沉积相硒对夹杂带丝蚓的生物累积及效应研究_李丹.pdf

华南师范大学学报(自然科学版)Journal of South China Normal University(Natural Science Edition)2022，54(6):5158doi:106054/jjscnun2022085收稿日期:20220220华南师范大学学报(自然科学版)网址:http:journalnscnueducn基金项目:国家自然科学基金项目(42107292，42177256，42177257);科技部重点专项子课题(2018YFC1801200);广东省基础与应用基础研究基金项目(2019A1515110789)*通信作者:李丹，Email:ldanltm 163com沉积相硒对夹杂带丝蚓的生物累积及效应研究李丹1，2，3*，杨纪琛2，3，孙炜钧2，3，李潇2，3，雷浩俊2，3，韦新蓉2，3，陈红星2，3，谢凌天2，3(1 上海应用技术大学，上海 201418;2 华南师范大学环境研究院/广东省化学品污染与环境安全重点实验室/华南师范大学环境理论化学教育部重点实验室，广州 510006;3 华南师范大学环境学院，广州 510006)摘要:以底栖模式生物夹杂带丝蚓(Lumbriculus variegatus)为研究对象，在环境相关浓度的沉积相 Se()中暴露21 d后，通过 ICPMS 定性定量硒在带丝蚓体内的含量及形态。硒在环境相关浓度下可以有效地在夹杂带丝蚓体内累积，形态主要以 SeMet 和 SeCys 为主。此外，沉积相中硒可以促进夹杂带丝蚓体内氧化应激反应、降低 Na+/K+ATP 酶活性以及消化系统相关酶活性，从而抑制夹杂带丝蚓的肥满度增长以及对沉积物中硒的生物富集能力。结果表明:环境相关浓度的沉积相 Se()可能影响硒在底栖生物中的累积及其形态的分布，并形成生物效应。研究结果为阐明沉积物中硒对底栖生物的生物累积及效应提供了重要的理论依据和数据支撑。关键词:硒;底栖生物;硒的形态;生物累积;生物效应中图分类号:TQ033文献标志码:A文章编号:10005463(2022)06005108The Biological Accumulation and Effects of Selenium in Sediments on theOligochaete，Lumbriculus VariegatusLI Dan1，2，3*，YANG Jichen2，3，SUN Weijun2，3，LI Xiao2，3，LEI Haojun2，3，WEI Xinrong2，3，CHEN Hongxing2，3，XIE Lingtian2，3(1 Shanghai Institute of Technology，Shanghai 201418，China;2 SCNU Environmental esearch Institute，South China Normal University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Chemical Pollution and Environmental Safety/MOE Key Laboratory of Theoretical Chemistry ofEnvironment，Guangzhou 510006，China;3 School of Environment，South China Normal University，Guangzhou 510006，China)Abstract:In the L variegatus，SeMet and SeCys were the main Se species The benthic model organism，Lum-briculus variegatus，was used to quantify the content and morphology of selenium in the Lumbriculus by ICPMSafter 21 d exposure to environmentally relevant concentrations of the sedimentary phase Se()The results showedthat selenium could effectively accumulate in the Lumbriculus at environmentally relevant concentrations，and themorphology was mainly dominated by SeMet and SeCys In addition，Se at environmental related concentrationsin the sediment increased the oxidative stress，inhibited the activities of Na+/K+ATP enzyme and digestive en-zymes of L variegatus，inducing the decrease of condition factors and bioaccumulation The results shed a light onthe Se species，biological accumulation and effect of Se()in sediments in the benthos，and provide theoreticalbasis and fundamental data for the bioaccumulation and effects of selenium in sedimentsKeywords:selenium;benthos;selenium speciation;bioaccumulation;biological effects硒是人体生理必需的 14 种微量元素之一，在维持免疫、刺激生长和繁殖等各种功能上具有重要作用12。硒在地壳中含量很低且分布不均3，但工农业活动(如废弃物排放、矿业开采、冶炼、加工运输、施肥及灌溉等)可能导致硒被大量排放到受纳水体中，主要以高可溶性无机硒(即亚硒酸盐(Se()和硒酸盐(Se()和有机硒(硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代半胱氨酸(SeCys)和其他有机硫化合物的硒取代类似物)形态存在45。硒被排放到水环境后，容易吸附在沉积矿物质和有机物的表面上6，使沉积物成为硒的主要源和汇7。天然沉积物中硒的质量分数在 00839 g/g范围，其平均值约 10 g/g811，而美国 Belews 湖和 Kesterson 水库沉积物中硒的质量分数分别高达100 g/g 和 210 g/g，主 要 以 Se()形 态 存在8，12。硒在沉积物中可以通过底栖生物的摄食行为进入食物链，在更高营养级的水生生物体内累积并造成毒性效应，包括致畸性13、神经毒性14、氧化应激15 和异常行为16 等。前期研究表明底栖无脊椎动物具有富集硒的能力，某些类群最高硒积累可达370 g/g dw8，从而使水体中其他摄食底栖生物的高营养级生物受到硒的危害。但目前对于沉积物中硒在底栖生物中的富集及对其产生毒性效应的机制研究较少。本文主要研究:(1)沉积物中最常见的无机硒形态 Se()在环境相关浓度下对底栖模式生物夹杂带丝蚓(Lumbriculus variegatus)的生物有效性;(2)沉积物中 Se()的暴露对夹杂带丝蚓体内硒形态分布的影响;(3)沉积物中 Se()的暴露对夹杂带丝蚓的 Na+/K+ATP 酶、氧化应激反应以及消化系统的影响。本研究结果可为底栖环境中硒污染的预防和检测提供参考依据。1材料与方法11试验材料亚硒酸钠(Se()，纯度99%)购买自沈阳瑞丰精细化工有限公司，其他所有试剂均购自广州化学试剂厂。所有玻璃器皿均用 50%硝酸清洗、去离子水漂洗 3 次，70 下烘干后使用。夹杂带丝蚓由华南师范大学水生毒理学实验室传代培养得到，每天饲喂 1 次约 100 mg 的孔雀鱼饲料(硒的背景值见表 1)。在实验开始之前，随机选择大约 300 条大小相近(湿质量(4005)mg，体长(22020)mm)的夹杂带丝蚓成体，在光照 14 h 与黑暗 10 h 的光暗循环和(261)的温度下，将夹杂带丝蚓(Lumbriculus variegatus，硒的背景值见表1)培养在放有沉积物(深度约 2 cm)和经过碳过滤的脱氯自来水(体积为12 L)的玻璃容器(容积为18L)中，在没有食物和曝气的情况下驯化 7 d。表 1曝气水、沉积物、鱼饲料和夹杂带丝蚓中不同形态硒的背景值Table 1The background concentrations of different Se species in the exposure medium，sediments，fish food and L variegatus参数Se()Se()SeMetSeCys总硒曝气水中 Se 质量浓度/(gL1)NDNDNDNDND沉积物中 Se 质量分数/(gg1)017001002001007003ND021001鱼饲料中 Se 质量分数/(gg1)171032005001133024ND343087夹杂带丝蚓中 Se 质量分数/(gg1)010002ND32101708501243602412硒沉积物暴露沉积物取自黑龙江省松花江上游(458oN，1265oE)，在20 下储存数周以上，以消除所有不可见的底栖生物。在加标前，去除上覆水，在室温(25)下解冻后对沉积物进行湿筛(500 m)17。沉积物的有机物质量分数为(6201)%，粉砂/粘土质量分数为(76813)%，砂质量分数为(15407)%，水分质量分数为(51702)%(平均值SE，n=3)。实验前，通过电感耦合等离子体质谱法(ICPMS)对松花江沉积物中总硒的背景值进行了定量(表 1)。沉积物中不同 Se 形态的背景值通过高效液相色谱(HPLC)结合 ICPMS 进行鉴定(表 1)。将 100 g 烘干过筛后的沉积物分配到酸洗过的玻璃烧杯中(容积为 500 mL)，根据硒在沉积物中的环境相关浓度(质量分数，全文同)，分别设置低浓度组、中浓度组、高浓度组(即 3 个处理组)，为了表述方便，称其为低、中、高浓度组。Se 的质量分数分别为 3、10、30 g/g，在搅拌下将 Se()添加到每个容器中，加入约 150 mL 的曝气水作为上覆水，放置24 h 达到平衡。每个质量分数设置 3 个重复实验，每个重复实验加入 25 条夹杂带丝蚓，在加入到沉积中物之前对 25 条带丝蚓统一称其质量并记录。实验期间监测温度、氧饱和度、pH 以及总氨质量浓度。在加入硒的第 1、2、3、4、5、6、7、14、21 d 从 4 个容器中取出 3 份沉积物(每份沉积物 40 mg)和上覆水(每份上覆水样品 2 mL)样品，测定沉积物和上覆水中的硒在 20 d 内的形态和总量的变化。实验结束后，将实验生物从沉积物中筛选出，称其质量并记录数量，其他所有样品在80 冷冻保存，用于后续相关生化分析。13总硒及硒形态的检测上覆水样品用微孔聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(孔径 022 m，ANPEL，上海)过滤，并使用微波消解仪(型号 MAS6 240/50，CEM 公司，美国北卡罗25华 南 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第 54 卷来纳州)在 HNO3中 165 下消解 30 min。将沉积物样品冻干约 24 h 至恒定质量，然后加入 10 mL 混合酸(5 mL HF、3 mL HNO3和 2 mL HCl)中消解，在微波消解仪中 190 下消解 40 min。解冻的夹杂带丝蚓样品(无干燥过程)加入 8 mL HNO3后在微波消解仪中消化，190 下消解 40 min。消化物用超纯水进一步稀释至最终体积为 50 mL，用微孔 PVDF膜过滤后，使用 ICPMS 测定总硒。ICPMS 的操作参数:射频功率为 1 200 W，等离子气体流量15 L/min，载气流量 1 L/min，氦气流量 5 mL/min，采样深度 6 mm，八极杆偏置18 V，能量鉴别 5 V，单位质量积分时间 03 s，监测的同位素包括78Se和82Se。标 准 参 考 物 质(SM)(GBW10024，GBW07309，国家有证参考物质研究中心，中国北京)用于测定总硒的回收率，SM 中硒的回收率分别为 101%和 99%。其他 QA/QC 包括加标样品和酸空白。以每 5 个样品中取 1 个的比率分析空白。将每个重复实验中约 200 mg 的沉积物样品转移到装有 20 mL EDTA(4 mmol/L，pH 75)的容积为50 mL 的离心管中，并在 40 下以 100 r/min 的转速在振荡器上振摇 10 h，随后在 3 000 r/min 转速下离心10 min，上清液用微孔 PVDF 膜过滤18，使用HPLCICPMS 分析样品中的硒形态。在每个重复实验中，取 3 条夹杂带丝蚓(约 10 mg)样品在 1 mLTrisHCl 缓冲液(30 mmol/L，pH 75，含14 mmol 尿素和 2 mg 脂肪酶)中匀浆后，摇动 1 h。加入4 L05 mol 二硫苏糖醇和 165 L 05 mol 碘乙酰胺后，将溶液在 25 下避光孵育。1 h 后，加入 225L 二硫苏糖醇溶液，振荡 1 h。加入 2 mg 型蛋白酶，将样品在转速为 60 r/min 的摇床上 37 避光孵 育20 h。经 过 酶 水 解 后，提 取 物 以 3 000r/min的转速离心 10 min19。上清液用微孔 PVDF滤膜过滤，使用 HPLCICPMS 分析样品中的硒形态。使用 Agilent 1260 Infinity Ultra Perform-ance LC 系 统(Agilent，USA)在 Hamilton PP X100+色 谱 柱(4 1 250 mm，10 m，Hamilton，USA)上分离样品中不同形态的硒。流动相为6 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 50)，流速为 15mL/min，温度 25。ICPMS的条件与测定总硒的条件相同。进样量为 50 L。本研究的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为 004 和 005 g/L。水样的回收率为 102%，沉积物样品的回收率为96%，生物样品的回收率为 87%。14生化指标检测每个重复取 3 条夹杂带丝蚓混合，用 20 mmolTrisHCl 缓冲液(05 mol 蔗糖，0075 mol KCl，1 mmol MDTT，1 mmol EDTA，pH 7 6)匀 浆。在4 3 000 g 条件下，离心 15 min，按照试剂盒用酶标仪测定过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)与胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性以及总蛋白、丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)的含量。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。15数据分析数据表示为平均值 标准差(SD)，并通过KolmogorovSmirnov 检验检查正态性，通过 Levene检验检查方差的同质性。未检测到与正态性或同方差性的显著偏差。进行单向方差分析(ANO-VA)，然后进行 Tukey 检验，以检测处理之间的差异。在 P005 时接受统计显著性。使用 SPSS220 进行统计分析。2结果与讨论在对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组中，沉积物初始总硒质量分数分别为 025000、325000、1025000、3025000 g/g 干质量，上覆水中初始总硒质量分数为 081001、526 139、2257525、6149322 g/L。在不同处理组中Se()、Se()、SeMet和 SeCys 的质量分数见表2。在暴露 21 d 后，并无生物死亡。表 2不同处理组沉积物中不同形态硒的初始实测值Table 2The initial concentrations of different Se species in all treatments样品w/(gg1)Se()Se()SeMetSeCys总硒对照组02200040030002NDND025000Se()L312006020002NDND325000Se()M1000007032001NDND1025000Se()H2916152078014NDND302500035第 6 期李丹等:沉积相硒对夹杂带丝蚓的生物累积及效应研究21硒的形态分布211沉积物和上覆水中的硒在 Se()处理的沉积物中，总硒质量分数在前 7 d 急速下降(范围2353%3600%，负号表示下降，下同)，后续下降缓慢并趋于稳定(图 1A)。在 Se()处理的沉积物上覆水中，总硒质量分数的变化趋势与沉积物中的相似，在前 7 d 急剧下降，尤其是高浓度组(图 1B)。Se()处理的在沉积物和上覆水中主要以Se()和Se()为主，而且 Se()质量分数的变化趋势和总硒的相似(图 2)。有趣的是，在中、高浓度组，Se()质量分数在前 3 d 急速增加，然后快速下降至第 7 d后平缓下降(图 2C、D)。而上覆水中 Se()的质量分数相对于沉积物呈延迟效应，在前 6 d 上升，第 7 d开始下降，至 21 d 干质量接近于 0 g/g(图 2G、H)。图 1沉积物及上覆水中总硒质量分数随时间的变化Figure 1The variations of total Se concentrations in the sediments and overlying water with time注:分析中 n=3，全文同。图 2沉积物及上覆水中硒形态的变化Figure 2The variations of Se species in the sediments and overlying45华 南 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第 54 卷硒在天然水体中的沉积物或上覆水系统中约占98%，其中硒在沉积物中约占 90%7，因此，硒在沉积物或上覆水中的动态平衡不可忽视。Se()对沉积物中的有机质、粘土矿物和铁氧化物具有较高的吸附性20，是沉积物中主要的无机硒形态，且具有适中的氧化还原电位21。在中、高浓度组中，在前3 d Se()的质量分数上升可能由于夹杂带丝蚓受高质量分数 Se 的胁迫作用而在沉积物中频繁搅动，进而提升上覆水中 Se()的质量分数，同时沉积物中的含氧量增加，导致 Se()被氧化成 Se()。第 3d 以后，带丝蚓适应暴露环境后，Se()质量分数随总硒质量分数的下降而减小。总硒质量分数的下降可能由于随着暴露时间的延长，沉积物中 Se()被还原成元素硒或者气态硒化物1，22。212夹杂带丝蚓中的硒当暴露在 Se()环境21 d后，夹杂带丝蚓体内总硒质量分数随着暴露质量分数的升高而增大，在体内主要以 SeMet 和 SeCys 这 2 种硒形态为主(图 3)。结果表明:Se()进入生物体内可以迅速发生生物转化生成 SeMet和 SeCys，这可能是由于无机硒可以迅速与体内的蛋氨酸和半胱氨酸结合23，但是具体转化机制需要进一步研究。图 3夹杂带丝蚓中总硒和硒形态的变化Figure 3The variations of total Se concentrations and Se species in the L variegatus带丝蚓对沉积物中硒的 BAF 数值在低、中、高浓度组中分别为 800111、789090 和 459041(图 4)。有趣的是，低、中浓度组中夹杂带丝蚓对沉积物中硒的 BAF 数值是高浓度组中的 2 倍。图 4夹杂带丝蚓体内硒的生物富集系数Figure 4Bioaccumulation factors of Se in the L variegatus对比 BAF 数据发现，夹杂带丝蚓在沉积物中硒质量分数小于 10 g/g 时富硒能力相似，但是当沉积物中硒质量分数过高时可能损伤夹杂带丝蚓体内的一些生化指标(如离子通道、氧化应激和消化系统等相关酶)。因此，沉积物中高质量分数的硒会降低底栖生物对硒的富集能力。例如，在沉积物中硒暴露正颤蚓(12 g/g Se()、夹杂带丝蚓(20g/g Se()和霍甫水丝蚓(40 g/g Se()14 d后，其对沉积物中硒的 BAF 分别为 592、055 和0701，17，24。22硒暴露对夹杂带丝蚓体内 Na+/K+ATP 酶的影响当暴露在 Se()中 21 d 后，夹杂带丝蚓体内Na+/K+ATP 酶的活性随着 Se()暴露质量分数(030 g/g(Se)逐渐降低(1462%、2455%、5424%)(图 5)。与前期研究结果相似，夹杂带丝蚓在含 Se 质量分数为 20 g/g 的 Se()中暴露 14d，Na+/K+ATP 酶的活性也显著下降17。也有研究表明，Se()抑制小鳉鱼体内 Na+/K+ATP 酶的活性25。此外，高浓度组中 Na+/K+ATP 酶的活性与低、中浓度组具有显著差异性，与 BAF 的变化趋势相同。重金属通过主动运输进入到细胞内部需要消耗三磷酸腺苷(ATP)酶来提供逆浓度运输所需要的能量，而硒能够氧化 ATP 酶分子中的巯基，抑制ATP 酶的活性17，26。因此，沉积物中高浓度Se()可能损伤带丝蚓的 Na+/K+ATP 酶，进而影响带丝蚓对硒的吸收能力。55第 6 期李丹等:沉积相硒对夹杂带丝蚓的生物累积及效应研究图 5硒暴露对夹杂带丝蚓 Na+/K+ATP 酶的影响Figure 5The effect of Se on the Na+/K+ATP enzyme ac-tivities of L variegatus23硒暴露对夹杂带丝蚓抗氧化系统的影响当暴露在 Se()中 21 d 后，夹杂带丝蚓体内过氧化氢酶的活性不受影响(图 6 A)，而带丝蚓体内的谷胱甘肽和脂质过氧化水平(丙二醛的质量分数)随着 Se()暴露质量分数(030 g/g Se)逐渐升高，如图 6B(5 25%、36 58%、42 1%)和图 6D(796%、13510%、50029%)，谷胱甘肽过氧化物酶随着 Se()暴 露 质 量 分 数 增 大 而 逐 渐 降 低(4417%、7542%和 9180%，图 6C)。研究表明:霍甫水丝蚓和夹杂带丝蚓暴露于 20 g/g Se()中14 d 后，体内脂质过氧化水平也均显著升高17，27。图 6硒暴露对夹杂带丝蚓抗氧化系统的影响Figure 6The effect of Se on the oxidative stress of L variegatus24硒暴露对夹杂带丝蚓消化系统的影响Se()暴露带丝蚓 21 d 后，相对于空白对照组，夹杂带丝蚓的肥满度在低、中浓度组中轻微升高，而在高浓度组中下降，但并没有显著差异性(图7A)，与夹杂带丝蚓体内胰蛋白酶的活性和糜蛋白酶的活性呈现趋势相似(图 7B C)。在高浓度组中，硒显著降低了夹杂带丝蚓体内胰蛋白酶的活性(1247%)(图 7B)。对于糜蛋白酶，高浓度的硒增加了夹杂带丝蚓体内糜蛋白酶的活性(+12251%);而在中、高浓度组中，夹杂带丝蚓体内糜蛋白酶的活性显著降低了 7553%和9103%，呈现“低促高抑”现象(图 7C)。图 7硒暴露对夹杂带丝蚓肥满度及消化系统的影响Figure 7The effect of Se on the condition factor and the digestive system of L variegatus65华 南 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第 54 卷胰蛋白酶和糜蛋白酶都是可以参与蛋白质氨基酸代谢的活化酶，通过把生物消化道内的蛋白质分解为氨基酸，使蛋白质被机体吸收和利用28。一些研究表明重金属可以降低水生生物体内的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。例如:镉(10 g/L)暴露 48 h 后，大型溞体内胰蛋白酶活力明显降低29;镉(145mg/L)暴露河南华溪蟹 21 d 后，肠道内胰蛋白酶活力显著降低30。此外，硒可能导致体内产生过量的OS，进而降低糜蛋白酶的活性31。夹杂带丝蚓体内消化酶活力的降低会直接影响大分子物质的分解，消化能力变弱会降低机体对营养物质的吸收，从而影响其生长发育，间接反映重金属对底栖生物的危害程度。因此，高浓度硒明显抑制夹杂带丝蚓体内的胰蛋白和糜蛋白酶活力，对机体消化系统造成损伤，降低其肥满度。3结论硒在环境相关浓度下可以在夹杂带丝蚓体内有效累积，在体内主要以 SeMet 和 SeCys 为主。随着沉积物中硒的浓度增加，增加带丝蚓体内氧化应激反应、降低 Na+/K+ATP 酶以及消化系统相关酶活性，从而抑制带丝蚓的肥满度以及对沉积物中硒的生物富集能力。此外，本研究结果可以为硒在底栖生物中的累积及其形态的分布，以及毒性效应提供基础数据，为水生生态系统的保护、水产品的食品安全及水环境标准完善提供重要的理论依据。参考文献:1 CHEN H，YAN L，XIE L，et al The role of the freshwateroligochaete Limnodrilus hoffmeisteri in the distribution ofSe in a water/sediment microcosmJ Science of TheTotal Environment，2019，687:10981106 2MANSOU A T，GODA A A，OMA E A，et al Dietarysupplementation of organic selenium improves growth，sur-vival，antioxidant and immune status of meagre，Argyroso-mus regius，juvenilesJ Fish Shellfish Immunology，2017，68:516524 3徐辉碧，黄开勋 硒的化学、生物化学及其在生命科学中的应用 M 第 2 版 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