miR-206对肺动脉内皮细胞增殖的影响及机制研究_沈芹.pdf

交通医学2022年第36卷第6期Med J of Communications,2022,Vol.36,No.6文章编号1006-2440（2022）06-0558-05引文格式沈芹，刘晓娜，汤志远，等.miR-206 对肺动脉内皮细胞增殖的影响及机制研究 J.交通医学，2022，36（6）：558-561，565.*基金项目 南通市科技计划项目（JC2021141）；南通市卫生健康委员会科研课题（MB2021004）。*作者简介 沈芹，女，汉族，江苏省南通人，生于 1991 年 5 月，硕士，主治医师，研究方向：肺血管病的诊治。通信作者：黄晋博，E-mail：；李军，E-mail：miR-206 对肺动脉内皮细胞增殖的影响及机制研究*沈芹1*，刘晓娜1，汤志远2，孙飞1，王蓬波1，黄晋博1，李军1（南通大学附属医院1呼吸与危重症医学科；2药学部，江苏226001）摘要目的：探讨 microRNA-206（miR-206）对人肺动脉内皮细胞（human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs）增殖能力的影响及其作用机制。方法：体外培养 HPAECs 细胞株后，分别进行 miR-206 agomir/antagomir 转染，采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）验证转染效果。对转染成功后的 HPAECs 采用 CCK-8 法、EdU 法检测细胞活性和增殖能力，蛋白质印迹法（Western Blot）检测 JAK2-STAT3 信号通路蛋白质表达。以 JAK2 抑制剂AG490（100 nM）处理 HPAECs，采用 CCK-8 法检测细胞增殖能力的变化，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测 HPAECs中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达水平的变化。结果：miR-206 antagomir 组 HPAECs在转染 48 h、72 h 时细胞增殖能力高于 Con 组、agomir-NC 组及 antagomir-NC 组，差异均具有统计学意义（P0.05）。HPAECs 在 miR-206 antagomir 转染后 48 h 增殖率、磷酸化 STAT3、磷酸化 JAK2 表达量高于 Con 组和 antagomir-NC组，差异均具有统计学意义（P0.05）。miR-206 antagomir 组 VEGF 含量显著上升，高于 Con 组、antagomir-NC 和 AG490+miR-206 antagomir 组，差异均具有统计学意义（P0.05）。结论：（1）miR-206 antagomir 促进 HPAECs增殖。（2）抑制 HPAECs miR-206 转录可以上调磷酸化 JAK2 及 STAT3 蛋白表达，该过程能被 JAK2-STAT3 信号通路抑制剂部分逆转。（3）miR-206 antagomir 对 HPAECs 增殖能力的影响可能与促进 VEGF 分泌相关。关键词microRNA-206；人肺动脉内皮细胞；JAK2；STAT3，血管内皮生长因子中图分类号R544.1+6文献标志码ADOI10.19767/ki.32-1412.2022.06.003The role of microRNA-206 in the proliferation of human Pulmonary arteryendothelial cells and its primary mechanismSHEN Qin1,LIU Xiaona1,TANG Zhiyuan2,SUN Fei1,WANG Pengbo1,HUANG Jinbo1,LI Jun1(1Department of Respiratory and Critical Care Medicine；2Department of Pharmacy,the Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001)AbstractObjective:To discuss and probe into the effect of microRNA-206(miR-206)on the proliferation of hu-man pulmonary artery endothelial cells(HPAECs)and its primary mechanism.Methods:After cultured in vitro,HPAECswere transfected with miR-206 agomir/antigomir,and the transfection efficiency was verified by real-time PCR.The cellcounting kit-8(CCK-8)and Edu(5-ethylyl-2-deoxyuridine)methods were used to detect the cell activity and proliferationof HPAECs.The protein expression of JAK2-STAT3 signaling pathway was detected by Western blot(WB).The HPAECswere treated with JAK2 inhibitor AG490(100 nm).The proliferation of HPAECs was detected by CCK-8.The secretion ofvascular endothelial growth factor(VEGF)in HPAECs was detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results:After HPAECs were successfully transfected,the proliferation ability of HPAECs in miR-206 antagomir group wassignificantly higher than that of the other experimental groups at 48 hours and 72 hours(P0.05).After miR-206 antagomirtransfection for 48 h,the proliferation rate of HPAECs increased significantly(P0.05),the expression of phospho STAT3and phospho JAK2 increased significantly(P25 mmHg1，是一种罕见、严重的进行性疾病，患病率约为 15/百万2，尽管治疗方法有所进展，但死亡率仍然很高。PAH发病机制包括持续的血管收缩和异常的进行性血管重塑，并伴有内皮功能障碍、成纤维细胞和平滑肌细胞活化3。PAH 的特点是过度的细胞增殖和对内皮细胞和平滑肌细胞凋亡的抵抗，恢复内皮功能是治疗的共同目标。血管内皮生长因子（VEGF）是内皮细胞增殖、迁移和存活的重要刺激因子，在生理和病理性血管生成中具有重要作用4。有研究发现，过表达VEGF 的间充质干细胞可促进心肌梗死后猪心脏的血管生成和心脏功能5。VEGF 与 VEGFR2 结合导致内皮细胞增殖6。MicroRNAs（miRNAs）是小的非编码基因，通过识别靶基因 3-非翻译区域，阻断翻译或加速其降解来负调控基因表达7。miRNA 通过直接与 VEGF 3UTR 结合，导致 VEGF 表达下调8-9。对缺氧诱导的 PAH 小鼠研究表明，miR-206 可调节肺动脉平滑肌细胞的增殖、凋亡与分化10。本研究评估人肺动脉内皮细胞（HPAEC）内源性 miRNAs 的可能功能和机制，旨在为 PAH 肺动脉内皮修复的分子机制提供新的思路。1材料与方法1.1主要试剂HPAEC 细胞株（中国科学院细胞资 源 库），Phospho-STAT3、STAT3、Phospho-JAK2、JAK2 抗体（碧云天生物科技），miR-206 引物（锐博生物技术有限公司），胎牛血清（FBS）、DMEM 高糖培养基（Gibco，美国），Lipofectamine 2000 转染试剂（Thermo Fisher，美国），Cell Counting Kit-8（CCK-8）（Dojindo Laboratories，日本），EdU Staining Proliferation Kit（锐博生物技术有限公司），人 VEGFA ELISA试剂盒（ab119566）（Abcam，美国），step-one 实时荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems，美国）。1.2细胞培养与转染HPAEC 细胞培养于含 10%FBS 培养基中，置入细胞培养箱 37，5%CO2中培养，4872 h 待细胞完全贴壁后换液。取 2104个对数生长期 HPAECs 细胞接种在 24 孔细胞培养板上，将 100 L antagomir（agomir）/lipofectamin 复合物加到状态良好的 HPAECs 细胞培养板孔中，转染 6 h后换液培养。本实验共设置 5 组：Con 组（对照组），miR-206 agomir 组，miR-206 antagomir 组，agomir-NC 组，antagomir-NC 组。1.3CCK法检测细胞增殖于 96 孔板每孔加入200 L 密度为 5105/mL HPAEC 单细胞悬液，培养72 h。加入 MTT 母液（5 mg/mL）20 L，孵育 4 h。加入二甲亚砜 200 L，充分震荡。采用酶标仪在 490 nm处测定吸光度（A），计算细胞增殖指数。1.4EdU法检测细胞增殖使用预热含 EdU 的各实验组培养基 150 L 培养至 48 h。采用 150 LApollo 染色液（1 200）及 200 L Hoechst 33342（14 000）染色。封片后立即读片或置于 4 冰箱待测。采用组合的细胞图像计数，HPAECs 增殖率=红色细胞数/（红色细胞数+蓝色细胞数）100%。1.5蛋白质印迹法检测蛋白表达转染后 48 h 收集细胞，提取蛋白并定量蛋白浓度。按照常规步骤进行蛋白质印迹法检测，检测抗体为抗 GAPDH 抗体、抗 JAK2/STAT3 磷酸化抗体、抗 JAK2/STAT3 抗体，曝光后进行灰度扫描，记录目的蛋白相对表达量。1.6qRT-PCR检测基因表达细胞转染 24 h 和48 h 后，收集细胞并提取核酸，进行 qRT-PCR 分析。引物设计：miR-206 上游：5-TGGAATGTAAGGAA-GTGTGTGG-3，下游：5-CTCAACTGGTGTCGTGG-AGTC-3。实验重复 3 次，取平均值。1.7ELISA检测VEGF浓度细胞在培养箱中转染48 h，收集细胞上层液体至清洁 EP 管，加入 Biotin-Conjugated Antibody，酶标仪读取 450 nm 处吸光度。根据标准曲线使用 Excel 计算得出上清液中(P0.05),and there was no significant difference in the expression of VEGF(P0.05).Conclusions:(1)miR-206 antagomircould promote the proliferation of HAPECs.(2)Inhibition of miR-206 in HPAECs could regulate the expression of JAK2-STAT3 signal pathway phosphorylated JAK2 and STAT3 protein.The proliferation promoting effect of miR-206 antagomiron HPAECs could be reversed by the inhibitor of JAK2-STAT3 signal pathway.(3)The effect of miR-206 antagomir on theproliferation of HPAECs might be related to the enhancement of VEGF secretion.Key wordsmicroRNA-206;human pulmonary artery endothelial cells;JAK2;STAT3;vascular endothelial growthfactor559交通医学2022年第36卷第6期Med J of Communications,2022,Vol.36,No.6图3miR-206 antagomir对HPAECs增殖能力的影响可能与JAK2-STAT3信号通路有关VEGF 浓度。1.8统计学处理应用 SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以x?s 表示，多组间差异性比较采用单因素方差分析，两组间差异性比较采用 t 检验。P0.05 为差异具有统计学意义。2结果2.1miR-206表达对HPAECs增殖能力的影响2.1.1调控 miR-206 表达对 HPAECs 增殖能力的影响：HPAECs 转染 miR-206 agomir/miR-206 antagomir 6 h 后再换液培养 24 h，利用 RT-PCR 检测miR-206 表达，验证转染是否成功。与 Con 组比较，在 miR-206 agomir 转染 6 h 后，HPAECs 中 miR-206 表达量显著上升，在 miR-206 antagomir 转染 6 h后，HPAECs 中 miR-206 表达量下降，差异均具有统计学意义（P0.05），见图 1A，证明转染成功。CCK8检测显示，miR-206antagomir组HPAECs在转染48 h、72 h 后细胞增殖能力高于 Con 组、agomir-NC 组及antagomir-NC 组，差异均具有统计学意义（P0.05），见图 1B-C。在接下来的实验中采用miR-206 antagomir 转染 48 h 后细胞作为实验对象。2.1.2EdU 法检测 miR-206 antagomir 对 HPAECs增殖能力的影响：为了进一步研究 miR-206 敲降对HPAECs 的影响，采用细胞增殖检测试剂盒（EdU）检测 HPAECs 在转染后 48 h 的增殖率。结果显示，miR-206 antagomir 转染后 48 h，HPAECs 增殖率显著上升，高于 Con 组及 antagomir-NC 组，差异均具有统计学意义（P0.05），见图 2。2.2miR-206 antagomir对HPAECs增殖能力的影响可能与JAK2-STAT3信号通路有关HPAECs转染 48 h 后收集细胞蛋白，结果显示，与 Con 组及antagomir-NC 组比较，miR-206 antagomir 转染组HPAECs 磷酸化 JAK2/STAT3 水平显著升高，差异均具有统计学意义（P0.05），见图 4。提示 miR-206 antagomir 对HPAECs的增殖促进作用被逆转。2.4miR-206 antagomir对HPAECs分泌VEGF水平的影响转染后 48 h 收集各实验组细胞上清液，采用 ELISA 检测上清液中 VEGF 水平。结果显示，miR-206 antagomir 组 VEGF 含量显著上升，高于Con 组、antagomir-NC 和 AG 490+miR-206 antagomir组，差异均具有统计学意义（P0.05），见图 5。推测miR-206 antagomir 能够促进 HPAECs 分泌 VEGF，可能是其影响 HPAEC 增殖能力的因素之一。3讨论肺动脉高压的临床表现缺乏特异性，往往患者出现呼吸困难、胸痛症状时已有右心肥大、右心功能衰竭。我国肺动脉高压诊断和治疗已取得长足进步，但缺乏早期阶段的预防和处理，未能对高危患者及时采取药物和（或）机械措施干预。肺血管内皮功能紊乱是影响肺高血压发生发展的重要因素，调节内皮细胞紊乱是防治 PAH 的研究热点。很多抗氧化剂如外源性 SOD、黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇、维生素 C 等具有内皮保护作用，在动物试验中取得很好效果，但真正能临床应用还很有限。目前临床治疗 PAH 的药物着力于延缓肺血管重构以及缓解右心功能不全引起的一系列症状。肺血管重构是 PAH 最基本的病理特征，涉及实质细胞（如内皮细胞、平滑肌细胞）和血管间质（如细胞外基质）改变，表现为血管平滑肌细胞增生肥大、内皮细胞功能紊乱和细胞外基质沉积等。寻找新的生物靶点抑制肺动脉内皮细胞异常增殖对防治 PAH 发生发展具有重要意义。大量研究表明，肿瘤细胞中 miR-206 表达失调在肿瘤细胞生长、增殖、凋亡，侵袭、转移、甚至耐药中扮演重要角色。在 PAH 病理发展中，血管相关细胞的异常增殖与癌症中癌细胞的异常分裂增殖有许多类似的异常激活途径，推测 miR-206 可能在 PAH的发生发展中也发挥重要作用。本研究对体外培养的 HPAECs 分别进行 miR-206 agomir/antagomir 转染，结果表明 miR-206 antagomir 可以促进 HPAECs增殖。抑制 miR-206 转录可以促进磷酸化 JAK2 及STAT3 蛋白表达上调，JAK2-STAT3 信号通路抑制剂能部分逆转 miR-206 antagomir 对 HPAECs 的促增殖作用，miR-206 antagomir 对 HPAECs 增殖能力的影响可能与促进 VEGF 分泌相关。综上所述，HPAECs 中 miR-206 低表达可以促进 HPAECs 增殖，这可能与激活 JAK2-STST3 信号通路磷酸化，调控 VEGF 分泌有关。参考文献1 BARSTR J，MCGOON M，TORBICKI A，et al.Diagnosis anddifferential assessment of pulmonary arterial hypertensionJ.J Am Coll Cardiol，2004，43（12 suppl s）：40S-47S.图4AG 490影响miR-206 antagomir转染后的HPAECs活性图5miR-206 antagomir对HPAECs分泌VEGF水平的影响（下转第565页）561交通医学2022年第36卷第6期Med J of Communications,2022,Vol.36,No.6（上接第561页）2 THENAPPAN T，RYANJ J，ARCHERS L.Evolving epidemiology of pulmonary arterial hypertension J.Am J RespirCrit Care Med，2012，186（8）：707-709.3 TUDERR M，ABMANS H，BRAUN T，et al.Developmentand pathology of pulmonary hypertension J.J Am Coll Cardiol，2009，54（1 suppl）：S3-S9.4 FERRARA N，HILLANK J，GERBERH P，et al.Discoveryand development of bevacizumab，an anti-VEGF antibody fortreating cancer J.Nat Rev Drug Discov，2004，3（5）：391-400.5 LU F，ZHAO X，WU J，et al.MSCs transfected with hepatocyte growth factor or vascular endothelial growth factor improve cardiac function in the infarcted porcine heart by increasing angiogenesis and reducing fibrosis J.Int J Cardiol，2013，167（6）：2524-2532.6 RAHIMI N.VEGFR-1 and VEGFR-2：two non-identicaltwins with a unique physiognomy J.Front Biosci，2006，11：818-829.7 BARTELD P.microRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function J.Cell，2004，116（2）：281-297.8 ALMEIDAM I，SILVAA M，VASCONCELOSD M，et al.miR-195 in human primary mesenchymal 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