制密切相关 脓毒症时 信号通路相关基因紊乱表达进而促进炎症反应 在肺炎诱导的脓毒症中 信号通路被激活进而促进了细胞焦亡 肠功能障碍是脓毒症常见的并发症研究表明脓毒症期间小肠的运动障碍与小肠固有肌层内 信号传导的激活相关靶向 可以部分挽救小肠的活力减轻脓毒症期间 ()间质细胞的损伤 样受体和 型凝集素受体是模式识别受体()家族两大主要成员 前者属于细胞质 后者属于膜结合 脓毒症期间 样受体、型凝集素受体通过识别入侵人体的病原微生物进而激活下游 、等信号转导通路导致炎症因子及趋化因子的产生与释放介导相应的炎症反应 细胞与 细胞均由 细胞分化而成前者可分泌 、等促炎因子而介导炎症反应后者可分泌 等抑炎因子而发挥免疫抑制作用/细胞平衡维持着机体的免疫稳态而脓毒症免疫紊乱及多器官功能障碍的发生与/细胞失衡密切相关 缺氧诱导因子()是维持氧稳态重要的转录因子由含有 和 亚基的异源二聚体组成在哺乳动物中共发现了 、三个亚基 研究发现 参与了脓毒症的过度免疫与免疫耐受在脓毒症晚期单核细胞通过 信号通路而发挥免疫抑制效应综上桃核承气汤可能通过槲皮素、山柰酚、谷甾醇、芒柄花素、紫杉叶素、儿茶素、常春藤素等活性成分作用于、等靶标蛋白调节 、细胞分化、样受体信号通路、型凝集素受体信号通路、信号通路等进而影响炎症反应、细胞凋亡、免疫调节及血管屏障构建等生物学过程而发挥治疗脓毒症的作用 然而本研究仅是基于生物信息学的数据对桃核承气汤治疗脓毒症的可能分子机制进行初步挖掘与预测仍有待后期通过动物实验、细胞实验等对本研究结果进行进一步验证以更好阐明桃核承气汤治疗脓毒症的机制为进一步开发桃核承气汤治疗脓毒症的价值奠定基础利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 .().():.:.:.:.于中锴张宗旺菅向东.脓毒症的研究进展/.中华卫生应急电子杂志():.鲍丹艳.桃核承气汤对脓毒症患者凝血炎症网络部分因子的影响.广州:广州中医药大学.兰万成石丽飞李际强.桃核承气汤对脓毒症(血瘀腑实证)患者血清炎症因子水平的影响.时珍国医国药():.刘云涛王大伟杨荣源等.通腑活血法对脓毒症大鼠小肠组织的保护作用及机制研究.中国中医基础医学杂志():.:现代中西医结合杂志 ().:.:.():.:.:.:.():.:.():.:.():.:.():.:.():.:.:.:.():.():.王宜艳陈伟.从“毒”“瘀”“虚”谈脓毒症的中医治疗进展.中国中医急症():.张晓孟琼游楚明等.桃仁承气汤治疗 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