电生理研究方法.ppt

第二章 心肌电生理学研究方法 Methodology of Myocardium Electrophysiological Research 电生理学技术的发展 18251825年年 电流计发明与应用电流计发明与应用19221922年年 电子管放大器和阴极射线示波器问世电子管放大器和阴极射线示波器问世2020世纪世纪4040年代年代 微电极技术产生微电极技术产生 动作电位的钠学说动作电位的钠学说2020世纪世纪5050年代年代 电压钳技术产生电压钳技术产生2020世纪世纪7070年代年代 膜片钳技术膜片钳技术 谢灵顿谢灵顿(Sherrington)（1857-1952）英国神经生物学家。英国神经生物学家。发现中枢神经反射活动规律发现中枢神经反射活动规律 艾德里安艾德里安(Adrian)（1889-1977）英国生理学家。英国生理学家。阐明动作电位及其传导规律阐明动作电位及其传导规律1932年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖厄兰格厄兰格(Erlanger)（1874-1965）（美）（美）两人合作发明了阴极示波器，并研究了神经纤维的功能两人合作发明了阴极示波器，并研究了神经纤维的功能加塞加塞(Gasser)（1888-1963）（美）（美）1944年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖BernsteinBernstein膜学说膜学说19021902年，年，BernsteinBernstein提出生物电发生的膜学说：提出生物电发生的膜学说：“神经或肌肉的细胞膜只对钾离子有特殊的通透神经或肌肉的细胞膜只对钾离子有特殊的通透性，而对较大的阳离子和阴离子则均无通透性，性，而对较大的阳离子和阴离子则均无通透性，因此由于细胞内外钾离子分布不均匀，在膜两侧因此由于细胞内外钾离子分布不均匀，在膜两侧就形成一个电位差，此即静息电位，神经冲动到就形成一个电位差，此即静息电位，神经冲动到来时，膜变为无选择通透的膜，静息电位消失，来时，膜变为无选择通透的膜，静息电位消失，动作电位因而产生。动作电位因而产生。”离子学说（动作电位的钠学说）离子学说（动作电位的钠学说）1940年前后，由于年前后，由于Hodgkin和和Huxley在枪在枪乌贼巨轴突上发现动作电位大于静息电乌贼巨轴突上发现动作电位大于静息电位的事实，位的事实，Bernstein膜学说受到了有力膜学说受到了有力的打击。以后的研究证实，的打击。以后的研究证实，Bernstein膜膜学说对于离子通透性的假设是不正确的。学说对于离子通透性的假设是不正确的。其被后来的离子学说（钠学说）所代替。其被后来的离子学说（钠学说）所代替。Ecclesu1976年年德德国国马马普普生生物物物物理理化化学学研研究究所所Neher和和Sakmann首首次次 在在青青蛙蛙肌肌细细胞胞上上用用双双电电极极钳钳制制膜膜电电位位的的同同时时，记记录录到到乙乙酰酰胆胆碱碱（Acetylcholine,ACh）激激活活的的单单通通道道离离子子电电流流，从从而而产产生生了了膜片钳技术（膜片钳技术（patch clamp technique）；）；u1980年年Sigworth等等获获得得10-100G的的高高阻阻封封接接（Gigaseal），1981年年Hamill和和Neher等等对对该该技技术术进进行行了了改改进进，引引进进了了全全细细胞胞记录技术，从而使该技术更趋完善；记录技术，从而使该技术更趋完善；u1983年年10月月，Single-Channel Recording一一书书的的问问世世，奠定了膜片钳技术的里程碑。奠定了膜片钳技术的里程碑。Neher Neher Sakmann Sakmann （1944-1944-）（1942-1942-）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜存合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜存合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜存合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。发病机理，并提供治疗的新途径。发病机理，并提供治疗的新途径。发病机理，并提供治疗的新途径。二人共获二人共获二人共获二人共获19911991年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。内尔在实验室进行膜片箝研究工作内尔在实验室进行膜片箝研究工作 1983年年10月第一版月第一版 Single-Channel Recording封面封面电生理获医学诺贝尔奖名单（截止到电生理获医学诺贝尔奖名单（截止到2002年）年）第一节 常规心肌电生理研究技术 在在常常规规心心肌肌电电生生理理研研究究中中，主主要要是是采采用用玻玻璃璃微微电电极极插插入入在在体体或或离离体体心心肌肌细细胞胞内内，记记录录心心肌肌细细胞胞的的跨跨膜膜电电活活动动，并并研研究究各各种种因因素素对其电活动的影响。对其电活动的影响。一、常用电生理仪器v 刺激系统（刺激器等）刺激系统（刺激器等）v 检测系统（电极、换能器）检测系统（电极、换能器）v 放大系统（前置、后置放大器）放大系统（前置、后置放大器）v 记录显示系统记录显示系统(示波器、记录仪、示波器、记录仪、计算机）计算机）1.电子刺激器（Electronic stimulator）电电刺刺激激不不易易损损伤伤组组织织，又又能能定定量量而而准准确确地地 重重 复复 使使 用用。方方 波波（矩矩 形形 波波，square square wavewave）的的幅幅度度、波波宽宽和和频频率率都都可可分分别别进进行行调调节节，所所以以矩矩形形波波电电子子刺刺激激器器可可作作为为理理想想的的刺刺激源。激源。SEN-7203方波刺激脉冲的参数要求：（1）幅度（强度，幅度（强度，amplitudeamplitude）矩形脉冲电压的最大瞬时值矩形脉冲电压的最大瞬时值（2）波宽（刺激持续时间波宽（刺激持续时间 timetime）（3）频率（频率（frequencyfrequency）一个脉冲循环所需的时间为周期，周一个脉冲循环所需的时间为周期，周期期 的倒数（即的倒数（即1S1S内所含的周期数目）内所含的周期数目）称为频率称为频率（4）延迟（延迟（DelayDelay）从触发脉冲到刺激方波的出现，这从触发脉冲到刺激方波的出现，这一段时间称为延迟。一段时间称为延迟。（5）刺激方式（刺激方式（Pattern of Pattern of stimulationstimulation）单刺激、连续刺激、双脉冲刺激单刺激、连续刺激、双脉冲刺激（6）同步输出（同步输出（Synchronized outputSynchronized output）同步脉冲表示一次刺激的时间起点同步脉冲表示一次刺激的时间起点（7）刺激隔离器（Isolator）当对实验动物同时进行刺激和记录生物电时，当对实验动物同时进行刺激和记录生物电时，刺激器输出和放大器输入具有公共接地线，使得刺激器输出和放大器输入具有公共接地线，使得一部分刺激电流流入放大器的输入端，使记录器一部分刺激电流流入放大器的输入端，使记录器记录到一个刺激电流产生的波形，即刺激伪迹。记录到一个刺激电流产生的波形，即刺激伪迹。隔离器切断了刺激电流从公共地线返回的可能，隔离器切断了刺激电流从公共地线返回的可能，减小伪迹并与电位分开。同时，消除减小伪迹并与电位分开。同时，消除5050周交流电周交流电感应造成的干扰。感应造成的干扰。2.微电极放大器（microelectrode amplifier）组组成成：精精密密稳稳压压电电源源、高高输输入入阻阻抗抗探探头头、主主放放大大器器、电电容容补补偿偿电电路路、校校正正电电路、低通滤波电路等路、低通滤波电路等AxopatchAxopatch 200B 200B（AXONAXON，USAUSA）要求：（1 1）足够高的放大能力）足够高的放大能力 （2 2）频率响应范围大）频率响应范围大 0 0100Hz100Hz（3 3）低噪声低噪声 50uV50uV（4 4）高的辨差比（共模抑制比）高的辨差比（共模抑制比）1000:11000:1（5 5）高输入阻抗高输入阻抗 1000M1000M（6 6）低频与高频滤波）低频与高频滤波低频滤波低频滤波-用于变化速度快的生物电变化用于变化速度快的生物电变化高频滤波高频滤波-用于减少噪声，提高信噪比用于减少噪声，提高信噪比3 示波器（oscillograph）要求：要求：高灵敏度高灵敏度 扫描速度快扫描速度快 频率高频率高类型：类型：双线示波器双线示波器 多线示波器多线示波器 长余辉慢扫描示波器长余辉慢扫描示波器 记忆示波器记忆示波器VC-114 贮存和分析电生理实验结果的仪器（1 1）示波照相机示波照相机（2 2）磁带记录仪磁带记录仪（3 3）电子计算机电子计算机A/DA/D转换转换-把生物电（模拟把生物电（模拟 ）信号转换成）信号转换成数字信号数字信号D/AD/A转换转换-把数字信号转换成模拟信号把数字信号转换成模拟信号二 细胞外记录（Extracellular recording）细胞外记录是把电极安放在心肌表面或附近引导心肌组织或细胞的电活动。适应范围：适应范围：（1）长时间的实验；（2）对清醒的、能自由活动的动物研究；（3）从不同组织部位作同时的多导记录；（4）研究非常小的细胞，数量多而难于 孤立起来，接触和穿刺都易于损伤等；（5）研究器官的总的活动。电极：（1）玻璃微电极玻璃微电极（2 2）金属电极）金属电极（3 3）离子选择性电极）离子选择性电极（4 4）单极电极）单极电极（5 5）多管电极）多管电极三 在体心脏电活动的细胞内记录 （intracellular recording in situ）1实验装置 包括浮置式玻璃微电极、微电极推进器、微电极放大器、示波器、照相装置、记录仪、计算机等推进器微放器示波器监听器照相机记录仪计算机打印机微电极微电极心脏心脏2 动物手术动物手术3 3 电极制作要求电极制作要求4 4 插入插入5 5 应用范围应用范围 生理、药理、心肌缺血等生理、药理、心肌缺血等6 6 优点：在近于生理状态下实验，可观察整优点：在近于生理状态下实验，可观察整 体因素对心肌电活动的影响，可研究药物及体因素对心肌电活动的影响，可研究药物及其代谢产物的作用过程，更有利于阐明各种其代谢产物的作用过程，更有利于阐明各种调节因素、致病因素或药物对心肌电生理特调节因素、致病因素或药物对心肌电生理特性的影响机制性的影响机制7 7 缺点：记录不持久，影响因素多缺点：记录不持久，影响因素多四 离体心肌电活动的细胞内记录（intracellular recording in vitro）1 实验装置实验装置2 2 微电极、标准微电极、微推进器微电极、标准微电极、微推进器3 3 浴槽与灌流装置浴槽与灌流装置 生理盐溶液、混合气体、摄氏生理盐溶液、混合气体、摄氏30303737度度4 4 刺激器刺激器 5 5 应用范围应用范围6 6优点优点 稳定、长时间记录，可任意改变溶液成分稳定、长时间记录，可任意改变溶液成分7 7 观察指标观察指标 RP,APA,APD10,APD50,APD90,VmaxRP,APA,APD10,APD50,APD90,Vmax第二节：电压钳制技术(Voltage clamp technique)利利用用微微电电极极技技术术，虽虽然然记记录录到到细细胞胞内内的的电电变变化化过过程程，但但不不能能阐阐明明这这种种变变化化的的原原因因。要要阐阐明明跨跨膜膜电电变变化化机机制制，必必需需应应用用电电压压钳钳制制技技术术。这这一一技技术术首首先先是是由由ColeCole及及其其同同事事设设计计，在在经经HodgkinHodgkin等等人人加加以以改改进进，用用于于神神经经电电生生理理研研究究，弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。一、细胞膜的生物物理特性一、细胞膜的生物物理特性(Biophysical properties of cell membrane)细胞膜主要由脂质和蛋白质构成。以脂质细胞膜主要由脂质和蛋白质构成。以脂质双分子层为支架，镶嵌着不同特性的蛋白质颗双分子层为支架，镶嵌着不同特性的蛋白质颗粒。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的极化粒。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的极化状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质(cable properties)(cable properties)的反映。的反映。(轴浆电阻与膜轴浆电阻与膜电阻、膜电容的组合，使电流对膜电位的影响电阻、膜电容的组合，使电流对膜电位的影响起着依距离而衰减以及在时间上的延缓作用起着依距离而衰减以及在时间上的延缓作用神经的神经的“电缆电缆”性质性质)。细胞膜的电缆特。细胞膜的电缆特性从定的等效电路及其时间常数和空间常数及性从定的等效电路及其时间常数和空间常数及例证实。例证实。(一)细胞膜的等效电路 从从电电学学特特点点上上分分析析，细细胞胞膜膜可可等等效效地地模模拟拟为为电电阻阻电电容容器器。它它具具备备细细胞胞浆浆电电阻阻（纵纵向向电电阻阻，riri），膜膜电电阻阻（横横向向电电阻阻，rmrm），膜膜电电容容（CmCm）和和膜膜电电位位（EmEm）四四方方面面的的电电学学特特性性，根根据据 这这 四四 方方 面面 特特 性性 即即 可可 构构 成成 其其 等等 效效 电电 路路（Equivalent CircuitEquivalent Circuit）。）。outsideinside膜电位等效电路的简化图膜电位等效电路的简化图Cm 膜电容Rm 膜电阻Em 离子平衡电位Ro 细胞外液的纵向电阻（/cm）Ri 轴浆的纵向电阻（/cm）RoCmRmEm+-细细胞胞膜膜的的等等效效电电路路是是一一个个并并联联的的阻阻容容路路，膜膜活活动动时时既既有有电电压压的的改改变变，同同时时又又有有电电流流的的改改变变。电电位位的的改改变变可可引引起起电电容容器器的的充充、放放电电，也也可可用用于于电电阻阻器器上上的的电电流流流流动动。通通过过电电容容器器的的电电流流为为IcIc ，通通过过电电阻阻的的电电流为流为IrIr。1 1 纵向电阻纵向电阻（R Ro o、R Ri i）由由胞胞浆浆的的性性质质所所决决定定，具具有有较较高高的的电电阻阻率率，它它与与直直径径是是反反比比关关系系（直直径径大大、电电阻阻小小，直直径径小小，电电阻阻大大）。由由于于它它的的存存在在，使使生生物物电电的的传传导导主主要要沿沿细细胞胞膜膜所所包包围围的的容容积积导导体体进进行行。它它是是单单位位长长度度的的电电阻阻，单单位位是是/cm/cm，细细胞胞外外间间质质的的容容积积很很大大，其其单单位位长长度度电电阻阻（RoRo）较较RiRi小。小。2.横向电阻（redial resistance）即细胞膜本身具有的膜电阻。细胞膜由双层硷脂构成，厚度很薄，但具有很高的电阻，即绝缘性。膜电阻表示离子通过膜的有限能力。膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电阻（Rm）的大小反映了膜结构电学方面的差异。3.3.膜电容（膜电容（capacitycapacity）表表示示膜膜的的绝绝缘缘及及储储存存电电荷荷的的性性质质。任任何何一一种种装装置置使使两两个个导导体体中中间间插插入入一一个个绝绝缘缘体体并并安安排排在在一一起起，称称为为电电容容器器。细细胞胞外外液液及及细细胞胞内内液液均均为为含含电电解解质质的的溶溶液液，可可看看作作为为两两个个导导体体；细细胞胞膜膜是是含含脂脂质质的的膜膜，可可视视作作为为绝绝缘缘体体。细细胞胞外外液液-细胞膜细胞膜-细胞内液三者组成了电容。细胞内液三者组成了电容。4 4 膜电位膜电位 （membrane potentialmembrane potential）当膜上离子通道开放而引起带电离子跨当膜上离子通道开放而引起带电离子跨膜流动时，就相当于在电容器上充电或放电膜流动时，就相当于在电容器上充电或放电而产生电位差，即跨膜电位。膜电位的高低而产生电位差，即跨膜电位。膜电位的高低决定于跨膜电化学梯度；膜电位的高低与膜决定于跨膜电化学梯度；膜电位的高低与膜两侧的电荷成正比。两侧的电荷成正比。5 5 膜电流（膜电流（membrane currentmembrane current）任何电流都是电容电流（任何电流都是电容电流（IcIc）和和电阻电流（电阻电流（IiIi）两种形式通过细胞膜，前两种形式通过细胞膜，前者导致膜电荷的改变，后者实际上是由离者导致膜电荷的改变，后者实际上是由离子携带流经细胞膜的。子携带流经细胞膜的。I m=IcI m=Ic +Ii +Ii(二)细胞膜的时间常数（time constant）时间常数是指膜电压随时间而改变的过程，时间常数是指膜电压随时间而改变的过程，用一常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随用一常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随时间而改变的（缓慢）程度。也就是膜电位通时间而改变的（缓慢）程度。也就是膜电位通过膜电阻和膜电容充电到过膜电阻和膜电容充电到63%63%或放电到或放电到37%37%所所需的时间。需的时间。=Rm=Rm Cm Cm=膜的时间常数膜的时间常数 (ms(ms）;Rm;Rm=膜电阻（膜电阻（kk）Cm=Cm=膜电容（膜电容（FF）(三三)细胞膜的空间常数（细胞膜的空间常数（space space constantconstant）所谓空间常数，是度量电压的空所谓空间常数，是度量电压的空间衰减，即标志电压依距离而衰减的间衰减，即标志电压依距离而衰减的程度的一个常数。程度的一个常数。第二节 电压钳制技术Voltage clamp technique 利利用用微微电电极极技技术术，虽虽然然记记录录到到细细胞胞内内的的电电变变化化过过程程，但但不不能能阐阐明明这这种种变变化化的的原原因因。要要阐阐明明跨跨膜膜电电变变化化机机制制，必必须须应应用用电电压压钳钳制制技技术术。这这一一技技术术首首先先是是由由ColeCole及及其其同同事事设设计计，在在经经HodgkinHodgkin等等人人加加以以改改进进，用用于于神神经经电电生生理理研研究究，弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。一、细胞膜的生物物理特性(Biophysical properties of cell membrane)细细胞胞膜膜上上以以脂脂质质双双分分子子层层为为支支架架，镶镶嵌嵌着着不不同同特特性性的的蛋蛋白白质质颗颗粒粒。细细胞胞膜膜的的电电紧紧张张及及其其扩扩布布规规律律，膜膜的的极极化化状状态态及及其其形形成成过过程程中中等等都都是是细细胞胞膜膜电电缆缆性性质质(cable(cable properties)properties)的的反反映映。(轴轴浆浆电电阻阻与与膜膜电电阻阻、膜膜电电容容的的组组合合，使使电电流流对对膜膜电电位位的的影影响响起起着着依依距距离离而而衰衰减减以以及及在在时时间间上上的的延延缓缓作作用用神神经经的的“电电缆缆”性性质质)。细细胞胞膜膜的的电电缆缆特特性性从从定定的的等等效效电电路路及及其其时时间间常常数和空间常数及例证实。数和空间常数及例证实。(一)细胞膜的等效电路 从从电电学学特特点点上上分分析析，细细胞胞膜膜可可等等效效地地模模拟拟为为电电阻阻电电容容器器。它它具具备备细细胞胞浆浆电电阻阻（纵纵向向电电阻阻，riri），膜膜电电阻阻（横横向向电电阻阻，rmrm），膜膜电电容容（CmCm）和和膜膜电电位位（EmEm）四四方方面面的的电电学学特特性性，根根据据 这这 四四 方方 面面 特特 性性 即即 可可 构构 成成 其其 等等 效效 电电 路路（Equivalent CircuitEquivalent Circuit）。）。outsideinside膜电位等效电路的简化图膜电位等效电路的简化图Cm Cm 膜电容膜电容RmRm 膜电阻膜电阻EmEm 离子平衡电位离子平衡电位Ro Ro 细胞外液的纵向电阻（细胞外液的纵向电阻（/cm/cm）RiRi 轴浆的纵向电阻（轴浆的纵向电阻（/cm/cm）RoCmRmEm+-离子通道等效于电导 细细胞胞膜膜的的等等效效电电路路是是一一个个并并联联的的阻阻容容路路，膜膜活活动动时时既既有有电电压压的的改改变变，同同时时又又有有电电流流的的改改变变。电电位位的的改改变变可可引引起起电电容容器器的的充充、放放电电，也也可可用用于于电电阻阻器器上上的的电电流流流流动动。通通过过电电容容器器的的电电流流为为IcIc ，通通过过电电阻阻的的电电流为流为IrIr。1 纵向电阻（Ro、Ri）由由胞胞浆浆的的性性质质所所决决定定，具具有有较较高高的的电电阻阻率率，它它与与直直径径是是反反比比关关系系（直直径径大大、电电阻阻小小，直直径径小小，电电阻阻大大）。由由于于它它的的存存在在，使使生生物物电电的的传传导导主主要要沿沿细细胞胞膜膜所所包包围围的的容容积积导导体体进进行行。它它是是单单位位长长度度的的电电阻阻，单单位位是是/cm/cm，细细胞胞外外间间质质的的容容积积很很大大，其其单单位位长长度度电电阻阻（RoRo）较较RiRi小。小。2.横向电阻（redial resistance）即即细细胞胞膜膜本本身身具具有有的的膜膜电电阻阻。细细胞胞膜膜由由双双层层硷硷脂脂构构成成，厚厚度度很很薄薄，但但具具有有很很高高的的电电阻阻，即即绝绝缘缘性性。膜膜电电阻阻表表示示离离子子通通过过膜膜的的有有限限能能力力。膜膜电电阻阻反反映映了了离离子子是是否否容容易易通通透透膜膜的的情情况况。膜膜电电阻阻（RmRm）的的大大小小反映了膜结构电学方面的差异。反映了膜结构电学方面的差异。3.膜电容（capacity）表表示示膜膜的的绝绝缘缘及及储储存存电电荷荷的的性性质质。任任何何一一种种装装置置使使两两个个导导体体中中间间插插入入一一个个绝绝缘缘体体并并安安排排在在一一起起，称称为为电电容容器器。细细胞胞外外液液及及细细胞胞内内液液均均为为含含电电解解质质的的溶溶液液，可可看看作作为为两两个个导导体体；细细胞胞膜膜是是含含脂脂质质的的膜膜，可可视视作作为为绝绝缘缘体体。细细胞胞外外液液-细胞膜细胞膜-细胞内液三者组成了电容。细胞内液三者组成了电容。4 膜电位（membrane potential）当膜上离子通道开放而引起带电离子跨当膜上离子通道开放而引起带电离子跨膜流动时，就相当于在电容器上充电或放电膜流动时，就相当于在电容器上充电或放电而产生电位差，即跨膜电位。膜电位的高低而产生电位差，即跨膜电位。膜电位的高低决定于跨膜电化学梯度；膜电位的高低与膜决定于跨膜电化学梯度；膜电位的高低与膜两侧的电荷成正比。两侧的电荷成正比。5 膜电流（membrane current）任何电流都是电容电流（任何电流都是电容电流（IcIc）和电阻）和电阻电流（电流（IiIi）两种形式通过细胞膜，前者导）两种形式通过细胞膜，前者导致膜电荷的改变，后者实际上是由离子携致膜电荷的改变，后者实际上是由离子携带流经细胞膜的。带流经细胞膜的。I m=IcI m=Ic +Ii +Ii(二)细胞膜的时间常数（time constant）时间常数是指膜电压随时间而改变的过程，时间常数是指膜电压随时间而改变的过程，用一常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随用一常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随时间而改变的（缓慢）程度。也就是膜电位通时间而改变的（缓慢）程度。也就是膜电位通过膜电阻和膜电容充电到过膜电阻和膜电容充电到63%63%或放电到或放电到37%37%所所需的时间。需的时间。=Rm=Rm Cm Cm=膜的时间常数膜的时间常数 (ms(ms）;Rm;Rm=膜电阻（膜电阻（kk）Cm=Cm=膜电容（膜电容（FF）(三)细胞膜的空间常数（space constant）所谓空间常数，是度量电压的空所谓空间常数，是度量电压的空间衰减，即标志电压依距离而衰减的间衰减，即标志电压依距离而衰减的程度的一个常数。程度的一个常数。(一)、定义 利用负反馈原理将膜电位在空间和利用负反馈原理将膜电位在空间和时间上固定于某一恒定的测定值，以研时间上固定于某一恒定的测定值，以研究动作电位产生过程中的离子通透性与究动作电位产生过程中的离子通透性与膜电位之间的依从关系的技术。膜电位之间的依从关系的技术。二、电压钳制技术的方法原理 电电压压钳钳制制术术是是利利用用负负反反馈馈电电路路，在在一一定定时时间间内内将将跨跨膜膜电电位位（Transmembrane Transmembrane PotentialPotential，V Vm m），保保持持在在某某个个选选定定的的电电位位水水平平，此此电电位位称称为为保保持持电电位位（Holding Holding potentialpotential，V Vh h），或或者者使使保保持持电电位位突突然然变变到到某某个个特特定定的的幅幅值值的的方方波波 电电 位位，称称 为为 钳钳 制制 电电 位位（Clamping Clamping potentialpotential）或或指指令令电电位位（Command Command potentialpotential，VcVc）。(二)电压钳方法 电容器电流 Ic=d（CmV）/dt电阻器上电流 IR流过膜的电流总量 Idv/dt =0 所有的电流将都是流过膜电阻的，这种电流将能反映离子的流动。电压钳技术的基本原理电压钳技术的基本原理电压钳技术的基本原理电压钳技术的基本原理 电压源（SG）使膜电位固定在特定的水平，并以放大器（AV）记录，该放大器与一个反馈放大器（AFB）连接，这一反馈电流通过膜，正好抵消因加电压而引起的离子电流，通过电流监视器测量电流。（三）电压钳技术的优缺点：很容易将膜电容电流与离子电流分开；很容易将膜电容电流与离子电流分开；可将膜电流分成不同的成分一可将膜电流分成不同的成分一I INaNa、I IK K、Ica Ica 等（在灌流液中加入或去除某种离子）等（在灌流液中加入或去除某种离子）能能精精确确反反映映由由离离子子通通道道的的开开放放和和关关闭闭，引引起起的的膜膜电电导导的的改改变变，能能把把离离子子通通透透性性变变化化的的时时间间关关系系加以描述。加以描述。能能分分析析离离子子通通透透性性变变化化与与膜膜电电位位的的关关系系，在在研研究电压调节通道的行为方面有很大价值。究电压调节通道的行为方面有很大价值。1 1 优点优点 必必须须在在细细胞胞内内插插入入两两个个电电极极，对对细细胞胞损伤很大；损伤很大；对体积小的细胞，实验难以实现；对体积小的细胞，实验难以实现；对对形形态态复复杂杂的的细细胞胞，很很维维保保持持细细胞胞膜膜各处电位一致；各处电位一致；只只研研究究一一个个细细胞胞上上众众多多通通道道的的综综合合活活动动规律，无法反映单个通道活动的特点规律，无法反映单个通道活动的特点。2 缺点缺点:蛙坐骨神经元单个蛙坐骨神经元单个Ranvier结的电压钳记录结的电压钳记录（四）几种电压钳方法 双微电极法双微电极法 单蔗糖间隙（单蔗糖间隙（Singe Sucrose Gap Singe Sucrose Gap）法）法 双蔗糖间隙（双蔗糖间隙（Double Sucrose GapDouble Sucrose Gap）法）法 电极接触细胞电极接触细胞负压吸引形成负压吸引形成形膜囊泡形膜囊泡提起电极，囊泡与细胞脱离提起电极，囊泡与细胞脱离ABCD第三节 膜片钳制技术 膜片钳制技术膜片钳制技术（patch clamp patch clamp technique)technique)是对一块单独的细胞膜片（或整是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到记到的最小电流可达到pApA级级(10(10-12-12 A)A)。一一 基本原理基本原理 膜膜片片钳钳的的本本质质属属于于电电压压钳钳范范畴畴，其其基基本本工工作作原原理理是是：采采用用经经典典的的负负反反馈馈放放大大技技术术作作电电压压固固定定，但但改改用用细细胞胞外外微微吸吸管管作作电电极极，将将微微电电极极管管尖尖端端与与细细胞胞膜膜表表面面接接触触，经经负负压压抽抽吸吸，形形成成具具极极高高阻阻抗抗的的紧紧密密封封接接，其其电电阻阻值值高高达达10-10010-100千千欧欧（即即G=10G=109 9）。只只有有在在这这种种封封接接存存在在时时，通通过过膜膜电电极极引引导导记记录录的的电电流流才是通过该膜的离子通道电流。才是通过该膜的离子通道电流。膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为15M，如果Rseal高达10G（1010）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。此Ip可为在IV转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。膜片钳与电压钳的区别 膜电位钳制的方法不同；膜电位钳制的方法不同；电位固定的细胞面积不同；电位固定的细胞面积不同；研究的离子通道数目不同；研究的离子通道数目不同；(1)测量部分：(2)串联电阻补偿部分：(3)电容补偿部分：(4)指令信号控制部分：(5)电源部分：膜片钳放大器主要组成:电极电流监视器、灵敏度开关、滤波器开关、方式选择开关。用于校正全细胞记录时，由于电极和细胞内之间的通路电阻所造成的膜电位误差。用 来 补 偿 电 压 突 然 改 变 时引起的电容电流。将一定的电压加入到刺激信号中，形成一指令信号的保持电压。进行电压钳制时，它决定膜电位值，作电流钳制时，则决定电流值。提供放大器各部分的电源。贴附式贴附式全细胞记录模式全细胞记录模式负压吸负压吸内面向外式内面向外式外面向外式外面向外式拉拉细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞拉并暴露于空气中拉并暴露于空气中四种经典记录模式四种经典记录模式(Cell-attached or On cell mode)细胞贴附式膜片（细胞贴附式膜片（cell-attached patch）优优点点：不破坏细胞的完整性，不需要胞内灌流，不影响细胞质且调制系统完整。可研究通过细胞对单通道的调制，也可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动。缺缺点点：不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。由于细胞牢固贴附于微管电极的尖端而得名。它可用于记录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下研究通道的活动。贴附式记录贴附式记录（Cell-attachedrecordingCell-attachedrecording）细胞细胞电极电极细胞膜细胞膜胞外液胞外液胞内液内面向外式膜片(inside-out patch)细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。特特点点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡形成。应应用用：可研究胞内信使物质cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等对受体型通道的调节，以及胞内激素对通道的调节。这种方式可使通道与细胞的调节机制脱耦联，使第二信使直接作用于膜内，引起通道开闭。内面向外记录内面向外记录（Inside-outrecordingInside-outrecording）电极脂质双分子层的内面面向浴液脂质双分子层的内面面向浴液 外面向外式膜片(outside out patch)细胞贴附式膜片形成后，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，再将电极从细胞膜上拔起，但不暴露于空气中，被撕脱下来的膜便形成外面向外式膜片。优点：优点：缺点：缺点：应用：应用：可以任意改变胞外物质的浓度，有利于研究递质对膜离子通道外侧面的作用。实验中难以改变胞内成分，电极管必须充以低钙溶液以防小泡形成。可研究腺苷酸环化酶、蛋白激酶C等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等对受体型的离子通道研究。外面向外记录外面向外记录（Outside-outrecordingOutside-outrecording）Patch-pipette脂质双分子层的外面面向浴液脂质双分子层的外面面向浴液全细胞记录构型(whole cell recording)记录的电流属于宏观电（macroscopical current），是整个细胞离子通道活动形成的总和电流。若采用膜片钳放大器内的电流钳模式，还可以记录细胞的静息电位和动作电位。特特点点：电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快，因而容易控制细胞内液的成分；记录的是许多通道的综合电流，需改变内部介质以分离电流；适合于对小细胞的电压钳位，对直径大于30m的细胞很难实现钳制；该方法使电生理研究的重点从无脊椎动物大细胞中解脱出来，而向人类和哺乳类细胞发展。全细胞记录全细胞记录（Whole-cellrecordingWhole-cellrecording）细胞细胞电极电极细胞膜细胞膜 膜片钳制技术记录方式膜片钳制技术记录方式 穿孔膜片记录技术（perforated patch recording technique）Hom和Marty于1988年首次建立了一种对传统全细胞记录法改进的方法，该方法是基于某些抗生素如制霉菌素（Nystatin），两性霉素B（Amphotericin B）等具有在生物膜上形成通透性孔道的特性，将这类抗生素充灌在电极液中，在形成高阻封接后，可使电极液与细胞内液在电学上相通，因而称作穿孔膜片记录技术。穿孔膜片及穿孔囊泡记录模式穿孔膜片及穿孔囊泡记录模式（Perforated patch and perforated vesicle mode）制霉菌素制霉菌素形成的孔道形成的孔道电极电极受体受体离子通道离子通道提起电极提起电极胞浆胞浆穿孔囊泡穿孔囊泡(外面向外式外面向外式)穿孔膜片穿孔膜片(缓慢全细胞式缓慢全细胞式)技术的优缺点 优点：与全细胞记录相比，该技术相比有如下优点 由抗生素形成的孔道对于等于或大于葡萄糖的分子均不能通过。因此，在全细胞记录时可避免对胞内重要物质的渗析影响，通道电流衰减现象显著减慢，那些对细胞内通讯及通道调控具有重要作用的第二信使物质仍可正常运行。因抗生素形成的孔道对多价离子不通透，故胞内的这些离子的浓度就不受电极液的影响。因此可在全细胞电流记录的同时用Ca2+染料测定胞内游离的Ca2+水平 对细胞的损伤作用明显小于微电极细胞内记 录及膜片钳全细胞记录，记录时间可持续3小时。高阻封接不易被破坏，而全细胞记录的负压脉动式抽吸和电压脉冲易致高阻封接破坏。电极串联电阻较低，膜电容更易补偿。缺点：无法使电极液中的大分子与胞内物质交换。因此研究大分子物质对胞内机制的作用就不能进行。由于电极液与胞内液之间存在Donnan平衡，因此电极液内必须有与细胞内相同浓度的不通透阴离子和Cl-，否则将导致Cl-流出或流入细胞，使阴离子和水