冬虫夏草不同生长阶段营养品质变化规律研究_贺元川.pdf

杂志，（）：高 丽，王 旭，张景景，等 法测定不同产地西红花中西红花苷 和西红苷 的含量 中华中医药学刊，（）：刘天亮，杨林林，董诚明，等 金银花不同采收期指纹图谱及成分变化情况研究 中药材，（）：刘润萍，王兴政，杨薇靖，等 海拔对秋直播当归生长动态及品质的影响 甘肃农业科技，（）：李 强，赵 瑜，张燕，等 光对药用植物影响的研究进展及其对生态种植的启示 现代中药研究与实践，（）：，（），（）：姚 冲，刘兵兵，周桂芬，等 影响西红花产量和品质的诸因素研究进展 中药材，（）：胡双，孙文静，徐双双，等 不同产地不同年份西红花含量的 法测定 时珍国医国药，（）：饶君凤，王根法，吕伟德 浙江省西红花“二段法”优质高产栽培技术研究 安徽农业科学，（）：戴 一 采收期对药用植物生物活性成分影响的研究进展 安徽农业科学，（）：王恩军，韩多红，张勇，等 采收期对河西走廊产板蓝根产量和品质的影响 中药材，（）：顾 岑，王华磊，赵致，等 种植密度及采收期对苗药艾纳香产量和品质的影响 中药材，（）：收稿日期：；修订日期：基金项目：重庆市科技局技术创新与应用发展专项（；）；重庆市自然科学基金面上项目（）；重庆市科技局社会事业与民生保障科技创新专项（）；重庆市中药研究院基本科研业务费项目（）作者简介：贺元川（），女（汉族），四川隆昌人，重庆市中药研究院副研究员，硕士学位，主要从事冬虫夏草的培殖研究工作通讯作者简介：陈仕江（），男（汉族），四川隆昌人，重庆市中药研究院研究员，学士学位，主要从事冬虫夏草培殖和开发利用研究工作冬虫夏草不同生长阶段营养品质变化规律研究贺元川，罗昌树，陈 康，陈仕江（重庆市中药研究院冬虫夏草研究所，重庆；重庆太极实业集团有限公司中药材资源中心，重庆）摘要：目的 探讨冬虫夏草不同生长阶段营养品质的变化规律，为合理采收和应用提供理论支持。方法 采用高效液相仪、气质联用仪、电感耦合等离子发射质谱仪、苯酚硫酸法等测定室内培殖的冬虫夏草子座不同生长阶段的核苷类、氨基酸、脂肪酸、重金属、总多糖和虫草素等营养物质的含量。结果 冬虫夏草中含有 种氨基酸，其中精氨酸和赖氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的含量占总氨基酸总量的 以上，精氨酸和谷氨酰胺含量随着子座生长逐渐上升，其他多种氨基酸含量先上升后下降；冬虫夏草中的不饱和脂肪酸中的油酸、亚油酸的含量占 种脂肪酸总量的 以上，多数脂肪酸表现为先下降后上升；室内培殖冬虫夏草的腺苷含量显著高于对照组的野生冬虫夏草，核苷类物质含量均表现出先下降后上升的变化趋势；各个生长阶段冬虫夏草中重金属的含量均符合中国药典标准，表现出先下降后上升的趋势；多糖含量随子座生长逐渐降低；虫草素除生长中期未检测到外，生长早期、生长后期室内培植冬虫夏草虫草素含量显著高于对照组野生冬虫夏草。结论 室内培殖冬虫夏草生长中后期，即子座略长于虫体、生长饱满，但是尚未产生子囊壳前采收，其营养成分相对较丰富，内在品质较优。该研究结果为冬虫夏草的合理采收和利用提供了重要参考价值。关键词：冬虫夏草；营养成分；变化规律；子座生长期 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）冬虫夏草 作为我国的名贵中药材之一，是中国被毛孢（俗称冬虫夏草菌）感染蝙蝠蛾科幼虫后致死所形成的虫菌复合体。该药材最早被收录于月王药诊并记载了其治疗肺部疾病的功效，清代本草本草备要中记载冬虫夏草具有保肺益肾、止血化痰的功效。现代研究表明冬虫夏草含有甘露醇、核苷、多糖、麦角甾醇、脂肪酸、氨基酸、虫草素等多种活性成分，具有双向免疫调节作用，在抗肿瘤、抗衰老等方面也具有良好的效果。冬虫夏草是冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾科幼虫后将其致死形成僵虫，并利用幼虫的营养生长发育，长出子座，最后形成虫菌复合体的一种名贵中药材，其子座生长阶段与冬虫夏草的质量密切相关。冬虫夏草主要生长在高山草甸和灌木丛，其子座生长受到植被高度、光照、温度、湿度等多个因素的影响，。目前市场上对冬虫夏草品质的分类更多采用外在的商品规格分类，一般认为“头草”优于“二草”“三草”，忽略了对内在品质的评价。现有研究仅开展了单一指标或因素的研究，尚未开展复合指标对冬虫夏草不同生长阶段的营养品质变化规律的研究，。版中国药典要求子座出土、孢子未发散时采收冬虫夏草，但未对子座长度、子座虫体比例作详细规定，对内在质量仅要求了重金属、腺苷的含量。近年来随着冬虫夏草人工培殖的成功，对营养物质变化的研究日渐深入，多数研究者以孢子弹射为分界点，忽略了孢子形成前子座生长对营养物质的影响。冬虫夏草子座生长需要以虫体为营养，因此冬虫夏草的营养成分含量随子座的生长呈现动态变化，导致不同生长阶段营养品质存在一定的差异。为了揭示室内培殖冬虫夏草子座不同生长阶段的营养品质变化，以期为冬虫夏草采收和利用提供全面参考，本研究以室内培殖的不同子座 虫体比例的冬虫夏草为研究对象，采用高效液相仪、气质联用仪、电感耦合等离子发射质谱仪、苯酚硫酸法检测核苷类、氨基酸、脂肪酸、重金属和总多糖等多类型指标，分析室内培殖冬虫夏草不同生长阶段品质变化规律，为指导冬虫夏草的采收及产品开发提供理论参考。材料与仪器 材材料料 以未产生子囊壳的子座占虫体长度比例作为分组标准，分为子座生长早期（：），子座长度约为 ；子 时珍国医国药 年第 卷第 期座生长中期（：），子座长度为 ；子座生长后期（：），子座长度约为 ，由太极集团康定虫草基地提供。对照组为基地外子座生长中期的野外冬虫夏草，所有样本均为鲜草。试试剂剂 氨基酸、脂肪酸标品和异硫氰酸苯酯（，纯度）；核苷和虫草素标准品（上海源叶生物，纯度）；级乙腈（，纯度）、级甲醇（，纯度）；优级纯的正亮氨酸，三乙胺、正己烷、无水乙酸钠、双氧水、硝酸、盐酸、硫酸和三氯甲烷和色谱纯的甲醇、正己烷及其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司；超纯水为默克 纯水系统自制。仪仪器器 高效液相色谱仪（北京普源精仪科技有限责任公司）；安捷伦 电感耦合等离子发射质谱仪（）（美国安捷伦科技有限公司）；（）气质联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；型数控超声波清洗器（昆山舒美超生仪器有限公司）；高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技仪器有限公司），旋涡混合器（赛默飞世尔科技仪器有限公司）；万分之一分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。方法 基基础础指指标标测测定定 含水量测定参考中国药典 版通则 第二法，灰分测定参考中国药典 版通则。氨氨基基酸酸种种类类和和含含量量测测定定 将冬虫夏草鲜样本液氮研磨成粉，称取 样本于 管中，加入 的 的盐酸溶液，混匀后，超声提取 ，期间取出摇晃数次，超声提取之后，离心 。取出上清液，膜过滤后，取过滤液 ，氨基酸标准品溶液 ，分别置于 管中；往每个离心管中准确加入正亮氨酸内标溶液 ；依次向每个 管中加入三乙胺乙腈溶液 （确保 ），异硫氰酸苯酯乙腈溶液 ，混匀后 下放置 ；然后加入正己烷 至每个 管中，摇晃后放置；取下层溶液，倍稀释后 针式过滤器过滤后上机检测。高效液相色谱仪，紫外检测器波长 。赛分色谱柱 （，），柱温：，流动相：称取 无水乙酸钠，加水，溶解后用冰醋酸调节 至 ，然后加入乙腈 ，混匀，膜过滤备用；流动相：乙腈水溶液。梯度洗脱：，；，；，；，；，；，流速：，按照进样体积：。样品中氨基酸浓度计算（）（样本中各氨基酸峰面积 内标峰面积）（混合氨基酸标准品溶液中各氨基酸峰面积 内标峰面积）混合氨基酸标准品中各氨基酸浓度。核核苷苷及及虫虫草草素素含含量量测测定定 将冬虫夏草样本液氮研磨成粉，称取 样本于 管中，加入 水进行超声提取，期间摇晃数次，离心 ，取上清液。吸取适量上清液后 针头式过滤器过滤后上机检测。高效液相色谱仪，检 测 波 长 为 ，反 相 色 谱 柱（，）柱温：，流动相 为水，流动相 为甲醇溶液，梯度洗脱，；，；，；，；，流速：，进样体积：。同时称取尿苷、肌苷、腺苷、虫草素标准品，用水溶解，配制成不同质量浓度的标准溶液，按照上述条件依次检测标准溶液峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算得到标准品曲线。将样品测定的峰面积带入标准曲线后计算对应核苷的含量。脂脂肪肪酸酸种种类类和和含含量量测测定定 准确称取液氮研磨后的 样品于 的离心管中；加入 的色谱甲醇浸泡，离心 ，取上清液；然后加入 的三氯甲烷混匀后浸泡 ，用注射器过滤，取下层液；各取 上清夜和下层液至离心管中混匀，用真空浓缩仪浓缩至干，加入 正己烷溶解；然后加入 氢氧化钾 甲醇溶液 ，摇匀，在 水浴加热，取出冷却至室温；加入 三氟化硼 甲醇溶液，摇匀，在 水浴加热 ，冷却至室温；加入 正己烷，充分振荡，静置，取上清液于安捷伦 气质联用仪 （）分 析。（）色谱柱，气化室温度：；分流比：；载气：氦气（）；流量：；柱温：初始温度；升温至，升至，保持；进样量：。同时按上述色谱条件依次检测各标准溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算得到各种标准品的标准曲线，将样品测定的峰面积带入标准曲线后计算对应脂肪酸的含量。重重金金属属含含量量测测定定 根据 法，准确称取样品（精确至），加入聚四氟乙烯消解罐中，加入 浓硝酸，过氧化氢，消解至澄清，冷却后，定容至 ，过滤，上机测定元素含量。多多糖糖含含量量测测定定 样本烘干粉碎，称取约 样本，加入 水，充分匀浆。水浴提取 （必须盖紧 盖子防止水分流失），冷却后 离心 ，吸取 上清，慢慢加入 无水乙醇，混匀后 静置过夜，离心，弃上清，沉淀中加入 水，充分混匀溶解沉淀，获得粗多糖溶液。根据苯酚 硫酸法，按照多糖试剂盒说明操作，于紫外分光光度计 波长下测定吸光度值，同时测定标准品无水葡萄糖的吸光度值，得到标准曲线 ，然后计算各样品多糖含量。数数据据分分析析 本研究除多糖外均以鲜草作为测试样本，将鲜草测定结果与对应的含水量换算后获得干品中各物质的含量，用于与药典指标对比。所有数据采用 版软件分析。结果 冬冬虫虫夏夏草草不不同同生生长长阶阶段段水水分分与与灰灰分分含含量量变变化化规规律律 从表 中可知，冬虫夏草子座生长过程中，含水量先呈现逐渐上升，处于子座生长中期的含水量最高，为 ，然后缓慢下降；灰分呈上涨趋势，其子座越长，其灰分越重，其子座生长后期组甚至超过了，显著高于野外冬虫夏草。由于冬虫夏草子座生长期对湿度要求较高，在高湿环境下更有利于子座生长，子座生长的旺盛阶段，可能随着子座生长，含水量越高。灰分来源于药材无机盐及表面附着的无机盐，室内培殖冬虫夏草的被膜较薄，现有的阴干刷净的方法可能会携带少量基质等，造成灰分含量偏高。但 版中国药典虽未对冬虫夏草的水分和灰分做明确的规定，但要求干燥保存。在目前的研究中发现冬虫夏草干品含水量高将影响其颜色及保存的质量，因此在保存冬虫夏草时一定采用低温干燥环境。表 不同生长阶段冬虫夏草的含水量和灰分测试指标水分灰分早期组 中期组 后期组 对照组 与对照组比较，极显著差异；显著差异 冬冬虫虫夏夏草草不不同同生生长长阶阶段段氨氨基基酸酸含含量量变变化化规规律律 如图 显示，不同生长阶段的冬虫夏草均含有除色氨酸外的 种人体必需氨基酸和包含鸟氨酸在内的 种非必需氨基酸，室内培殖的冬虫夏草必需氨基酸的含量显著低于野生冬虫夏草，非必需氨基酸中的精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸的含量显著高于野生冬虫夏草，各个时期的氨基酸总量低于野生冬虫夏草。各种氨基酸的含量受到饲料种类、饲养环境及生长阶段等的影响，谷氨酰胺和精氨酸随着子座生长逐渐增加，天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和除组氨酸外的必需氨基酸的含量呈现先上升后下降的变时珍国医国药 年第 卷第 期 化趋势，子座生长中期达到峰值，鸟氨酸随子座生长含量逐渐降低，其他氨基酸变化规律不显著。各个生长时期精氨酸和赖氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的含量占总氨基酸总量的 以上。图 不同生长阶段冬虫夏草的氨基酸含量 冬冬虫虫夏夏草草不不同同生生长长阶阶段段脂脂肪肪酸酸含含量量变变化化规规律律 测试结果如图 所示，冬虫夏草各个生长阶段均检测到 种 脂肪酸，其中 碳和 碳的脂肪酸种类最多，而青海冬虫夏草报道仅检测出 种脂肪酸。饱和脂肪酸中软脂酸和不饱和脂肪酸中油酸、亚油酸的含量最高，与青海冬虫夏草脂肪酸含量比例一致，三种脂肪酸随着子座生长呈现先降低后上升的变化规律，油酸和亚油酸占总脂肪酸含量的 以上。室内培殖冬虫夏草的脂肪酸含量显著低于野生冬虫夏草的脂肪酸含量，特别是油酸的含量仅为野外冬虫夏草的。青海等不同产地冬虫夏草其脂肪酸的含量存在明显差异，室内培殖冬虫夏草的脂肪酸含量与野生冬虫夏草差异显著可能与冬虫夏草生长环境密切相关。图 不同生长阶段冬虫夏草的脂肪酸含量 冬冬虫虫夏夏草草不不同同生生长长阶阶段段核核苷苷含含量量变变化化规规律律 核苷类成分是冬虫夏草的活性成分之一，版中国药典将腺苷作为中药材冬虫夏草指标性成分，并规定含量不得低于 。黄莉莉等人对传统商品规格划分的冬虫夏草进行了核苷类成分检测，发现不同商品规格的核苷类成分含量无显著差异，但不同产地的冬虫夏草的腺苷含量具有显著差异。本研究结果表明（如图）不同生长阶段冬虫夏草的核苷类成分的含量均高于对照组野生冬虫夏草，表现出先下降后上升的变化趋势。腺苷的含量明显高于尿苷和肌苷含量，并显著高于野外冬虫夏草，生长后期组的冬虫夏草的腺苷含量最高，约为对照组野生冬虫夏草的 倍。钱正明等人认为子座的腺苷含量高于虫体部分，是冬虫夏草腺苷的主要贡献部位。根据本次测定结果表明，在生长后期腺苷明显升高，可能与子座的比重增加有关。图 不同生长阶段冬虫夏草的核苷含量 冬冬虫虫夏夏草草不不同同生生长长阶阶段段多多糖糖、虫虫草草素素变变化化规规律律 多糖、虫草素是冬虫夏草的活性成分，表 显示冬虫夏草的多糖含量呈现不断下降的变化趋势，其子座短小组的多糖含量最高，为（），该变化趋势与冯慧琴等人报道结果相反。虫草素的含量为先下降后上升，可能因为含量低于检测限，子座生长中期组未检测到虫草素，但是随着子座生长，虫草素的含量显著上升，其子座生长后期的虫草素含量为子座生长早期的 倍，是对照组野外冬虫夏草的近 倍。由此可推测，冬虫夏草生长过程中有助于合成虫草素等次级代谢物，其虫草酸的合成也表现出类似的规律。杨丰庆等人在对不同虫草进行虫草素的检测时发现纯培养的冬虫夏草菌无法检测到虫草素，而天然冬虫夏草可检测到虫草素，这表明冬虫夏草菌在蝙蝠蛾幼虫这种特定培养基上培养有助于虫草素的合成。表 不同生长阶段冬虫夏草的多糖和虫草素含量测试指标多糖 虫草素 生长早期组 生长中期组 生长后期组 对照组 与对照组比较，极显著差异；显著差异 冬冬虫虫夏夏草草不不同同生生长长阶阶段段重重金金属属含含量量的的变变化化规规律律 从表 可知，不同生长阶段的冬虫夏草中的有毒重金属元素铅、砷、镉、铜的含量先下降后上升，虽然野外冬虫夏草检测出汞，但是含量显著低于国家药典限量标准。子座生长早期与生长后期均检出重金属铅，子座生长早期铅含量较高，但是随着子座生长，其含量发生明显变化，其生长中期低于检测限度未测出，但是生长后期又检测到铅，含量显著低于国家标准。各个生长阶段的冬虫夏草的铜和镉的含量均高于对照组，但是均低于国家限量标准，这表明冬虫夏草的繁育过程中，严格控制培殖过程及使用材料，适时采收可有效降低重金属的含量，严格控制重金属的污染，。表 不同生长阶段冬虫夏草的重金属含量实验组铜砷镉汞铅生长早期组 生长中期组 生长后期组 对照组 最大限量 与最大限量比较，极显著差异；显著差异 讨论冬虫夏草主要分布在青藏高原西南部地区，具有补肺益肾、止咳化痰等功效，现代研究发现冬虫夏草的有效成分主要包括虫草素、核苷类物质、虫草多糖、脂肪酸和氨基酸、虫草酸和甾醇，主 时珍国医国药 年第 卷第 期要发挥抗癌、免疫调节、抗氧化、抗衰老等药理活性。目前冬虫夏草的内在质量评价主要以腺苷标志性成分的含量与重金属含量作为评价指标，由于腺苷只是活性成分之一，为了更加全面评价冬虫夏草的质量，本研究通过测定室内培殖冬虫夏草子座不同生长阶段的核苷类、氨基酸、脂肪酸、重金属和总多糖等的含量，发现了各种活性物质随子座生长的变化规律。冬虫夏草主要含有腺嘌呤、胞嘧啶、胞苷、鸟苷、鸟嘌呤、鸟苷、次黄嘌呤、肌苷、胸腺嘧啶、胸苷等，腺苷含量西藏产冬虫夏草 青海冬虫夏草 四川冬虫夏草，其中子座腺苷含量最高，人工繁育冬虫夏草与野生冬虫夏草的腺苷含量无显著差异，。腺苷含量随着子座生长表现出先降低后上升，与报道的子座 的腺苷含量最高基本一致。不管是人工繁育还是野生冬虫夏草均检测到 种氨基酸，而虫体仅仅检测到 种，这表明冬虫夏草菌可利用虫体的营养物质转化合成更多种类氨基酸，丰富了冬虫夏草的氨基酸种类。冬虫夏草的脂肪酸以不饱和脂肪酸为主，其中油酸和亚油酸的含量占所有脂肪酸总量的 以上，饱和脂肪酸棕榈树酸、木焦油酸的含量最高，占脂肪酸总量的。不饱和脂肪酸的含量高于饱和脂肪酸，有助于冬虫夏草降低血脂和预防心血管疾病。多糖、虫草素是冬虫夏草发挥多种药理活性的重要成分，本次测定发现多糖随着子座的生长出现逐渐降低的趋势。虫草素在子座生长中期未检测到，但是生长后期虫草素的含量显著高于生长初期，推测多糖、虫草素是冬虫夏草菌合成的阶段性产物，不同生长时期的营养供给不同，导致含量存在显著差异。由于不同产区冬虫夏草的虫草样品，在虫草素的含量存在显著差异，推测本次样品检测到微量的虫草素，可能与培养环境、培养过程等密切相关。重金属是衡量中药材质量的重要指标，除中国药典未对砷做出限量外，其余均符合药典指标，不同生长时期对重金属的积累和降解程度不同，生长中期，重金属含量的降低，推测此阶段生长可降解少量重金属，但是生长后期，重金属含量明显提高，表明该阶段可能会富集重金属，因此选择合适的时机采收至关重要，防止重金属富集导致药材质量的降低。当前野生冬虫夏草采收季，很多商人以“头草”即子座刚出土，与虫体基本等长的冬虫夏草作为优质冬虫夏草，由于野外采收仅仅以外观品相为判断标准，缺乏在线活性成分的检测等，根据本次实验结果，综合多个指标综合考虑，室内培殖冬虫夏草子座生长后期（）冬虫夏草的品质更优，该结果与单一指标甾醇的评价结果一致，同时也符合中国药典对冬虫夏草的内在品质规定，推测野外冬虫夏草可能存在相似的变化规律，但因野外冬虫夏草生长的环境、来源更为复杂，其变化规律还需要进一步研究。本研究为室内培殖冬虫夏草采收期的选择从多个指标成分综合分析，提供了合理的数据支撑和科学参考。致谢：感谢甘孜州康定贡嘎中华虫草产业有限公司余瑞忠、吴波等对本研究中在室内培殖冬虫夏草工作给予的支持。参考文献：，（）：王 莹 古文献对冬虫夏草的记载考释 中国食用菌，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：钱正明，孙敏甜，李文庆，等 冬虫夏草不同生长阶段甾醇类含量分析 菌物学报，（）：钱正明，孙敏甜，周建桥，等 冬虫夏草不同生长阶段虫草酸含量比较分析 时珍国医国药，（）：国药药典委员会 中华人民共和国药典，四部 北京：中国医药科技出版社，：国家药典委员会 中华人民共和国药典，四部 北京：中国医药科技出版社，：慕 程，宁宝华，秦文平，等 甘肃关山产香棒虫草与冬虫夏草氨基酸比较分析 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