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(完整版)CRISPR简介要点
自私基因元件(Selfish genetic element）对于原核生物（prokaryote）可不一定是一无是处的。我们都知道病毒可以通过重编程宿主细胞（reprogramming host cell）的方式进行大量复制，也可以像“偷渡客”一样整合到宿主细胞的基因组里潜伏起来伺机作乱；可接合质粒（conjugative plasmid，又称作转移性染色质外DNA)可以赋予宿主细胞新的优势特性，比如获得某种抗毒素因子，这样细胞就会像吸毒上瘾一样不愿意丢失这些质粒,还有很多这类外来DNA赖在细菌等细胞中不走的事例这里就不一一介绍了。不过细菌（bacteria）和古细菌（archaea）都有一套防御机制抵御这种外来的侵入性因子,这种防御机制就是在成簇的、有规律间隔的多次重复短片段(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR）的基础上建立起来的适应性免疫系统(adaptive immune system)。Jinek等人最新的研究成果发现，细菌细胞里的CRISPR效应酶蛋白Cas9因子不是通过一个RNA，而是一对小RNA分子来清除入侵的外源DNA片段。
CRISPR系统能够将各种外源的病毒或质粒DNA短片段“集中”到细胞基因组里某个特定的重复片段区域上，将这些外源DNA当作细胞曾经经受过外源DNA入侵的一种记忆给储存起来。然后这段DNA会转录生成CRISPR前体RNA（precursor CRISPR RNA)，前体RNA生成之后会被切割成一段一段的重复RNA片段,这些小RNA分子就是成熟的CRISPR RNA（crRNA）。然后crRNA会招募CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins， Cas）与各种被细胞记住的外源的入侵DNA或mRNA片段结合，将它们彻底摧毁。
科学家们是在大约5年前才开始了解到CRISPR的，当时他们发现如果将某种病毒的DNA片段掺入细菌之中，细菌就会对随后再次感染的同种病毒产生极高的免疫力。细菌就是从之前入侵的病毒DNA片段那里认识了这种病毒，从而获得了免疫力，当病毒再次入侵的时候细菌编码的Cas9因子就可以发挥作用，消灭来犯的病毒。但是当时还不清楚这种Cas9因子的具体作用机制。
科学家们首先需要解决的问题就是搞清楚Cas9因子是如何获得成熟的crRNA的。在大部分CRISPR-Cas系统里都少不了这样一位主角，那就是将CRISPR前体RNA切割成一小段一小段小RNA分子的专一性核酶（nuclease）。除了成熟的crRNA之外，这些Cas9因子还需要另外一种CRISPR特异性的小RNA(CRISPR-specific small RNA)的帮助，我们把这种小RNA称作反式激活的crRNA（tracrRNA）,因为这种小RNA刚好与crRNA的小片段互补,同时它们还是RNA特异性的宿主核糖核酸酶RNase III的底物。经过RNase III的切割之后，这一对互补的RNA（其中包括一条42bp的crRNA和一条75bp的tracrRNA）就可以充当Cas9因子的向导，帮助它“打鬼子”了.
Jinek等人就在此基础之上继续进行了更深入的研究，他们发现化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes）编码的Cas9蛋白也能够与细菌熟悉的入侵DNA结合，并将其降解。虽然我们知道切割位点只能由crRNA决定，但是科学家们却惊奇地发现,Cas9蛋白与目标DNA结合以及切割的过程还必须有tracrRNA分子的参与。也就是说，tracrRNA分子能够帮助Cas9-crRNA复合体在细胞复杂的DNA环境中精准地定位到入侵的DNA序列上,如附图所示。这也进一步说明小RNA分子的确是细胞里不可或缺的一份子.

瑞士军刀样的多功能蛋白。（A）Cas9蛋白需要crRNA和tracrRNA的共同帮助才能识别入侵的外来DNA分子,与之结合并将其降解。因为crRNA中的向导链部分可以与外源DNA的一条链互补并结合形成R环结构.在被识别区域两端的DNA基序也起到了非常重要的作用，它们可以帮助DNA链结旋打开双链，有利于crRNA链侵入。然后靶标DNA会在Cas9蛋白两个核酶结构域的作用下被切断。（B）级联反应复合体里含有一个crRNA,可是却最多携带了5种不同的Cas蛋白.所以它能够持续不断地招募核酶和解旋酶Cas3蛋白，不停歇地将入侵的外源DNA打开并切断.

Cas9蛋白能够凭借分子内的两个核酸酶结构域切割靶标DNA分子，形成平末端产物，其中每一个结构域负责切割靶标DNA分子R环状（R-loop）结构中的一条DNA链,具体来说，就是一个HNH核酶结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，RuvC核酶结构域负责切割另外一条DNA链.Jinek等人发现这种切割的效率非常高,而且不论靶标DNA分子是松弛型的，还是紧密的超螺旋型的都可以被毫不费力地被切割开,说明Cas9蛋白在细胞里是循环使用的，这样能保证在第一时间将所有来犯的入侵者全都消灭掉。
这种防卫机制虽然很有效率，但它也存在致命的阿喀琉斯之踵.比如病毒就可以通过突变的方式轻易地突破这道防线。Jinek等人在对这种突变DNA分子进行研究的时候发现Cas9蛋白对突变DNA的结合能力和切割能力都会大打折扣，这说明病毒完全能够应付细菌这套免疫机制,也说明细菌需要重新修正记忆内容才能够面对新一轮攻击.魔高一尺道高一丈，千百年来细菌与其寄生者之间就在不断地重复这套攻守流程,最后大家共同进化。
Jinek等人还敏锐地意识到这种高度特异性的由RNA介导的DNA核酶刚好可以被我们用来对基因组进行特异性的改造。从理论上来说，只需要一段20bp的crRNA做向导,核酶就可以在真核生物基因组的任意位置进行特异性切割。为了验证这个想法Jinek等人使用一个携带了绿色荧光蛋白GFP编码基因的质粒进行了实验。他们根据某个位点设计了一套crRNA和tracrRNA，结果Cas9蛋白就在预定位点准确地完成了切割任务。DNA断裂之后还激活了细胞内的DNA断裂修复机制，科学家们利用这种反应就可以对细胞内的某个基因进行破坏、插入或者修复等操作了。使用Cas9蛋白和crRNA在DNA上引入特异性断裂这样一套技术对我们现有的锌指核酶技术（zinc finger nucleases）和转录激活效应因子样核酶技术(transcription activator–like effector nucleases）等基因靶向操作技术（gene-targeting technologies)是一个很好的补充和完善，因为这些现有技术都需要针对每一个靶点重新设计核酶.有了这种基因改造和修复技术我们就可以对患者的病变细胞进行修复，然后再将修复好的细胞重新回输到患者体内，这样就可以对多种遗传缺陷疾病进行很好的治疗了。
和CRISPR系统里的其它效应分子相比，Cas9蛋白明显要重要得多，它是一个单一的、具有多种酶活性的蛋白,分子量通常介于350kD至450kD之间，最多的时候可以由11个亚基组成，编码Cas9蛋白的基因也有4至7个之多。可是这么庞大的一个蛋白却只有在结合了靶标DNA之后才会再招募其它亚基,使Cas9蛋白具有核酶活性。也就是说,Cas9蛋白就好像一把瑞士军刀一样，有很多的组成部件,所以也有众多的功能，CRISPR系统正因为有了这个多面手才能不惧任何外来的威胁.

原文检索：
Stan J。 J。 Brouns。 （2012） A Swiss Army Knife of Immunity. Science， 337：808—809.
YORK/编译

名词解释：
CRISPR/Cas (CRISPR associated systems)： CRISPR/Cas系统(CRISPR相关系统）， CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat)即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌(archaea）胞内起到了一种获得性免疫（acquired immunity)的作用。CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA进行序列特异性降解。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统,其中在2型系统（type II systems）中依赖的是Cas9蛋白。在RNA的介导下，Cas9蛋白能够对crRNA–tracrRNA识别的靶序列进行切割。

crRNA：CRISPR RNA能够与tracrRNA配对,形成双链RNA结构，这种双链RNA分子能够介导Cas9核酸内切酶对与双链RNA分子互补结合的DNA序列进行切割.

DSB：ZFN、TALEN以及CRISPR/Cas9系统对 DNA双链进行切割之后就会形成DNA双链断裂缺口(double—strand breaks)，即DSB。

tracrRNA：反式激活嵌合RNA(trans-activating chimeric RNA），这是一种非编码RNA,能够促进 crRNA的形成,也是Cas9蛋白发挥RNA介导的DNA切割作用必不可少的辅助因子。

噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer.
通常protospacer的5‘或是3’端延伸几个碱基序列很保守，被称为PAM (protospacer adjacent motifs），它的长度一般为2—5碱基，一般与protospacer相隔1— 4碱基.

Cas家族
Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近,是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用.
Cas9蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc核酸酶的活性,一个在中部有类似HNH核酸酶的活性

仅仅由向导RNA分子和Cas9蛋白组成的CRISPR系统就可以对基因组中特定的DNA序列进行外科手术式的精细改造，在特定的位置敲除、或者插入基因。最近还有人发现，对Cas9蛋白进行修饰之后还可以对特定的基因进行抑制（如左下图所示)或者激活（如右下图所示）操作。

基因组编辑采用人工核酸结合源性修复机制来改变细胞内的DNA。CRISPR/Cas系统充分利用了短gRNA的优势来靶向细菌Cas9核酸内切酶、定位遗传位点。由于gRNA能够提供特异性，更改靶标时,仅需要更改gRNA序列编码的设计。
基因编辑中所用的CRISPR/Cas系统包含三种组分：Cas核酸Cas9（双链DNA核酸内切酶)、一种靶向补充物crRNA以及一种辅助反式激活因子tracrRNA（图1）。GeneArt® CRISPR核酸载体的crRNA和tracrRNA都以gRNA的方式一同表达,其中gRNA则在细菌系统中模仿天然的crRNA—tracrRNA嵌合体.所有需要做的工作就是引入一个编辑所需的序列的双链寡核苷酸，以表达契合体的crRNA部分。

图 1. CRISPR/Cas9 靶向的双链断裂。双链上均出现断裂，发生在靶向序列3端NGG前间区序列邻近基序（PAM）序列的3碱基对上游。

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制,其中II型CRISPR/Cas免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。在这一系统中，crRNA（CRISPR—derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA（trans—activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA,其中Cas9的HNH核酸酶结构域剪切互补链，其RuvC—like结构域剪切非互补链.具体如下图所示:
 RNA介导的CRISPR/Cas9剪切系统（ Martin et al。 Science. 2012 AUG;337）

研究表明，CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和人类基因组特定基因位点进行精确编辑，这其中包括诱导多能干细胞 iPS等，不仅如此，CRISPR/Cas系统还可以同时针对同一细胞(ES）中的多个位点能实现多靶点同时酶切，人们运用该技术成功获得斑马鱼等模式动物基因敲除模型,使得多个基因敲除、敲入成为可能。

Cas9的基因组编辑能力是通过称作为“PAM”（ protospacer adjacent motif）的短DNA序列来实现的。这一研究揭示了PAM的两个主要功能，解释了它对于Cas9能够靶向和切割与导向RNA相匹配的DNA序列如此至关重要的原因。在外源DNA的靶向位点附近存在PAM，而宿主基因组的这些靶向位点则缺乏PAM,使得Cas9能够精确区分必须降解的非自身DNA和几乎完全相同的自身DNA。此外，存在PAM也是激活Cas9酶的必要条件。

窗体底端
CRISPR—Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的.在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群,细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫.这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。

CRISPR技术的优点就在于它使用的是单一的酶。这种酶不需要改变你设定目标的每一个点，你只需要使用一个不同的RNA副本对它进行重新编辑,这很容易设计和实现。
六、CRISPR/Cas应用展望
CRISPR/Cas系统最重要的应用可能体现在其为构建人类疾病动物模型提供了一种简单的方法，此外，这一技术在体内外靶向基因治疗、对各种微生物进行遗传学改造、生物能源或者生物制药等诸多领域具有极大的应用潜力，最近哈佛大学的一些研究人员发现CRISPR/Cas技术可能会存在一定的脱靶效应，即把不该切割的区域给切割了，后续的研究可能会集中在分析和解决可能产生的脱靶效应,提高系统效率和特异性上面来.

我们几乎可以利用 Cas9蛋白对任何一个基因进行遗传学改造,既可以利用Cas9蛋白的核酸酶功能将DNA链切断，使基因失活；也可以将DNA链切断之后在该位点插入一个新的基因。

控制Cas9蛋白的酶切活性，使其只能够在DNA链上切开一个小口，而不能将其彻底切断，这样就可以借助同源重组修复机制（homologydirected repair)在被切开的位点插入一个新的基因，该研究成果已经于今年的5月 2日发表在了《细胞》（Cell)杂志上。

此外,使用CRISPR技术还非常便宜。比如针对特定基因设计向导RNA的软件就是免费的;

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Broad研究所获得CRISPR/Cas9首个专利权
来源：生物360 / 作者：koo / 2014—04—210 / 2354 / 4 /

正在生物体内发挥功能的 CRISPR/Cas9 系统

4 月 15 日,麻省理工学院-哈佛大学博德研究所(Broad Institute of MIT and Harvard）宣布，美国专利局批准了由他们所申请的基于 CRISPR/Cas9 系统的基因编辑技术专利。这是目前世界第一例获得专利保护的基于 CRISPR/Cas9 系统的基因编辑技术。

所谓基因编辑技术，是指对 DNA 核苷酸序列进行删除和插入等操作，换句话说，基因编辑技术使得人们可以依靠自己的意愿改写 DNA 这本由脱氧核苷酸写而成的生命之书.然而长期以来，对 DNA 的编辑只能通过物理和化学诱变、同源重组等方式来对 DNA 进行编辑。然而这些方法要么编辑位置随机,要么需要花费大量人力物力进行操作。因此，能够方便而精确的对 DNA 和核苷酸序列进行编辑，是科研工作者们长期以来的梦想. CRISPR/Cas9 系统的诞生和成熟标志这这一梦想逐渐变为现实。此外不仅仅在科研界,在诸如医疗、农业、畜牧业等研究中，这一技术也显现除了巨大的应用前景。因此，这一技术获得专利，是该技术走向应用的里程碑式事件.

从细菌免疫系统到 DNA 编辑工具

CRISPR/Cas9 系统并非天生就是为人类使用而产生的。它的本质其实是细菌中一种对付诸如病毒等外来 DNA 的防御系统.在一些细菌基因组中存在一系列成簇排列的 DNA 序列，被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR).这些重复序列的间隔序列,被发现和很多能够侵入细菌的噬菌体 DNA 序列相同。进一步研究发现,这些序列在被转录成为 RNA 后,能够和细菌产生的一类称为 Cas 的蛋白质形成复合体，来对 Cas 蛋白起到导向作用，因此这段 RNA 也被称为导向 RNA （guide RNA , gRNA ).当复合体检测到入侵的 DNA 和 gRNA 序列一致时， Cas 蛋白就能够切割入侵的 DNA ,达到防御的目的.

注:严格来说，在细菌体内 gRNA 由两部分组成：一部分为活化 Cas 蛋白所需的tra crRNA ,另一部分为来自于间隔区、识别入侵 DNA 的 crRNA .在人工构建的 CRISPR/Cas9 系统载体中，这两段 RNA 可融合为一条.

CRISPR- Cas 系统这种序列特异性的 DNA 切割机制很快引起了人们的兴趣。由于这一系统能够切割 DNA ，并且其序列特异性由 crRNA 的序列所决定，因此它成为了 DNA 编辑的理想工具。细菌中的CRISPR— Cas 系统极为多样，而一个来自产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的由 Cas9 蛋白参与的系统被人们研究的最为透彻。因此人们对它进行了改造,将编码 Cas9 蛋白的序列及其附属元件共同制造成为一个单一的载体。同时为了能够让这些组分进入真核细胞的细胞核，还加入了入核信号元件。这样一来,只要科研人员只需针对需要编辑的 DNA 序列合成一段 DNA 序列,插入这个载体的特定部位。在转入宿主细胞后，产生的人工构建的 gRNA 就能指导 Cas9 蛋白切割宿主细胞特定的 DNA 序列，从而起到基因编辑的作用。

DNA 编辑的广泛前景

CRISPR/Cas9 系统,被称为第三代基因编辑技术.相比于它的两位前辈ZFN系统和TALEN系统，它有着一些无可比拟的优点：

首先, CRISPR/Cas9 系统的可用位置更多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用 CRISPR/Cas9 进行编辑的位置,可以说这一技术能对任一基因进行操作，而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点,这大大限制了使用范围.
其次， CRISPR/Cas9 系统更具有可拓展性，例如可以通过对 Cas9 蛋白的修饰，让它不切断 DNA 双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将 Cas9 蛋白连接其他功能蛋白,来在特定 DNA 序列上研究这些蛋白对细胞的影响。
第三，更为重要的是， CRISPR/Cas9 系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，而不需要向 ZFN 和 TALEN 那样借助商业公司的协助完成。