当归MADS-box生物信...学及SOC1克隆与表达分析_崔秀文.pdf

中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 1551 当归 MADS-box 生物信息学及 SOC1 克隆与表达分析2 崔秀文1，刘 迪1，黄天苗1，李美玲1，栗孟飞1*，魏建和2*1.甘肃农业大学生命科学技术学院 干旱生境作物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730070 2.中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193 摘 要：目的 对当归Angelica sinensis MADS-box 基因家族进行筛选与生物信息学分析，并对SOC1-4 基因进行克隆与表达验证。方法 基于当归全长转录组筛选 MADS-box 基因家族，利用在线工具进行生物信息学分析，并利用qRT-PCR 检测SOC1-4 基因在不同材料中的表达水平。结果 当归全长转录组中含有29 个MADS-box 基因家族成员，可分为 10 个亚家族，共含有 6 个保守基序，蛋白质序列长度为49422 aa，相对分子质量为 5 697.5649 624.90，等电点为 5.0611.00，亚细胞结果显示当归 MADS-box基因家族成员分别定位于叶绿体、细胞核、细胞质和线粒体，二级结构预测及3D 建模显示同一亚家族结构相似；SOC1-4 基因克隆片段与全长转录组测序结果一致；SOC1-4 基因随种苗春化作用和植株发育时期延长呈现高表达，在抽薹植株、茎和叶中高表达，而在冷冻规避春化作用种苗中呈现低表达。结论 当归含有29个MADS-box成员，各成员理化性质和结构存在一定的差异，SOC1-4基因表达水平与当归抽薹开花生理调控一致，为当归 MADS-box 基因家族调控抽薹开花相关研究提供借鉴。关键词：当归；MADS-box；生物信息学；SOC1-4；基因克隆；抽薹开花 中图分类号：R286.12 文献标志码：A 文章编号：0253-2670(2023)05-1551-10 DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2023.05.022 Analysis on MADS-box bioinformatics,SOC1 clone and expression pattern in Angelica sinensis CUI Xiu-wen1,LIU Di1,HUANG Tian-miao1,LI Mei-ling1,LI Meng-fei1,WEI Jian-he2 1.State Key Laboratory of Aridland Crop Science,College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China 2.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100193,China Abstract:Objective To screen and analyze MADS-box gene family bioinformatics of Angelica sinensis,clone the SOC1-4 gene and perform bioinformatic analysis.Methods The MADS-box gene family was screened based on the full-length transcriptomes of A.sinensis,the bioinformatics was analyzed using the online tools,and the expression levels of SOC1-4 gene in different materials were validated by qRT-PCR.Results A total of 29 MADS-box gene family members were identified from A.sinensis,with 10 subfamily classified and six motifs included;the sequence length of MADS-box proteins ranged from 49 to 422 aa,the relative molecular mass ranges from 5 697.56 to 49 624.90,and the isoelectric point ranged from 5.06 to 11.00;the sub-cellular results showed that the members of the A.sinensis MADS-box gene family was located in the chloroplast,nucleus,cytoplasm and mitochondria;and secondary structure prediction and 3D modeling indicated that there was a similar structure for the same subfamily.The cloned fragment of the SOC1-4 gene was consistent with the full-length transcript.The SOC1-4 gene were over-expressed with the extension of seedlings vernalization and plants development,as well as in bolted plants,stems and leaves,respectively;while down-regulated in the seedlings with frozen-avoided vernalization.Conclusion There are 29 MADS-box gene family members in A.sinensis,and certain differences exist in physical and chemical properties and structure among the 29 members;the expression levels of SOC1-4 gene are in accordance with the physiological regulation of bolting and flowering of A.sinensis,The 收稿日期：2022-08-09 基金项目：国家自然科学基金项目（32160083）；干旱生境作物学国家重点实验室（甘肃农业大学）基金项目（GSCS-2021-Z03）；道地药材生态种植与质量保障项目（202103003）；财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系（CARS-21）作者简介：崔秀文（1996），女，甘肃靖远人，在读硕士研究生，主要从事当归抽薹开花调控方面研究。E-mail:*通信作者：栗孟飞（1980），男，河南驻马店人，博士，教授，主要从事药用植物学研究。E-mail: 魏建和（1970），男，福建建阳人，博士，教授，主要从事药用植物栽培、分子育种和次生代谢产物调控研究。E-mail: 1552 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 results will provide theoretical basis of MADS-box gene family for regulating bolting and flowering of A.sinensis.Key words:Angelica sinensis(Oliv.)Diels;MADS-box;bioinformatics;SOC1-4;gene clone;bolting and flowering 当归 Angelica sinensis(Oliv.)Diels 为伞形科多年生草本植物，干燥根是我国传统中药材，素有“十方九归”之称，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效1。现代药理学研究表明，当归根中的有机酸类、挥发油类和多糖类等化学成分在消炎、抗癌和治疗心脑血管疾病等方面具有显著效果2。目前，当归年需求量超 3 万 t，年种植面积达 4.35 万hm23-4。然而，当归在第 2 年肉质根成药过程中，出现高达 50%植株早薹开花的现象，导致肉质根木质化，药用有效成分含量降低且大量减产，药农经济收入减少，影响当归种质资源及产业发展5-8。MADS-box 基因家族是一类广泛存在于真核生物中的转录因子，在植物花器官分化、开花时间调节、以及果实发育等方面起到重要的调控作用9；其通常分为 I 型和 II 型，其中，II 型有 4个保守结构域：M-domain（MADS-domain）、I-domain（intervening domain）、K-domain（keratin-like domain）和 C-domain（C-terminal domain）10。目前，在模式植物拟南芥中发现了deficiens（DEF）、SQUAMOSA（SQUA）和TOMATO gene 3（TM3-like）等 12 个 MADS-box亚家族11。前期在当归转录组学的研究中发现，MADS-box 亚家族基因，如 SOC1（suppressor of overexpression of constans1）、FLC（flowering locus C）和 AGL26（agamouslike 26）等，在抽薹开花过程中差异表达12-16。研究证实，SOC1 基因是花器官分生组织形成过程中的关键基因，其通过整合外界环境和内在因素等各种成花途径信号，激活下游花器官发育所需的基因，如 LEAFY（LFY）、APETALA 1（AP1）和AGAMOUS（AG），进而促进植株开花17。前期当归研究中发现，SOC1 基因在完成春化作用的种苗根茎顶端分生组织以及早薹植株中高表达12-13，其上游基因如 COL16（constans-like）和下游基因（AGL62）在抽薹开花过程中也呈现高表达14。综合以上研究表明，尽管前人及本课题组已通过转录组测序获得了当归抽薹开花相关的MADS-box基因家族序列，并对关键基因（如 SOC1、AG 和 VRN1）的表达水平进行了 qRT-PCR 检测与分析12-16,18，然而，针对当归 MADS-box 基因家族以及关键基因SOC1 的生物信息学分析等方面的系统研究尚未有报道。因此，本研究基于前期当归全长转录组测序结果，开展了 MADS-box 基因家族生物信息学系统分析、SOC1-4 基因克隆及表达验证，旨在深入揭示MADS-box 基因家族的生物学功能，为有效抑制抽薹开花提供理论基础。1 材料与仪器 1.1 材料 当归 MADS-box 编码序列来源于：（1）不同品种（岷归 1 号和岷归 2 号）两年生大田植株叶片和叶柄的全长转录组，结果已提交 NCBI（Access：PRJNA782300），样品采集等详细信息见 Zhu 等18；（2）岷归 1 号种苗春化作用过程中T1（0、14 d；未通过春化）、T2（0、60 d；通过春化）和T3（3、125 d；低温规避春化）根茎顶端分生组织的全长转录组，结果已提交 NCBI（Access：PRJNA789039），样品采集等详细信息见 Luo 等12，样品原植物均由甘肃农业大学栗孟飞教授鉴定为当归 A.sinensis(Oliv.)Diels。1.2 仪器 台式高速离心机（德国 SORVAL 公司）；ABI QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 仪（美国 ABI 公司）；超微量分光光度计（上海宝予德科学仪器有限公司）。2 方法 2.1 MADS-box 家族鉴定、理化性质及结构分析 蛋白质序列（包括氨基酸长度、相对分子质量和理论等电点）分析利用 ExPASy（https:/web.expasy.org/protparam/）；亚细胞定位利用 Cell-PLoc（http:/ 白 质 二 级 结 构 预 测 利 用PRABI-Gerland（https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）；蛋白质 3D 建模利用Phyre 2（http:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi）。2.2 MADS-box 家族系统发育树构建 在NCBI数 据 库（https:/www.ncbi.nlNm.nih.gov）选择模式植物拟南芥 Arabidopsis thaliana L.和伞形科植物黄胡萝卜 Daucus carota subsp.sativus(Hoffm.)中与当归 29 个 MADS-box 基因家 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 1553 族置信度较高的 116 个蛋白质，利用 MEGA7.0 软件最大似然法（maximum likelihood estimate，MLE）构建系统进化树（重复次数 1000 次，其他参数为默认 值）。蛋 白 质 保 守 基 序 分 析 利 用 MEM（https:/memesuite.org/meme/tools/meme），并利用TBtools 进行可视化。利用 DNAMAN 软件进行蛋白质多序列比对（深蓝色表示相似度 100%、粉色75%、浅蓝色50%）。2.3 当归 SOC1-4 基因克隆 以岷归 1 号温室栽培植株功能叶片为材料（“1.1”项中 T2：0、60 d 通过春化，种苗移栽生长 40 d），种苗种植及生长环境等详细信息见 Liu等19。总 RNA 提取使用 Plant RNA Kit R6827（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，United States），其纯度和浓度检测使用超微量分光光度计（Micro Drop，上海宝予德科学仪器有限公司）；反转录使用 First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京百泰克生物技术有限公司）得到 cDNA；利用 NCBI Primer-BLAST（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计 SOC1-4 基因引物序列，forward：5-TGAGGGGAAAGACTCAGA-3 和reverse：5-CTGTTTCGACATCGGAAT-3；扩增产物利用1%TAE 琼脂糖凝胶电泳进行检测；胶回收使用琼脂糖凝胶纯化试剂盒TIANgel Midi Purification Kit（天根生化科技有限公司），具体反应体系及条件见说明书。基因克隆使用平末端克隆试剂盒 pHANDY-Blunt Cloning Kit（哈尔滨晔健生物科技有限公司）；引物合成及阳性克隆测序由兰州天启基因生物科技有限公司完成。2.4 当归 SOC1-4 基因表达分析 基因表达材料：（1）岷归 1 号两年生大田种植早薹（early bolting，EB）和非早薹（un-early bolting，Un-EB）植株叶和侧根（混合 11），植株生长环境和样品采集等详细信息见 Li 等13；（2）岷归 1号三年生不同生长发育期（S1：营养生长期、S2：营养生长到生殖生长过渡期、S3：抽薹初期、S4：抽薹伸长期）植株叶和侧根（混合 11），植株生长环境和样品采集等详细信息见 Li 等14的实验；（3）岷归 1 号不同春化期（T1、T2 和 T3）种苗根茎顶端分生组织；（4）岷归 1 号温室栽培植株（“1.1”项中 T2：0，60 d 通过春化，种苗移栽生长 60 d）不同器官（根、茎、叶）。利用 NCBI Primer-BLAST 设计 SOC1-4 基因qRT-PCR 表达引物，forward：5-CGAAACGGCGA-AATGGACTG-3和 reverse：5-CTGAATGTCTTG-CCCAGCAG-3，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。以 Actin 作为内参基因20，设计引物序列，forward：5-TGGTATTGTGCTG-GATTCTGGT-3和 reverse：5-TGAGATCACCA-CCAGCAAGG-3，利 用 FastKing cDNA Kit（KR116，天根生化科技有限公司）合成 cDNA；利用 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）进行qRT-PCR 检测，具体反应体系及条件见说明书。利用 2Ct 法计算 SOC1-4 基因的相对表达水平21。2.5 统计分析 在 qRT-PCR 实验中，所采集材料进行了 3 个生物学重复和 3 个技术重复。运用 Excel 2019 进行数据的计算及制图。3 结果与分析 3.1 当归 MADS-box 基因家族鉴定及理化性质分析 通过对当归不同品种叶片和叶柄、种苗春化作用过程中根茎顶端分生组织的全长转录组进行筛选，发现有 29 个 MADS-box 基因，基于所编码蛋白质序列和亚细胞定位分析，结果显示，蛋白质序列长度为 49（AP1-1）422（At5g65490-1）、相对分子质量为 5 697.5649 624.90、等电点为5.06（J）11.00（AGL14-1），亚细胞定位分析预测 29 个 MADS-box 蛋 白 分 别 位 于 叶 绿 体（AGL14-1、At3g28050-2 和 At5g65490-1）、细胞核（AGL14-2、AGL16 和 AGL19-1 等 22 个）、细胞质（AP1-1、AP1-2 和 At3g28050-1 等 7 个）和线粒体（SVP）（表 1）。3.2 当归 MADS-box 基因家族蛋白质结构分析 通过对 29 个 MADS-box 基因所编码的蛋白质进行二级结构预测以及 3D 建模，结果显示，蛋白质二级结构由 螺旋、延伸链、转角和无规则卷曲组成（表 2）；三级结构预测结果（图 1）与二级结构（表 2）相符合，主要由 螺旋、无规则卷曲和延伸链进一步折叠组装为三级结构，各 亚 家 族 内 蛋 白 质 三 级 结 构 较 为 相 似，如AGL14-2、SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3 和 SOC1-4均以 螺旋为主，无规则卷曲次之，转角最少。但各亚家族之间空间结构差异较大，如 AGL65、SOK2 及 AP1-2 等以无规则卷曲为主、而 AP1-1无延伸链（图 1）。1554 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 表 1 当归 MADS-box 基因家族蛋白质特征及亚细胞定位 Table 1 Protein characteristic and subcellular location of MADS-box gene family in A.sinensis 序号 基因 同源基因 CDS 长度/bp蛋白质大小/aa 相对分子质量等电点亚细胞定位 1 AGL14-1 AT5G59890.3 189 63 7 160.35 11.00 叶绿体 2 AGL14-2 AT5G14740.9 651 217 24 768.39 9.16 细胞核 3 AGL16 AT1G34460.4 663 221 24 926.41 6.87 细胞核 4 AGL19-1 AT5G53280.1 639 213 24 661.17 6.88 细胞核 5 AGL19-2AT1G68010.163921324 721.319.24细胞核 6 AGL27 AT5G55990.264921624 570.045.58细胞核 7 AGL31-1AT5G55990.243214416 133.418.66细胞核 8 AGL31-2AT5G55990.264821624 695.126.46细胞核 9 AGL65 AT5G64630.195431836 406.775.28细胞核10 AGL8 AT1G20450.272324127 846.496.22细胞核11 AP1-1 AT5G05090.114749 5 697.568.35细胞核、细胞质12 AP1-2 AT1G77230.11215 405 44 790.06 8.40 细胞质 13 AP1-3 AT1G20450.272324127 846.496.22细胞核14 At3g28050-1AT1G80060.476825628 381.086.37细胞质15 At3g28050-2AT3G28130.683427829 881.938.82叶绿体16 At5g65490-1AT4G31073.1126642249 624.909.55叶绿体、细胞质17 At5g65490-2AT4G11780.1110136712 146.379.93细胞质18 FLC AT5G55990.265121724 839.146.25细胞核19 J AT1G34460.447715917 539.965.06细胞核、细胞质20 MADS8 AT3G54480.253417820 651.518.97细胞核21 SCM1 AT2G01540.121070 8 095.529.86细胞核22 SOC1-1 AT5G14740.965121724 768.399.16细胞核23 SOC1-2 AT3G02470.455818621 447.569.13细胞核24 SOC1-3 AT4G22950.265121724 939.619.28细胞核25 SOC1-4 AT1G72860.162720923 861.125.91细胞核26 SOK2 AT1G80790.3108936340 264.477.78细胞核、细胞质27 SVP AT1G07705.169023024 845.249.77线粒体28 TM6-1 AT3G29770.253717920 962.839.05细胞核29 TM6-2 AT3G29770.267522526 200.869.31细胞核表 2 当归 MADS-box 基因家族蛋白质二级结构 Table 2 Secondary structure of MADS-box gene family in A.sinensis 序号 基因 螺旋 占比/%延伸链 占比/%转角 占比/%无规则卷曲 占比/%1 AGL14-1 131 76.16 18 10.47 9 5.23 14 8.14 2 AGL14-2 139 60.70 24 10.48 12 5.24 54 23.58 3 AGL16 13059.092712.27 8 3.645525.00 4 AGL19-113264.082713.11 8 3.883918.93 5 AGL19-28350.001911.4510 6.025432.53 6 AGL27 14062.503013.39 8 3.574620.54 7 AGL31-110763.692313.6910 5.952816.67 8 AGL31-212862.752411.7613 6.373919.12 9 AGL65 4316.933513.7813 5.1216364.1710 AGL8 11350.002410.6210 4.427934.9611 AP1-1 12896.2400.00 1 0.75 43.0112 AP1-2 12329.649522.8934 8.1916339.2813 AP1-3 11851.082410.3910 4.337934.2014 At3g28050-114451.994616.6120 7.226724.1915 At3g28050-25324.886229.11 9 4.238941.7816 At5g65490-113432.527417.9634 8.2517041.2617 At5g65490-210067.111610.74 7 4.702617.4518 FLC 10956.772613.5410 5.214724.4819 J 2228.951519.74 7 9.213242.1120 MADS812764.802110.7110 5.103819.3921 SCM1 12071.432716.07 7 4.17148.3322 SOC1-114161.042410.3912 5.195423.3823 SOC1-212865.98189.28 8 4.124020.6224 SOC1-37047.952013.70 9 6.164732.1925 SOC1-413863.01188.2212 5.485123.2926 SOK2 10826.935313.2228 6.9821252.8727 SVP 13161.50198.9213 6.105023.4728 TM6-1 10860.341910.6111 6.154122.9129 TM6-2 13158.223214.2220 8.894218.67 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 1555 图 1 当归 MADS-box 基因家族蛋白质三级结构 Fig.1 Tertiary structure of MADS-box gene family in A.sinensis3.3 当归 MADS-box 基因家族发育树构建 通过对 29 个当归 MADS-box 基因家族蛋白质、61 个拟南芥和 55 个黄胡萝卜 MADS-box 蛋白质进行系统进化树构建，基于蛋白质序列相似性，145个 MADS-box 蛋白质分为 10 个亚家族，可分为 I型和 II 型，其中，I 型包括 suppressor-like，II 型包括 SOC1、TM3、DEF、MADS8、SQUA、FLC、STMADS11、MIKC 和 SOK；另外，SOC1 亚家族包括 5 个当归 MADS-box 成员（SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3、SOC1-4 和 AGL14-2）（图 2）。图 2 当归、拟南芥和黄胡萝卜 MADS-box 蛋白质系统进化树 Fig.2 Phylogenetic tree of MADS-box family proteins in A.sinensis,A.thaliana and D.carota subsp.sativus SOC1-4 SOK2 SVP TM6-1 TM6-2 J MADS8 SCM1 SOC1-1 SOC1-2 SOC1-3 API-3 At3g28050-1 At3g28050-2 At5g65490-1 At5g65490-2 FLC AGL31-1 AGL31-2 AGL65 AGL8 AP1-1 AP1-2 AGL14-1 AGL14-2 AGL16 AGL19-1 AGL19-2 AGL27 1556 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 3.4 当归 MADS-box 基因家族基序分析 通过对以上 29 个当归 MADS-box 基因家族蛋白质、61 个拟南芥和 55 个黄胡萝卜 MADS-box 蛋白质进行结构域和基序分析，结果显示，MADS-box蛋白质分为 10 个亚家族，与图 2 系统进化树关系一致，序列含有 6 个保守基序（表 3）；当归 MADS-box同一亚家族蛋白质基序具有高度相似性，其中，SOC1 亚家族均含有 Motif 1Motif 5；不同亚家族蛋白质基序存在较大差异，比如，Motif 6 只存在于suppressor-like 亚家族（图 3）。3.5 当归 SOC1 亚家族蛋白质多序列比对 通过对当归 SOC1 亚家族 5 个成员（SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3、SOC1-4 和 AGL14-2）及来自拟南 芥（AtNP_182090.1）和 黄 胡 萝 卜（DcXP_017232221.1）2 个物种的 SOC1 同源蛋白质等 7 个蛋白质进行多序列比对，结果显示，SOC1亚家族 5 个蛋白质均含 MADS-domain、I-domain、K-domain 和 C-domain 结构域，其中，MADS-domain结构域高度保守，C-domain 结构域保守性较低（图4）；通过对 SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3、SOC1-4进行进一步比对，发现 SOC1-1、SOC1-3 和 SOC1-4蛋白质的 4 个结构域较为完整、且保守性较高，而SOC1-2 在 C-domain 不完整；其中，SOC1-1、SOC1-3和 SOC1-4 的相似性为 73.27%。3.6 当归 SOC1-4 基因克隆 为了保证全长转录组中当归 SOC1-4 基因碱基序列的准确性，基于全长转录组中 SOC1-4 基因碱基序列设计扩增引物，以岷归 1 号功能叶片中 RNA反转录所得的 cDNA 为模板，进行 SOC1-4 基因克隆。琼脂糖凝胶电泳显示，SOC1-4 基因扩增片段大小在 500750 bp（图 5）；产物回收与碱基测序显示，SOC1-4 基因克隆长度为 585 bp；通过与全长转录组测序获得的 SOC1-4 进行序列比对，根据引物设计所得克隆结果与测序序列 5-590 bp 相似度为100%（图 6）。3.7 当归 SOC1-4 基因表达分析 为了进一步验证 SOC1-4 基因的生物学功能，本研究对当归不同材料中 SOC1-4 基因的表达水平进行了 qRT-PCR 检测与分析。结果显示，早薹植株相对非早薹植株，SOC1-4 基因表达量上调 6.42 倍；不同生长期植株中，SOC1-4 基因表达水平随着时间延长呈现逐渐增加，S2、S3 和 S4 时期相对于 S1时期分别增加 2.16、2.31 和 5.79 倍；不同春化期种苗根茎顶端分生组织中，通过春化作用（T2）处理相对于未春化作用（T1）SOC1-4 基因表达水平呈现 3.39 倍高表达，而规避春化作用（T3）处理相对于T1处理 SOC1-4基因表达水平呈现0.48倍降低；不同器官中，茎和叶相对于根 SOC1-4 基因表达水平分别上调 9.23 和 4.90 倍（图 7）。4 讨论 目前，早薹开花导致根木质化不能入药仍是困扰当归生产、质量和效益提升的重大难题4。研究发现，当归抽薹开花受到内在（如种质、苗龄和种苗大小等）和外在（如温度、光照和干旱等）多种因素的影响4,22。此外，当归为“低温长日照型”植物，即植株由营养生长转入生殖生长必须同时满足低温春化作用和长日照22-24。大量研究表明，MADS-box 基因家族，尤其是开花抑制因子 FLC 和整合因子 SOC1，在植物花器官分化和开花时间调节等方面起到核心调节作用17。尽管 MADS-box 基因家族在模式植物拟南芥及其他植物中调节开花的作用已进行了深入研究，然而在药用植物当归中的生物学功能还鲜见报道。本研究基于前期当归全长转录组测序，发现有 29 个 MADS-box 基因分布于10个亚家族，所编码蛋白质序列含有6个保守基序，其中，亚家族有 5 个成员；另外，还对 SOC1-4 基因进行了克隆和表达分析，为后续探究 SOC1 在当归抽薹开花的分子调控研究奠定了基础。模式植物拟南芥中有 DEF、STMADS11 和TM3-like 等 12 个 MADS-box 亚家族11；山茶中有 表 3 MADS-box 蛋白质 6 个保守基序及其序列 Table 3 Six motifs and their conserved sequences of MADS-box proteins 基序 长度/aa 保守序列 Motif 1 50 IKRIENKTNRQVTFSKRRNGLLKKAFELSVLCDAEVALIIFSSRGKLYEF Motif 2 29 SLSIEELQQLEQQLETSLKQIRARKTQLM Motif 3 29 QQHLKLETAKLKKKIELLZRSKRKLLGEG Motif 4 29 MEQIEZLQEKEKLLQEENKRLRKKIKERE Motif 5 21 SSSSMEKIJERYQKYTKDDRS Motif 6 50 WTLPIFHANGWSYPWGIAAVGGTNVCLRKFDAPLIYRLIRDHGVTHMCGA 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 1557 图 3 当归、拟南芥和黄胡萝卜 MADS-box 蛋白质保守基序 Fig.3 Conserved sequences of MADS-box proteins in A.sinensis,A.thaliana and D.carota subsp.sativus SOC1 TM3 MADS8 DEF SQUA FLC STMADS11 SOK MIKC Suppressor-likeDxXP_017246108.1 DcKZM96720.1 DcKZM96717.1 DxXP_017246180.1 AsSOC1-4 AsSOC1-2 AtCAD5321474.1 AtNP_182090.1 AtNP_001323425.1 AtNP182090.1 DxXP_017235334.1 DxXP_017235918.1 AsAGL14-2 AsSOC1-1 DxXP_017232221.1 AsSOC1-3 AtNP_001078745.1 AtNP_001032123.1 AtNP_001320221.1 AtNP_001328192.1 AtCAA0396193.1 AtNP_001320037.1 AtAAC49082.1 AtNP_001319907.1 AtNP_001329520.1 DxXP_017232041.1 AsAGL14-1 AsAGL19-2 AsAGL19-1 DxXP_017236727.1 DcKZN08348.1 DxXP_017257209.1 DxXP_017253634.1 AsMAD8 DxXP_017253633.1 DcKZM94085.1 DxXP_017253634.1 AsTM6-1 AsTM6-2 DcNP_001316095.1 AtAAD51901.1 AtAAD51899.1 AtAAM64919.1 AtNP_191002.1 DcXP_017238779.1 DcXP_017