基于响应面法优化窖泥工艺提高己酸乙酯含量.pdf

基于响应面法优化窖泥工艺提高己酸乙酯含量邓桥山1,2,3，刘雅1,2,3，艾欢秀1,2,3，陈中道1(1.新疆伊力特实业股份有限公司，新疆835219；2.新疆建设兵团白酒工程技术中心，新疆8352193.白酒酿造技术与品质提升兵团重点实验室，新疆835219)摘要:为了提升窖泥质量，进而提高酿造浓香型白酒中己酸乙酯的含量，以新疆伊力特实业股份有限公司的窖泥为研究对象，利用单因素实验探究复合菌液、曲粉、黄水以及老窖泥添加量等因素对白酒中己酸乙酯含量的影响，在单因素的基础上，运用响应面法优化窖泥工艺，从而提高白酒中己酸乙酯的含量。结果表明：复合菌液添加量为 10%、曲粉添加量为 3%、黄水添加量为 25%时，在此条件下所酿白酒中己酸乙酯含量最合适，口感最协调，得分最高。关键词：老窖泥；己酸乙酯；复合菌液；单因素试验；响应面法中图分类号：TS262.3；TS261.4文献标识码：BOptimization of Cellar mud Process Based on Response Surface Method toImprove Ethyl Acetate ContentDENG Qiaoshan1，2，3,LIU Ya1，2，3,AI Huanxiu1，2，3,CHEN Zhongdao1(1.Xinjiang Yilite Industrial Co.Xinjiang Yilite Industrial Co.Xinjiang 835219,China;2.Xinjiang Construction Corps White Wine Engineering Technology Center Xinjiang 835219,China;3.Key Laboratory of White Wine Brewing Technology and Quality Improvement Corps Xinjiang 835219,China)Abstract:In order to improve the quality of the cellar mud,and then improve the content of ethyl caproate in the brewing of strong fragrantwhite wine,the cellar mud of Xinjiang Elite Industrial Co.,Ltd.was used as the object of research,and the effect of the compound bacterialsolution,bent powder,yellow water and the addition of old cellar mud on the content of ethyl caproate in white wine was investigated usingsingle-factor experiments.The results showed that The results showed that the ethyl caproate content in the white wine made under theconditions of 10%addition of compound bacterial solution,3%addition of bent powder and 25%addition of yellow water was the mostsuitable,and the taste was the most harmonious with the highest score.Key words:Old cellar clay,Ethyl caproate,Compound bacterial solution,Single-factor test,response surface methodology浓香型白酒是我国四大香型酒之一，而窖泥是浓香性白酒酿造的基础，其质量的优劣直接影响到所产基酒的质量1-2。窖泥中富含丰富的微生物菌系，其中主要起重要作用的有己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、硫酸盐还原菌和硝酸盐还原菌等。正是由于这些有益功能菌的大量生长、繁殖、代谢以及相互协调作用，才赋予了白酒独特的香型，造就了以己酸乙酯为主体香的浓香型白酒典型风格3-6。因此，窖泥质量优劣对浓香型白酒的质量起着至关重要的作用。本文以新疆伊力特实业股份有限公司的窖泥作为研究对象，从窖泥理化性质、窖泥微生物群落结构及多样性研究，优化窖泥工艺，提高白酒中己酸乙酯含量从而提升酒体品质，为打造出地方特有品牌文化酒提供理论依据。1材料与方法1.1实验材料与试剂1.1.1实验材料复合己酸菌液：由新疆伊力特实业股份有限公司各分厂优质老窖泥中分离得到；窖泥样品：该实验中所用窖泥样品均来新疆伊力特实业股份有限公司各分厂。收稿日期：2023-03-24作者简介：邓桥山（1991-），男，福建上杭县人，助理工程师，生物工程，主要从事窖泥及微生物分析，邮箱：.文章编号:1002-8110（2023）05-0051-05第 50 卷 第 5 期2 0 2 3 年 9 月酿酒LIQUORMAKINGVol.50.5Sep.，2023511.1.2实验试剂实验过程中所用到的试剂如表 1 所示：1.2主要仪器实验过程中所用到的仪器见表 2。1.3培养基的制备巴氏培养基的制备：葡萄糖：0.1%，MnSO4：0.001%，KH2PO4：0.05%，FeSO4：0.001%，K2HPO4：0.05%，酵母粉：0.1%，MgSO4：0.02%，蛋白胨：0.01%，NaCl：0.001%，蒸馏水 100%，pH7.0，经高压蒸汽灭菌，温度为 121，时间为 15 min。灭菌后冷却到 35时，接种前加入经干热灭菌的0.5%碳酸钙和 2%无水乙醇。1.4实验方法1.4.1种子液的制备对前期从各分厂优质老窖泥中分离得到复合己酸菌液，85水浴加热 10 min，按 10%接种量接种到磨口三角瓶进行活化，并将活化后的复合菌液按 10%接种量进行扩大培养，作为种子液。1.4.2己酸乙酯定量分析根 据 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 标 准GB/T1034-2022 食品安全国家标准 白酒分析方法7，并稍加优化检测试验白酒中己酸乙酯的含量。待测样品定容 10 mL 容量瓶并加入 2 L 内标，将 1 mL 处理好的样品置于进样瓶中并密封。气相色谱条件：毛细管色谱柱（30 m0.25 mm0.25m）。检 测 器 温 度 280，进 样 口 温 度250，柱温起始温度 48，恒温 1 min，以 3.5/min升温至 70，然后以 5/min 升温至 200，恒温6min，载气：氮气（N2），流速 1 mL/min，火焰离子检测器（FID）。进样量：1 L，分流比：431。1.4.3制作窖泥工艺流程及操作要点工艺流程：选土土壤检测基质土晾晒堆积测方粉碎配料拌和一次浸泡发酵和泥机二次配料拌和转入发酵池堆积发酵检测入窖使用具体操作：先将所选优质基质土壤风干，用粉土机械将基质土打成细粉状，过 20 mm 目筛，平铺在地面上；再将泥炭、曲药、磷酸氢二钾、硫酸铵、磷酸二铵等原料混和均匀后，撒在基质土上，然后将其搅拌均匀；将上述混合材料堆成适宜高度的方形，然后将黄水加入其中浸泡，浸泡透后，将酵母膏用温水化后混合在材料上，再依次加入酒精、复合己酸菌液，用和泥机搅拌，在搅拌时不断加入菌液和黄水，把水分控制在 30%45%，搅拌均匀后转入窖泥发酵池；盖上塑料薄膜保温保湿，插上温度计，发酵两个月左右。1.4.4窖泥优化的单因素实验在进行优化窖泥工艺单因素试验之前先确定基础工艺条件：复合菌液 9%，曲粉 3%，黄水 20%，老窖泥添加量 0.1%，考察复合菌液添加量、曲粉添加量、优质黄水添加量、老窖泥添加量 4 个工艺因素所和出的窖泥对酿造浓香白酒中己酸乙酯含量的影响。实验过程中分别选取复合菌液添加量为：8%，9%，10%，11%，12%；曲粉添加量为：1%，2%，3%，4%，5%；优质黄水添加量为：23%，24%，25%，26%，27%进行单因素试验，最终以发酵白酒中己酸乙酯含量及感官品评为得分指标，确定最佳试验参数。1.4.5响应面优化设计在单因素试验基础上，选择复合己酸菌液添加量（A）、曲粉添加量（B）及黄水添加量（C）3 个因素进行响应面优化试验，以使用窖泥所酿浓香白酒中己酸乙酯含量（Y）为响应指标，确定窖泥的最佳工艺条件，因素及水平如表 3 所示。表 1主要试剂名称磷酸氢二钾（AR）无水乙酸钠（AR）硫酸铵（AR）硫酸镁（AR）酵母粉（AR）碳酸钙（AR）无水乙醇（AR）生产厂家天津市永晟精细化工有限公司天津市永晟精细化工有限公司天津市永晟精细化工有限公司天津市盛奥化学试剂有限公司天津市盛奥化学试剂有限公司天津市鑫铂特化工有限公司天津市鑫铂特化工有限公司表 2主要仪器名称DZKW-S-8 电热恒温水浴DHG-9140A 干燥箱XY1000-2C 电子天平5430R 高速冷冻离心机8890 气相色谱仪HP-INNOWAX 毛细管色谱柱（30 m0.32 mm0.25m）DHP-9052 恒温培养箱TPY-16A 土壤检测仪生产厂家北京市永光明医疗仪器有限公司上海诵诚实业发展有限公司常州市幸运电子设备有限公司艾本德 Centrifuge美国 Agilent 公司美国 Agilent 公司南京贝登电子商务有限公司浙江托普云农科技股份有限公司第五期2023酿酒52邓桥山，等：基于响应面法优化窖泥工艺提高己酸乙酯含量第五期20231.4.6理化指标的检测与感官评分1.4.6.1窖泥感官指标及理化指标检测方法对优化后的窖泥主要以感官评价以及窖泥中理化指标综合评定窖泥质量（总分 100 分，其中感官评价 60 分，理化指标 40 分），窖泥感官评价主要通过人工观察窖泥的色泽、气味和手感来判定，理化指标中水分、pH 的测定参照 白酒生产技术全书 窖泥分析8，并根据实际情况稍加调整；氨态氮、有效磷、有效钾及腐殖质主要通过土壤分析仪来检测；微生物含量主要利用血球计数法检测，具体感官指标及理化指标见表 4 和表 5。1.4.6.2白酒感官品评在公司组织 11 位评委对所酿白酒进行感官品评，其中 6 位国家级白酒评委和 5 位省级白酒评委。1.4.7数据处理所有的数据均重复测定 5 次，实验结果采用Excel 2019、Design-Expert8.0.6 软 件，使 用 Box-Behnken 方法进行响应面分析，图由 Origin 2018 绘制。2结果与分析2.1响应面分析因素及水平的选择根据前期单因素实验以及对文献的查阅，在其它条件不变的前提下，选取复合菌液的添加量、曲粉添加量以及黄水添加量这三个因素进行优化组合，以所酿浓香白酒中己酸乙酯含量为响应值，通过 Design-Expert8.0.6 软件中 Box-Behnken 法进行响应面分析，并得到响应面设计结果与方差分析结果，如表 6、表 7 所示。表 3因素水平设计表因素A：复合菌液B：曲粉C：黄水-19%2%24%水平010%3%25%111%4%26%项目色泽（20）气味（30）手感（10）评分152051505253010250105103503标准要求灰褐色或灰黑色，无黄泥色黄褐色，由黄泥色约占 30%黄色，黄泥色占 50%香气纯正、有酯香、酒香及浓郁的老窖泥气味、且香味持久香气纯正、有酯香、酒香及老窖泥气味、且香味持久香气纯正、无其他氨味、酸败味、霉味、生泥味等异杂味柔熟细腻、无刺手感、有一定粘稠感较柔熟细腻、刺手感微弱，有一定粘稠感柔熟感一般、刺手明显、微带粘稠感表 4窖泥感官评判标准表 5窖泥理化指标评判标准项目水分pH微生物氨态氮有效磷有效钾腐殖质单位%万个mg/100g 干土mg/100g 干土mg/100g 干土%指标范围35455.57.2603010030100258026表 6响应面实验设计结果实验号1234567891011121314151617因素B-1-1110000-11-1100000A-11-11-11-11000000000C0000-1-111-111000000己酸乙酯含量/mg （100mL）-1897695.889.4118.1125.6114.695.397.3106.383.4105.9182.9189.5189.3182.6188.4项目模型ABCABACBCA2B2C2残差失拟项误差总和R2R2ADj变异系数/%精密度平方和28931.58121.68334.11289.2010.89179.5645.567394.6913719.244107.24119.3270.7148.6129050.900.99590.99060.958435.054自由度911111111173416均方3214.62121.68334.11289.2010.89179.5645.567394.6913719.634107.2417.0523.5712.15F 值188.587.1419.6016.970.6410.532.67433.80804.84240.951.94P 值0.00010.03190.00310.00450.45040.01410.14610.00010.00010.00010.2650显著性*表 7响应面结果的方差分析注：*表示差异性极显著，p0.01；*表示差异性显著，p0.05。53由表 7 可知，二次回归模型的 P0.0001，说明回归方程有极显著性差异，能够很好的模拟出真实曲面 BCA；相关系数 R2=0.9959，代表该模型拟合度良好，误差小；失拟项中 F=1.94，P=0.2650，二者均大于 0.01，差异不显著，说明模拟性较好；表中 P 值反映了不同因素对感官评价不同程度的影响，P 值越小，对感官评价影响程度越大9-10，因此在此模型中各因素对感官评价影响程度大小的次序为曲粉添加量（B）黄水添加量（C）复合菌液添加量（A），其中 AB、BC 项对感官品评的影响不显著（p0.05）；AC 项对感官品评的影响显著（p0.05），A2、B2、C2等项对感官品评的影响极显著（p0.01）；变 异 系 数 0.9584%10%，精 密 度 为35.0544，表明该模型有较高的精密度，进一步证明该模型对窖泥工艺优化的预测具有较高的可信度。2.1.2响应面试验交互作用分析为了更直观反应因素 A、B、C 之间的交互作用对 Y 的影响，利用 Design Expert 8.0.6 软件绘制了各因素与响应值之间的三维曲面图和等高线分析图，见图 1。图 1（a）、（a，）为复合菌液添加量和曲粉添加量的响应曲面及等高线图，（b）、（b，）为复合菌液添加量和黄水添加量的响应曲面及等高线图，（c）、（c，）为黄水添加量和曲粉添加量的响应曲面及等高线图，根据响应面试验设计的原理，响应面图的曲面越陡峭，两个因素之间的相互作用就越明显，相反，响应面图的曲面越平缓，两个因素之间的相互作用就越不显著11。根据图 1 可以看出，当一个因素添加量一定时，白酒中己酸乙酯含量先增加后减少；其中复合菌液添加量和曲粉添加量的交互作用存在显著性差异（p0.05），曲粉添加量对于白酒中己酸乙酯含量的影响更显著；曲粉添加量和黄水添加量的交互作用及复合菌液的添加量和黄水添加量的交互作用有差异，但差异不显著（p0.05），其中对白酒中己酸乙酯含量影响大小顺序为曲粉添加量大于复合菌液添加量，黄水添加量大于复合菌液添加量，曲粉添加量大于黄水添加量，与 2.1 中响应面结果的方差分析一致。2.1.3响应面验证试验根据响应面软件分析出最佳工艺条件：复合菌液添加量为 9.996%，曲粉添加量为 3.05%，黄水添加量为 24.91%。根据实际情况将添加量调整为10%、3%、25%，在此工艺条件下白酒中己酸乙酯的含量为 187.818mg/100mL，与预测结果基本吻合。因此采用响应面法优化窖泥工艺得到的工艺条件准确可靠，可以用于实际操作。2.2感官品评结果分析对使用该窖泥得到的白酒进行感官品评，品评人员主要通过窖香、酒香、花果香、杂味、丰富度 5个属性进行感官评价，结果见图 2。由图 2 可知，两种结果存在显著性差异（p0.01），综合之下改良后的窖泥得到白酒口感更加协调，得分更高。2.1.1响应面方差及显著性分析结果应用 Design-Expert 8.0.6 软件对实验数据进行多元二次拟合，建立己酸乙酯含量（Y）和复合菌液添加量（A）、曲粉添加量（B）、黄水添加量（C）的回归方程：Y=186.54-3.9A+6.46B-6.01C+1.65AB-6.7AC+3.38BC-41.91A2-57.08B2-31.23C2B：曲粉添加量/%A：复合菌业添加量/%20018016014012010080601.000.500.001.000.500.00-0.50-0.50-1.00-1.001.000.500.00-0.50-1.00-1.00-0.500.000.501.00A：复合菌业添加量/%（a）1.000.500.00-0.50-1.00-1.00-0.500.000.501.00A：复合菌液添加量/%A：复合菌液添加量/%20018016014012010080601.000.500.001.000.500.00-0.50-0.50-1.00-1.00C：黄水添加量/%（b）B：曲粉添加量/%C：黄水添加量/%20018016014012010080601.000.500.001.000.500.00-0.50-0.50-1.00-1.00B：曲粉添加量/%1.000.500.00-0.50-1.00-1.00-0.500.000.501.00（c）图 1各因素交互作用对白酒中己酸乙酯影响的响应面图己酸乙酯含量/mg （100mL）-1己酸乙酯含量/mg （100mL）-1己酸乙酯含量/mg （100mL）-1第五期2023酿酒54分布研究J.酿酒科技,2011,(02):36-39+42.12张良，张宿义，许德富，等.泸州老窖古酿酒作坊内外环境空气细菌的分析与鉴定J.酿酒科技,2009,(11):49-52.13李宗珍，张宿义，许德富，等.泸州老窖古酿酒作坊夏季空气真菌分布特征J.应用与环境生物学报,2010,16(01):109-113.14饶家权，杜礼泉，唐聪，等.丰谷酒业酿酒区域空气中微生物分布状况的研究J.酿酒,2018,45(06):74-78.15杨开梅，胡峰，胡建锋，等.浓香型习酒酿造环境中细菌多样性的研究J.酿酒科技,2015,(10):51-54.16 胡小霞.茅台镇酱香型白酒酿造环境微生物群落结构研究D.贵州大学,2019.17凌琪，包金梅，李瑞，等.Biolog-Eco 解析黄山风景区空气微生物碳代谢多样性特征 J.应用基础与工程科学学报,2012,20(01):56-63.18张乐满，兰波，许文锋，等.基于 Biolog-ECO 对三峡水库消落区优势植物根际微生物功能多样性的研究 J.微生物学杂志,2022:1-12.19李志斐，王广军，谢骏，等.草鱼养殖池塘生物膜固着微生物群落碳代谢 Biolog 分析J.水产学报,2014,38(12):1985-1995.20Wang Xuekai,Cao Xinxin,Liu Han,Guo Linna,Lin Yanli,Liu Xi-aojing,XiongYi,NiKuikui,YangFuyu.EffectsofLacticAcidBacteriaonMicrobialMetabolicFunctionsofPaperMulberrySilage:A BIOLOG ECO Microplates ApproachJ.Frontiers inMicrobiology,2021,12.21李慧，李雪梦，姚庆智，等.基于 Biolog-ECO 方法的两种不同草原中 5 种不同植物根际土壤微生物群落特征 J.微生物学通报,2020,47(09):2947-2958.22田雅楠，王红旗.Biolog 法在环境微生物功能多样性研究中的应用J.环境科学与技术,2011,34(03):50-57.23王雪梅，黄利群，刘成，等.基于 Biolog-ECO 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