超声波辅助果胶酶法优化花牛苹果幼果多酚的工艺研究_高义霞.pdf

超声波辅助果胶酶法优化花牛苹果幼果多酚的工艺研究高义霞1,2,呼丽萍1,2(1.天水师范学院生物工程与技术学院,甘肃天水 741001;2.甘肃省大樱桃工程技术研究中心,甘肃天水 741001)摘要 为充分利用农业废弃物,以花牛苹果幼果为材料,利用超声波辅助果胶酶法提取苹果多酚,并采用单因素和响应面法进行工艺优化。结果表明:各因素对苹果多酚提取率的影响表现为提取温度料液比乙醇体积分数提取时间。苹果多酚最优提取工艺为:超声波功率 100 W,提取时间 51 min,乙醇体积分数为 71%,料液比 1 6,提取温度 62。在该条件下,苹果多酚提取率为 11.586 mg/g。关键词 花牛苹果幼果;苹果多酚;超声波提取;响应面设计中图分类号 TS201.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2023)03-0163-04doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2023.03.037 开放科学(资源服务)标识码(OSID):Process Optimization for Polyphenols from Young Fruits of Huaniu Apple Using Ultrasonic-assisted Pectinase MethodGAO Yi-xia1,2,HU Li-ping1,2(1.College of Bioengineering and Biotechnology,Tianshui Normal University,Tianshui,Gansu 741001;2.Gansu Engineering Technology Research Center for Sweet Cherry,Tianshui,Gansu 741001)Abstract With young fruits of Huaniu apple as material,apple polyphenols were extracted using pectinase treatment combined with ultra-sound-assisted extraction,and the extraction technology was optimized by single factor and response surface method.The results showed that the effect of different factors on apple polyphenols was as follows:extraction temperature solid-liquid ratio ethanol concentration extraction time.The optimal extraction process of apple polyphenols is ultrasound power 100 W,extraction time 51 min,extraction temperature 62,solid-liquid ratio 1 6,and ethanol concentration 71%.Under above condition,the yield of apple polyphenols is 11.586 mg/g.Key words Young apple fruits of Huaniu;Apple polyphenol;Ultrasound-assisted extraction;Response surface optimization基金项目 甘肃省自然科学基金项目(1610RJZE141)。作者简介 高义霞(1982),女,甘肃白银人,副教授,硕士,从事资源植物的开发利用研究。收稿日期 2022-04-01 我国是世界苹果产业规模最大的国家之一,2014 年苹果栽培面积和产量分别达到 226 万 hm2和 3 800 万 t,幼果达285 万 t1。其中,甘肃省苹果栽培面积和年产量分别达到32 万 hm2和 320 万 t,幼果约 24 万 t2。而幼果中的多酚提取率为成熟果实的 10 倍,是苹果多酚丰富的来源,开发价值很高3。研究表明,苹果多酚的许多生理功能(如抗龋齿4-5、抗氧化等)比茶多酚高 100 倍以上,因此开发苹果多酚制品具有广阔的销售市场。目前绝大多数苹果幼果被废弃,极少量以沼气或者饲喂家禽等方式消化,既污染了自然环境,又造成极大的资源浪费6。苹果多酚提取工艺主要有溶剂萃取法、高压萃取技术及二氧化碳超临界萃取技术等,这些方法在提取效率、节能及自动化等方面尚有不足7。而超声辅助提取法具有效率高、能量低以及节省溶剂等特点,正逐渐成为有效提取多酚等活性物质的新兴技术8。王贤萍等9利用超声波辅助法提取山西嘎啦苹果多酚,确定最佳工艺为乙醇体积分数 50%,提取时间 60 min,pH 3,料液比 1 6,超声功率 80 W,在该条件下含量可达到1 692.72 mg/kg。李珍等10利用超声波辅助法提取苹果皮渣多酚,确定最佳提取工艺为提取时间 10 min,超声功率500 W,提取温度 65,料液比 1 30,在该条件下实际测定的总酚含量可达到 4.53 mg/g。为了充分利用当地特色果品“花牛”苹果幼果,笔者采取超声辅助果胶酶法提取苹果多酚,在单因素试验的基础上,通过响应面法优化提取参数,确定苹果多酚最佳工艺条件,以期为花牛苹果幼果的资源利用及其多酚开发提供理论依据,也为苹果多酚在食品及医药行业的应用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与仪器 花牛苹果幼果,采自甘肃省天水市麦积区中滩镇九龙山苹果基地,时间 2016 年 6 月 5 日,处理前保存于 0 冷库中。福林酚试剂(Folin-Ciocalteu),上海润顺化工有限公司;没食子酸标准品(99%)、阿拉丁试剂、果胶酶,sigma 公司;异抗坏血酸,湖南世纪华星生物工程有限公司;无水乙醇,国产分析纯。KQ-500 型超声波清洗器,昆山市超声仪器;紫外-可见分光光度计(UV-2450),日本岛津;料理机(JYL-C022),九阳集团。1.2 苹果多酚提取 取花牛苹果幼果,去核除蒂,按 101的比例(M/V,g/mL)加入 10%异抗坏血酸作为护色剂,破碎后准确称取样品 10.000 g,加入果胶酶酶解11,乙醇超声波提取,提取液抽滤后收集滤液,定容备用。1.3 标准曲线制作和多酚提取率测定 多酚提取率测定采用 Folin-Ciocalteu 法12-13。吸取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 没食子酸标准使用液(50 g/mL)于 25 mL 容量瓶中,分别添加3.0 mL Folin-Ciocalteu 试剂,反应5 min 后分别加入 2.0 mL 10%Na2CO3溶液,用蒸馏水定容至刻度,30 避光水浴 30 min,测定 OD690。标准曲线方程 Y=0.179 3X+0.000 3式中,Y 为 OD,X 为多酚提取率,g/mL。取 1.0 mL 同标准曲线操作,计算多酚提取率。多酚提取率公式为C=XVN/M式中,C 为多酚提取率,g/g;V 为体积,mL;N 为稀释倍数;M为样品质量,g。1.4 单因素试验1.4.1 提取时间对多酚提取率的影响。称取样品 10.0 g 安徽农业科学,J.Anhui Agric.Sci.2023,51(3):163-166,191 6 份,在料液比 1 6、乙醇体积 60%、超声波功率 60 W、温度50,时间分别为 10、20、30、40、50、60 min 的条件下提取,计算多酚提取率,平行 3 次。1.4.2 料液比对多酚提取率的影响。称取样品10.0 g 6 份,设定超声波功率 60 W、温度 50、提取时间 50 min、乙醇体积 60%,在料液比分别为 1 2、1 4、1 6、1 8、1 10 的条件下提取,计算多酚提取率,平行 3 次。1.4.3乙醇体积分数对多酚提取率的影响。称取样品10.0 g 6 份,设定超声波功率 60 W、温度 50、提取时间50 min、料液比 1 6,分别加入体积分数 40%、50%、60%、70%、80%的乙醇提取,计算多酚提取率,平行 3 次。1.4.4 超声波功率对多酚提取率的影响。称取样品 10.0 g 6 份,在料液比 1 6、乙醇体积分数 70%、提取温度 50、提取时间 50 min,超声波功率分别 20、40、60、80、100 W 的条件下提取,计算多酚提取率,平行 3 次。1.4.5 提取温度对多酚提取率的影响。称取打浆后的样品10.0 g 6 份,在料液比 16、乙醇体积分数 70%、设定超声波功率100 W、提取时间50 min,在20、30、40、50、60、70、80 的条件下提取,计算多酚提取率,平行 3 次。1.5 响应面优化苹果幼果多酚提取工艺 根据单因素试验结果进行 4 因素 3 水平的响应面优化试验,条件设计见表 1。表 1 响应面因素水平试验设计Table 1 Response surface factor level experiment design因素水平Level提取时间Extraction time(A)min料液比Material liquid ratio(B)乙醇体积分数Volume fraction of ethanol(C)%提取温度Extraction temperature(D)-1451 560500501 670601551 78070 在优化试验中以提取时间(A)、料液比(B)、乙醇体积分数(C)、提取温度(D)为自变量,以花牛苹果幼果多酚提取率为考察指标,共设计 29 个试验点,其中 24 个分析点,中心试验重复 5 次,用来估计试验误差。1.6 数据处理 采用 SPSS 16.0 分析数据。2 结果与分析2.1 提取时间对苹果多酚提取率的影响 由图 1 可知,随着提取时间的延长,苹果多酚提取率呈先上升后下降趋势,70 min 时提取率最大。原因可能是提取时间过短,多酚未被完全提取,提取时间过长,则导致其他可溶性物质被溶出,且多酚易发生不同程度的分解。2.2 料液比对苹果多酚提取率的影响 由图 2 可知,苹果多酚提取率随料液比的增加先升高后下降,当料液比为 16时提取率达到最大值,为 9.206 mg/g。原因可能是超声波振动提取时,苹果超微结构遭到破坏,提取效率升高14。而当料液比达到一定程度后,继续提高料液比会使多酚提取率下降,可能原因是料液比较小时,幼果细胞吸收的超声波能量较多,细胞破碎程度较好,多酚更容易被释放到溶剂中;料液比过大时,超声波能量的吸收程度较小,细胞破碎程度减小,图 1 提取时间对苹果多酚提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of apple poly-phenols多酚物质不易被释放;但是如果料液比过小,溶解多酚的溶剂就会过少,效果亦不佳。图 2 料液比对苹果多酚提取率的影响Fig.2 Effect of material liquid ratio on extraction rate of apple polyphenols2.3 乙醇体积分数对苹果多酚提取率的影响由图 3 可知,随着乙醇体积分数的增大,苹果多酚提取率呈先上升后下降的趋势,当乙醇体积分数为 70%时,多酚提取率达最大值,为 9.095 mg/g。原因可能是幼果多酚一部分为醇溶性,另一部分为水溶性,且两者比例相当15。当提取液浓度过低时,醇溶性多酚未充分释放,反之,水溶性未充分溶解,只有在醇水比例相当时效果最佳。图 3 乙醇体积分数对苹果多酚提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of ap-ple polyphenol2.4 超声波功率对苹果多酚提取率的影响 由图 4 可知,苹果多酚提取率随着超声波功率的增加而逐渐增大,当超声波功率为 100 W 时,提取率达到最大值,为 10.625 mg/g。原461 安徽农业科学 2023 年因可能是功率过小,振动能低,不能充分提取。图 4 超声波功率对苹果多酚提取率的影响Fig.4Effect of ultrasonic power on extraction rate of apple polyphenols2.5 提取温度对苹果多酚提取率的影响 由图 5 可知,苹果多酚提取率随提取温度的升高呈先上升后下降趋势,当提取温度为 70 时提取率最大为 11.035 mg/g。原因可能是温度升高,会使物质内的分子运动加快,多酚类物质的扩散与渗透的速度加快,使多酚更易溶出。但是温度过高时,会破坏多酚的结构,提取率下降,这与文献报道结论一致14,16。图 5 提取温度对苹果多酚提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of ap-ple polyphenols2.6 响应面优化苹果多酚的提取工艺2.6.1 回归模型的建立及统计检验。响应面分析方案及试验结果见表 2。利用 Design-Expert 8.0.6 软件对表 2 中数据进行多项式回归分析17,建立花牛苹果幼果多酚提取率的模型,得到拟合多元二次响应面回归方程为Y=11.52+0.14A-0.23B+0.22C+0.44D-0.79AB+0.47AC+0.62AD-0.12BC-0.71BD+0.023CD-2.07A2-0.96B2-2.38C2-1.48D2 对该模型进行方差分析可知,回归模型 P0.05,表示无显著性差异,说明模型拟合情况良好。回归方程的二次项A2、B2、C2、D2的系数为负值,则该方程的抛物面开口朝下,具有极大值点,可以进行最优分析。由表 3 可知,一次项对苹果多酚提取率的影响从大到小依次为提取温度(D)、料液比(B)、乙醇体积分数(C)、提取时间(A),一次项超声波提取温度(D)对多酚提取率的影响达显著水平,交互项提取时间和提取温度(AD)、料液比和提取温度(BD)达极显著,提取时间和料液比(AB)、提取时间和乙醇体积分数(AC)为显著水平,二次项影响均为极显著,其他无显著。表 2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Response surface analysis scheme and test results因素Factor提取时间Extraction time(A)min料液比Material liquid ratio(B)乙醇体积分数Volume fraction of ethanol(C)%提取温度Extraction temperature(D)提取率Extractionratemg/g1501 6706011.5202501 6706011.7003501 680707.8844501 6706011.3805501 760607.6636451 670707.4587451 570607.7568501 680507.3459501 570508.54110551 660607.56311451 770608.88212551 680607.96013501 5707010.74014551 570609.32015551 670507.02916501 6706011.58017451 660607.64218501 770708.73519501 770509.38220501 660707.57521501 580608.73522551 670709.62423501 560607.79024451 680607.07025501 660507.13626451 670507.36027501 6706011.40028551 770607.28029501 780608.1362.6.2 超声波辅助提取苹果多酚各因素间的交互作用。响应面图是反映响应面在整个试验交互作用下得到的结果,构成三维空间曲面,可以预测和确定变量的交互作用。分析当2 个因素不变时,另外 2 个因素及其交互作用对多酚提取率的影响,各因素交互情况见图 6。由图 6a 可知,固定料液比为 1 6,提取温度为 60,随着提取时间的延长和乙醇体积分数的增加,苹果多酚提取率先增大后减少,且乙醇体积分数对苹果多酚提取率的影响大于提取时间。由图 6b 可知,固定乙醇体积分数 70%,提取温度为 60,随着提取时间的延长和料液比的增加,苹果多酚提取率先增加后减少,料液比对苹果多酚提取率的影响大于提取时间。由图 6c 可知,固定料液比为 1 6,乙醇体积分数为 70%,随着提取时间的延长和提取温度的升高,苹果多酚提取率先增加后减少,提取温度对苹果多酚提取率的影响大于提取时间。由图 6d 可知,固定提取时间为 50 min,提取温度为 60,随着乙醇体积分数和料液比的增大,苹果多酚提取率先增加后减少,且乙醇体积分数对苹果多酚提取率的影响大于料液比。由图 6e 可以看出,固定提取时间为 50 min,乙醇体积分数为 70%,随着提取温度的升高和料液比的增大,苹果多酚提取率先增加后减少,且提取温度对苹果多酚56151 卷 3 期 高义霞等 超声波辅助果胶酶法优化花牛苹果幼果多酚的工艺研究表 3 方差分析结果Table 3 Results of ANOVA来源Source平方和 Sum of squares自由度 Freedom均方 Mean squareFP显著性Significance模型 Model69.510144.9633.420 0.000 1A0.24010.241.5900.227 3B0.66010.664.4600.053 2C0.59010.594.0000.065 3D2.27012.2715.3000.001 6AB2.49012.4916.7500.001 1AC0.88010.885.9500.028 7AD1.55011.5510.4600.006 0BC0.05510.060.3700.552 7BD2.02012.0213.6200.002 4CD2.07E-0312.07E-030.0140.907 7A227.910127.91187.880 0.000 1B25.96015.9640.090 0.000 1C236.760136.76247.440 0.000 1D214.170114.1795.380 0.000 1残差 Residual2.08140.150失拟量 Misfit quantity2.01100.20011.5000.055 0纯误差 Pure error0.0740.020相应总量 Corresponding total71.5928 注:表示影响极显著(P0.01),表示影响显著(P0.05)。Note:means extremely significant(P0.01),means significant(P0.05).图 6 两因素交互作用对苹果多酚提取率的响应面图Fig.6 Response surface diagram of the influence of the interaction of two factors on the extraction rate of apple polyphenols(下转第 191 页)661 安徽农业科学 2023 年正常烟叶的识别依据,为后续早期霉变烟叶的数据化识别提供基础依据。3 结论该研究建立基于 SPME 结合 GC-MS 法测定霉变烟叶中挥发性成分的方法,对影响 SPME 萃取效率的因素(萃取头种类、萃取温度、萃取时间和解吸附时间)进行了优化,得到了较优的萃取条件:采用固定相为 75 m Carboxen-PDMS 涂层的黑头萃取头,在 80 下萃取样品 50 min,萃取头在气相色谱进样口解吸附2 min 的条件下进行测定。对方法的重现性进行考察,6 次测定结果的 RSD 值小于 20%,说明所建立方法具有较好的重现性。基于以上方法步骤,对正常烟叶和霉变烟叶的挥发性化合物进行测定,发现有 8 个化合物存在明显的特征,分别为5-甲基-2-呋喃甲醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、1,2-二甲氧基-苯、2,4-二氯-1-甲氧基-苯、5-甲氧基-6,7-二甲基-苯并呋喃、十六酸甲酯和十六酸。通过监测这些化合物含量的变化可以用于识别烟叶霉变程度,该研究为判定烟叶霉变程度及烟叶霉变预防提供了技术支撑,可降低烟叶霉变带来的经济损失,同时为霉变烟叶的快速识别提供基础依据。参考文献1 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stored products research,2013,52:78-85.(上接第 166 页)提取率的影响大于料液比。由图 6f 可知,固定提取时间为50 min,料液比为 1 6,随着提取温度的升高和乙醇体积分数的增大,苹果多酚提取率先增加后减少,提取温度对苹果多酚提取率的影响大于乙醇体积分数。该试验通过研究超声波功率、提取时间、提取温度、乙醇体积分数、料液比对苹果多酚提取率的影响,使用 Design-Expert 8.0.6 软件设计,优化得出超声波辅助提取花牛苹果幼果中多酚的最佳工艺为:超声波功率 100 W,提取时间50.65 min,乙醇体积分数 70.67%,料液比 1 5.73,提取温度62.39,苹果多酚提取率为 11.620 mg/g。但在实际工艺中为了操作方便,将工艺条件设置为超声波功率 100 W,提取时间 51 min,乙醇体积分数 71%,料液比 1 6,提取温度62,该条件下重复 5 次试验验证工艺的稳定性,幼果多酚平均提取率为 11.586 mg/g,这与理论预测值(11.620 mg/g)接近。可见,试验设计优化得到的花牛苹果幼果多酚提取工艺条件准确、稳定、可行。3 结论该研究在单因素试验的基础上,结合响应面法优化微波辅助法提取苹果多酚的工艺,建立苹果多酚得率的二次多项数学模型。该模型极显著,拟合情况良好。最佳工艺参数:超声波功率 100 W,提取时间51 min,提取温度为62,料液比 1 6,乙 醇 体 积 分 数 71%,苹 果 多 酚 的 提 取 率 为11.586 mg/g。参考文献1 苏梅.我国苹果产业发展存在的问题及对策J.现代农业科技,2013(2):306.2 本刊编辑部.甘肃现代苹果产业蓬勃发展J.甘肃农业,2015(10):1.3 OSADA K,OGION Y,NAKAMURA S,et al.Effect of dietary apple poly-phenol on metabolic disorder of lipid in rats given oxidized cholesterolJ.Proc Jpn Conf Biochem Lipids,1997,39:317-320.4 孙建霞,孙爱东,白卫滨.苹果多酚的功能性质及应用研究J.中国食物与营养,2004(10):38-41.5 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