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RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)2010.03.28Northern blot 印迹杂交原理示意图印迹杂交原理示意图制制备待待测核酸核酸样品品分离、分离、变性、性、转移、固化移、固化RNA片段片段预杂交交制制备核酸探核酸探针标记核酸探核酸探针加入加入标记核酸探核酸探针核酸分子核酸分子杂交（固相交（固相杂交）操作程序交）操作程序杂交交漂洗去除未参与漂洗去除未参与杂交的交的标记探探针检测杂交信号交信号（一）（一）RNARNA的提取及质量检测的提取及质量检测pRNARNA的提取的提取p紫外吸收检测紫外吸收检测RNARNA的纯度和浓度的纯度和浓度1.1.取取RNARNA样品样品5ul5ul，用水稀释，用水稀释50-10050-100倍，转入分倍，转入分光光度计的石英比色杯中。光光度计的石英比色杯中。2.2.在在260nm260nm和和280nm280nm分别读出样品分别读出样品ODOD值。根据值。根据260nm260nm时时RNARNA浓度浓度=OD260=OD26040ug/ml40ug/ml稀释稀释倍数。倍数。3.3.若若OD260/OD280OD260/OD280小于小于2 2，说明可能有，说明可能有DNADNA片段污染，可用无片段污染，可用无RnaseRnase的的DnaseDnase处理样品处理样品。（一）（一）RNARNA的变性电泳的变性电泳原理：原理：RNARNA的二级结构使得的二级结构使得RNARNA不能严格按不能严格按 照其分子质量的大小在琼脂糖电泳中分离，照其分子质量的大小在琼脂糖电泳中分离，所以进行所以进行RNARNA电泳时，电泳时，RNARNA必须经过变性剂必须经过变性剂处理使二级结构解体，泳动时才能按分子质处理使二级结构解体，泳动时才能按分子质量大小分离。量大小分离。试剂：试剂：1010MOPS(0.2mol/L 3-N-MOPS(0.2mol/L 3-N-吗啉吗啉-丙磺酸；丙磺酸；0.05mol/L 0.05mol/L 醋酸钠；醋酸钠；0.01mol/L EDTA 0.01mol/L EDTA）、）、RNARNA上样上样缓冲液（去离子甲酰胺缓冲液（去离子甲酰胺0.72ml0.72ml；1010MOPS 0.16mlMOPS 0.16ml；37%37%甲醛甲醛0.26ml0.26ml；0.1%DEPC0.1%DEPC水水0.18ml0.18ml；80%80%甘油甘油0.1ml0.1ml；饱和溴酚蓝；饱和溴酚蓝0.08ml0.08ml、琼脂糖、琼脂糖、37%37%甲醛琼脂糖。甲醛琼脂糖。操作方法操作方法1%1%琼脂糖凝胶的制备：琼脂糖凝胶的制备：1g1g琼脂糖，琼脂糖，10ml 1010ml 10MOPSMOPS加加0.1%DEPC0.1%DEPC水至水至90ml90ml，微波炉煮沸，微波炉煮沸5min5min使胶溶解，使胶溶解，冷却到冷却到5050，加入，加入5mg/ml5mg/ml溴化乙锭溴化乙锭5ul5ul，混匀后倒入，混匀后倒入平板。平板。RNARNA样品处理：取样品处理：取10-20ug/ml10-20ug/ml的总的总RNA 1ulRNA 1ul，加入，加入15ul15ul上样缓冲液溶解上样缓冲液溶解RNARNA，95 95加热加热2min2min，使，使RNARNA变性后，迅速放置冰浴。变性后，迅速放置冰浴。用用20ul20ul的加样枪将样品依次加到样品孔，的加样枪将样品依次加到样品孔，1 1MOPSMOPS作为缓冲液，恒压作为缓冲液，恒压3-4V/cm3-4V/cm，3h3h后在紫外灯下观察结后在紫外灯下观察结果。果。RNARNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（三）（三）RNARNA的转膜的转膜n电泳后，用电泳后，用1 1MOPSMOPS缓冲液淋洗凝胶并将凝胶浸缓冲液淋洗凝胶并将凝胶浸泡于泡于1010SSCSSC中。中。n切去凝胶的无用部分并测量尺寸。将一张硝酸纤切去凝胶的无用部分并测量尺寸。将一张硝酸纤维素膜浸入水中，然后放入维素膜浸入水中，然后放入1010SSCSSC中。中。n将硝酸纤维素膜放入将硝酸纤维素膜放入2020SSCSSC中，用中，用20ml 2020ml 20SSCSSC浸泡印迹垫的底部。浸泡印迹垫的底部。n进行印迹，不能留有气泡。进行印迹，不能留有气泡。n印迹的原理为高盐溶液运输单链多核苷酸至滤膜印迹的原理为高盐溶液运输单链多核苷酸至滤膜上，微毛细管转移过程中，核酸与滤膜发生牢固上，微毛细管转移过程中，核酸与滤膜发生牢固的非共价结合。的非共价结合。Transfer system for Northern blot analysis 核酸分子杂交核酸分子杂交 定义定义:两条来源不同，但具有互补序列的核两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即为杂交。这个过程即为杂交。核酸探针核酸探针 是指带有标记的、已知碱基序列，是指带有标记的、已知碱基序列，能与特定的靶分子发生相互作用的能与特定的靶分子发生相互作用的DNADNA或或RNARNA片段。片段。核酸探针的类型核酸探针的类型（1）基因）基因组DNA探探针:为某一基因的全部或某一基因的全部或部分序列，或某一非部分序列，或某一非编码序列。序列。（2）c DNA探探针:以以mRNA为模板模板经逆逆转录酶催化催化产生的互生的互补于于mRNA的的DNA链。（3）RNA探探针:以以DNA两条两条链中的任意一条中的任意一条为模板模板转录生成生成RNA。具高。具高杂交效率，但易于交效率，但易于降解和降解和标记方法复方法复杂。（4）寡核苷酸探）寡核苷酸探针探针的标记探针的标记（一）、放射性（一）、放射性标记物物1.放射性放射性标记物物:常用的有常用的有32P、3H、35S 等放射性同等放射性同位素。位素。特点：特点：放射自放射自显影技影技术检测，信号的，信号的强弱通弱通过计数数银粒的多少易于粒的多少易于进行定量分析。行定量分析。主要缺点：主要缺点：射射线对人体有人体有伤害害放射性物放射性物质需特殊的需特殊的处理理半衰期短不宜存放使用半衰期短不宜存放使用2.非放射性非放射性标记物物:常用的有地高辛常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（）、生物素（biotin）、）、荧光素。光素。特点：特点：敏感性不如同位素敏感性不如同位素标记稳定性和分辨率高定性和分辨率高检测时间短短操作操作简便便不需特殊的防不需特殊的防护设备 不存在放射性不存在放射性污染染1、随机引物法（随机引物法（random primingrandom priming）利用利用DNADNA聚合酶来合成与模板互补的新聚合酶来合成与模板互补的新的的DNADNA链。链。将将6-86-8寡核苷酸片段与已变性的寡核苷酸片段与已变性的DNADNA单链单链或或RNARNA模板退火，使该片段随机互补结合模板退火，使该片段随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌在单链分子上，在大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I KlenowKlenow片段作用下，以同位素标记的片段作用下，以同位素标记的dNTPdNTP为原料，寡核苷酸为引物的为原料，寡核苷酸为引物的3 3-OH-OH端开始端开始沿沿5 5至至3 3方向，合成一条与模板互补的新方向，合成一条与模板互补的新DNADNA链。链。（二）、（二）、探针的标记方法探针的标记方法 2、切口平移法、切口平移法胰胰DNADNA酶酶I I在在DNADNA双链上随机切开若干切口，双链上随机切开若干切口，切口处形成切口处形成3 3-OH-OH末端。末端。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I以切口处开始作用，以切口处开始作用，以另一条以另一条DNADNA链为模板。链为模板。4 4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5 5端核苷酸和端核苷酸和3 3端修复加入标记核苷酸同端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移。时进行，切口平行推移。生成的两条链都被同位素均匀标记。生成的两条链都被同位素均匀标记。3、末端、末端标记法法末端末端标记法是将法是将标记物物导入入线型型DNA或或RNA的的5端或端或3端的一端的一类标记法。法。p5端端标记法法p3端端标记法法（1）5端端标记法（法（T4噬菌体多苷酸激噬菌体多苷酸激酶）用碱性磷酸用碱性磷酸酶切除切除DNA双双链分子或分子或RNA单链5末端的磷酸基末端的磷酸基团，使其成，使其成为5-OH，然后在（，然后在（-32P）ATP存在下，存在下，经T4噬菌体多苷酸激噬菌体多苷酸激酶催化，催化，将将位上的位上的32P转移到移到DNA或或RNA分子的分子的5-OH末末端，使端，使DNA片段或片段或RNA或寡核苷酸或寡核苷酸5端均端均带32P标记。T T4 4噬菌体多噬菌体多噬菌体多噬菌体多苷酸激苷酸激苷酸激苷酸激酶酶催催催催化化化化（2）3端端标记法（大法（大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶I Klenow片段）片段）大大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶I Klenow片段有片段有53DNA聚合聚合酶和微弱的和微弱的35外切外切酶活性，但活性，但无无53外切外切酶活性。活性。对残缺残缺3末端可末端可进行行标记。35kD76kD苦草杆菌蛋白酶苦草杆菌蛋白酶裂解酶裂解酶5 3外切酶外切酶5 3聚合酶聚合酶 3 5外切酶外切酶5 3聚合酶聚合酶 3 5外切酶外切酶Klenow片段片段DNA聚合酶聚合酶I全酶全酶（三）核酸的固定（三）核酸的固定1 1、烘烤：、烘烤：将膜夹在两张滤纸之间，80真空烘烤 2小时。2 2、紫外光固定：、紫外光固定：将膜携带RNA的一面暴露置于UV交联仪中，UV照射自动交联（四）（四）杂交交1、预杂交交（1）目的：减少非特异性）目的：减少非特异性杂交交（2）预杂交液：交液：6SSC、5Denhard氏溶氏溶液液(聚蔗糖聚蔗糖5g5g，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮5g5g，BSA 5gBSA 5g加水加水500ml500ml)0.5%SDS、100ug/L变性的性的鲑精精DNAn将预杂交液在杂交炉中将预杂交液在杂交炉中6868预热，并漩涡使预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。未溶解的物质溶解。n将膜置于装有预杂交液的杂交袋中（将膜置于装有预杂交液的杂交袋中（10ml10ml预预杂交液杂交液/100cm/100cm2 2膜）膜），封好杂交袋，封好杂交袋，4242预预杂交杂交4h4h。2、杂交交n将标记好的探针于将标记好的探针于 100100煮沸煮沸 10101515分钟，分钟，立即放冰浴冷却立即放冰浴冷却 1010分钟。用杂交液稀释成所分钟。用杂交液稀释成所需浓度。需浓度。n 将杂交袋中预杂交液倒出，加入将杂交袋中预杂交液倒出，加入 10ml 10ml 新鲜新鲜的的 HybHyb杂交液（杂交液（6565预热，已加入变性的探预热，已加入变性的探针针)，小心排尽气泡，封口，放，小心排尽气泡，封口，放 6565水浴振荡水浴振荡杂交过夜。杂交过夜。3、洗脱、洗脱杂交完成后，取出杂交膜，放入装有杂交完成后，取出杂交膜，放入装有 20mL 20mL 的的 2 2SSC/0.1%SDS SSC/0.1%SDS 溶液的平皿中，在室温下振溶液的平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每次荡洗涤两次，每次 5 5分钟。分钟。然后放入然后放入 0.10.1SSC/0.1%SDSSSC/0.1%SDS溶液溶液(先放先放 5050水水浴预热浴预热)中，中，5050水浴振荡洗涤两次，每次水浴振荡洗涤两次，每次 15 15 分钟。分钟。（五）（五）杂交信号的交信号的检测放射自显影放射自显影曝光：将滤膜用保鲜膜包住，固定在滤纸上曝光：将滤膜用保鲜膜包住，固定在滤纸上在暗室中在滤膜上覆盖一张在暗室中在滤膜上覆盖一张X X光片，并用两张光片，并用两张增感屏将滤膜和增感屏将滤膜和X X光片夹住，放在暗盒中，光片夹住，放在暗盒中，7070曝光曝光20min20min。显影、定影显影、定影非放射性杂交分子的检测非放射性杂交分子的检测应用应用DNA探探针检测特异特异mRNA的一种的一种杂交技交技术，主要主要用于分析用于分析mRNA的的转录或或mRNA分子大小。分子大小。GAPDH0d 2d 4d 6d 8dNorthern blot 杂交分析杂交分析mRNA的表达的表达三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较