2012-2020年江苏省...希菌O157_H7监测结果_袁义平.pdf

河南预防医学杂志2023 年 2 月第 34 卷第 2 期Henan J Prev Med，Feb.2023，Vol.34,No.22012-2020 年江苏省东台市大肠埃希菌O157:H7 监测结果袁义平，陈林江苏省东台市疾病预防控制中心，江苏 盐城 224200摘要：目的了解东台市肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157:H7 在不同来源标本（腹泻患者、食品、家畜、昆虫）中的分布情况，为 EHEC O157:H7 的防控提供科学依据。方法采集东台市四个乡镇腹泻病人及动物的粪便、生熟肉制品和苍蝇进行病原菌分离培养、鉴定、毒力基因检测。结果2012-2020 年共采集各类标本 6 129 份，检出 74 株 EHECO157:H7，检出率为 1.21%。其中四种动物粪便中共检出 71 株，牛羊猪鸡分别为 35、27、7、2 株，腹泻病人共检出 3 株，检出率分别为 4.86%、3.66%、0.96%、0.27%、0.13%，牛羊带菌率最高。各年份检出率差异有统计学意义（2=120.013，P0.01）。经毒力基因检测，stx2+eaeA+hly+31 株，eaeA+hly+41 株，另 2 株不带任何毒力基因，带毒率 97.30%。四种毒力基因检出率差异有统计学意义（P0.01）。结论肠出血性大肠埃希菌 O157:H7 在东台市不同宿主动物和腹泻患者中均有检出，牛、羊是东台市肠出血性大肠埃希菌 O157:H7 的主要宿主动物，应进一步加强对两种动物及粪便的管理。关键词：肠出血性大肠杆菌 O157:H7；带菌率；毒力基因中图分类号：R181.8文献标识码：B文章编号：1006-8414(2023)02-0148-05Monitoring results of Escherichia coli O157:H7 in Dongtai city,Jiangsuprovince,2012-2020YUAN Yiping,CHEN LinDongtai Center for Disease Control and Prevention,Dongtai City,Yancheng 224200,ChinaCorresponding author:CHEN Lin,E-mail:Abstract:Objective To understand the distribution of Enterohemorrhagic Escherichia coli（EHEC）O157:H7 in the samples ofdifferent sources(patients with diarrhea,food,livestock,insects)in Dongtai city,and provide a scientific basis for the preventionand control of EHEC O157:H7 in Jiangsu province.Methods The samples of feces,raw and cooked meat products and flies ofdiarrhea patients and animals in four townships of Dongtai city were collected for isolation,culture,identification and virulencegene testing of pathogenic bacteria.Results From 2012 to 2020,a total of 6 129 samples of various types were collected,and 74strains of Escherichia coli O157:H7 were detected,and the positive rate was 1.21%.Among them,a total of 71 strains weredetected in the feces of four animals,including cattle(35),sheep(27),pigs(7),and chickens(2),and in patients with diarrhea（3）,with the detection rates of 4.86%,3.66%,0.96%,0.27%,and 0.13%,respectively,and the bacteria carrying rates in cattleand sheep were the highest.The difference of positivity rates by year was statistically significant(2=120.013,P0.01).Thevirulence gene testing showed that 31 strains carried stx2+eaeA+hly+,41 strains carried eaeA+hly+,and the other 2 strains did notcarry any virulence genes,with a toxicity rate of 97.30%.There was a statistically significant difference in detection ratesbetween the four virulence genes(P0.01).Conclusion EHEC O157:H7 has been detected in different host animals andpatients with diarrhea in Dongtai city,and cattle and sheep are the main host animals of EHEC O157:H7 in Dongtai city,and themanagement of the two animals and feces should be further strengthened.Keywords:Enterohemorrhagic escherichia coli O157:H7;Carrier rate;Virulence gene作者简介：袁义平，本科，副主任技师，主要从事微生物检验工作通信作者：陈林，E-mail:肠出血性大肠埃希菌（EHEC）是携带一种或一种以上产志贺毒素的大肠埃希菌的总称，故又称产志贺DOI:10.13515/ki.hnjpm.1006-8414.2023.02.015 应用研究 148 河南预防医学杂志2023 年 2 月第 34 卷第 2 期Henan J Prev Med，Feb.2023，Vol.34,No.2表 1大肠埃希菌毒力基因的引物序列、退火温度及片段大小毒力基因引物序列退火温度（）片段大小（bp）stx1FCCATGACAACGGACAGCAGTT56779Stx1RCCTGTCAACTGAGCACTTTGstx2FACACTGGATGATCTCAGTGG56614stx2RCTGAATCCCCCTCCATTATGeaeAFAAGCGACTGAGGTCACT56450eaeARACGCTGCTCACTAGATGThlyFCACACGGAGCTTATAATATTCTGTCA56340hlyRAATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT毒素大肠埃希菌，其可引起水样腹泻、出血性肠炎及溶血性尿毒综合征（HUS）等病死率高的疾病1-2。O157:H7 是 EHEC 的重要血清型，1999 年我国苏皖地区暴发了较大规模的 EHEC O157:H7 感染疫情，血清流行病学调查结果显示约 2 万人感染，HUS 住院病例 195 例，死亡 177 例。为此，2000 年卫生部发布了全国肠出血性大肠杆菌产志贺毒素大肠杆菌O157:H7 感染性腹泻监测方案（试行）3，加强我国安徽、江苏、河南及山东四省重点地区 O157:H7 的主动监测工作4。东台市和铜山市作为江苏省设立的两个EHEC O157:H7 的国家级监测哨点，已连续二十年为国家 EHEC O157:H7 主动监测项目提供数据。本研究对 2012-2020 年东台市基于该监测项目收集的O157:H7 数据进行分析，旨在为江苏省 EHEC O157:H7 的防控提供循证依据。1材料与方法1.1标本来源收集 2012-2020 年每年 5 月和 9 月东台市五烈、安丰、台南、四灶四个乡镇各一个村牛、羊、猪、鸡四种动物的新鲜粪便共 2 916 份，四个乡镇卫生院就诊的腹泻患者粪便标本 2 258 份。7 月份除采集腹泻患者粪便标本外，还采集腹泻患者家中苍蝇标本 450 份，并采集市售生熟牛、羊、猪、鸡肉 505 份（采集于不同菜场、零售点），四种动物粪便由东台市疾控中心急性传染病防制科工作人员经乡镇卫生院人员陪同农户家上门采样，腹泻病人由所在乡镇卫生院采样送检。东台市疾控中心检验科负责样本的分离培养、鉴定，江苏省疾控中心病原微生物所负责阳性标本的毒力基因检测。所有标本均冷藏保存，并及时送检。1.2主要仪器和试剂改良 EC 肉汤增菌培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；E.coliO157 免疫磁珠购自挪威 DYnalA.SD；法国科玛嘉显色琼脂购自上海欣中生物工程有限公司；大肠杆菌 O157 诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司；1%新生霉素购自杭州滨和微生物试剂有限公司；API20E 生化试剂购自梅里埃诊断产品（上海）有限公司；Taq DNA 聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖为 BioAsia 分装品；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 实验试剂由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。主要仪器包括 PCR 扩增仪 PTC-200（美国 MJ Research 公司）、凝胶成像系统 Gel Doc XR（美国 Bio-Rad 公司）。1.3方法1.3.1分离与鉴定按照 全国肠出血性大肠杆菌产志贺毒素大肠杆菌 O157:H7 感染性腹泻监测方案（试行）对收集的标本进行分离培养：将待检样品加入到改良 EC 肉汤（含 1%的新生霉素）中，经免疫磁珠富菌后，接种科玛嘉显色平板，挑取红色或紫红色可疑菌落，进行生化鉴定为大肠杆菌后，进行血清学鉴定。1.3.2毒力基因检测血清学鉴定为 O157 的菌株采用煮沸法提取细菌的基因组 DNA。应用 PCR 法检测 stx1、stx2、hly 和 eaeA 4 种毒力基因。毒力相关基因检测引物序列及扩增条件见表 1。毒力基因检测的阳性参考株为 EHEC O157：H7 EDL933。PCR 的反应条件为：94 预变性 7 min，94 变性 30 s，56 退火40 s，72 延伸 40 s，25 个循坏，72 延伸 5 min。对检出 的 74 株 EHEC O157：H7 检 测 stx1、stx2、hly 和eaeA 4 种毒力基因，对检测结果进行分析5。1.4统计分析使用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，采用描述流行病学方法分析不同标本的 O157:H7 菌株检出率、毒力基因检出率和基因谱；率的比较采用2检验或 Fisher 确切概率法，检验水准=0.05。2结果2.1大肠埃希菌 O157:H7 菌株分离情况2012-2020 年收集东台市安丰、台南、五烈、四灶四乡镇家149 河南预防医学杂志2023 年 2 月第 34 卷第 2 期Henan J Prev Med，Feb.2023，Vol.34,No.2表 374 株 O157:H7 毒力基因检测结果样品类型送检数检出数检出率(%)stx1stx2eaeAhly检出数检出数检出数检出数检出率(%)牛粪720354.8600.00233.19354.86354.86羊粪738273.6600.0060.81273.66273.66猪粪72770.9600.0000.0060.8360.83鸡粪73120.2700.0000.0010.1410.14腹泻病人2 25830.1300.0020.0930.1330.13肉制品、苍蝇95500.0000.0000.0000.0000.00合计6 129741.2100.00310.51721.17721.17P 值0.01a0.01a0.01a检出率(%)检出率(%)检出率(%)表 24 种动物宿主和腹泻患者粪便、肉制品和苍蝇中 0157：H7 检测情况n(%)年份牛粪猪粪羊粪鸡粪腹泻病人肉制品、苍蝇合计样本数样本数样本数样本数样本数样本数样本数检出2012806（7.50)810(0.00)829(10.97)810(0.00)2500(0.00)1060(0.00)68015(2.21)20137821(26.92)826(7.32)826(7.32)811(1.23)2561(0.39)1060(0.00)68335(5.12)2014810(0.00)800(0.00)850(0.00)800(0.00)2502(0.80)1060(0.00)6822(0.29)2015805(6.25)800(0.00)800(0.00)800(0.00)2500(0.00)1060(0.00)6765(0.74)2016810(0.00)800(0.00)800(0.00)830(0.00)2520(0.00)1060(0.00)6820(0.00)2017800(0.00)801(1.25)805(6.25)821(1.22)2500(0.00)1060(0.00)6787(1.03)2018800(0.00)840(0.00)810(0.00)840(0.00)2500(0.00)1060(0.00)6850(0.00)2019800(0.00)800(0.00)883(3.41)800(0.00)2500(0.00)1070(0.00)6853(0.44)2020803(3.75)800(0.00)804(5.00)800(0.00)2500(0.00)1060(0.00)6787(1.03)合计72035(4.86)7277(0.96)73827(3.66)7312(0.27)2 2583(0.13)9550(0.00)6 12974(1.21)检出检出检出检出检出检出禽家畜粪便、腹泻患者粪便、生熟肉制品、苍蝇标本共计 6 129 份，分离 O157:H7 74 份，总检出率为 1.21%。其中牛粪、羊粪、腹泻患者粪便检出率分别为 4.86%、3.66%、0.13%，肉制品和苍蝇中未能检出。7 种标本中以牛粪的检出率为最高（4.86%），羊粪的检出率次之（3.66%）。不同类型标本间检出率差异有统计学意义（2=156.992，P0.01)。各年份检出率差异有统计学意义（2=120.013，P0.01）。见表 2。2.2毒力基因检测情况6 129 份样品中共检出大肠埃希菌 O157:H7 74 株，除 2 株不携带任何一种毒力基因（猪源和鸡源各 1 株）外，其余 72 株均携带有部分毒力基因。四种毒力基因 stx1、stx2、hly 和 eaeA总的检出率分别为 0.00%、0.51%、1.17%和 1.17%。四种毒力基因检出率差异有统计学意义（P0.01）。stx2毒力基因在牛粪、羊粪、腹泻病人粪便中的分布情况分别为：23 株（3.19%）、6 株（0.81%）、2 株（0.09%），其余标本均未检出携带 stx2 毒力基因的菌株，stx2 毒力基因在不同样本中的差异有统计学意义（P0.01）。eaeA 毒力基因在牛粪、羊粪、猪粪、鸡粪、腹泻病人粪便 中 的 分 布 情 况 分 别 为：35 株（4.86%）、27 株（3.66%）、6 株（0.83%）、1 株（0.14%）和 3 株（0.13%）（P0.01）。hly毒力基因在牛粪、羊粪、猪粪、鸡粪、腹泻病人粪便中的分布情况分别为：35 株（4.86%）、27 株（3.66%）、6 株（0.83%）、1 株（0.14%）和 3 株（0.13%）（P0.01）。见表 3。74 株 O157:H7 具有三种毒力基因谱 stx2+eaeA+hly+、eaeA+hly+、stx2-eaeA-hly-。stx2+eaeA+hly+在腹泻病人标本携带率最高（2 株，66.66%），牛粪标本中携带数最多（23 株）。eaeA+hly+在猪源标本携带率最高（6株，85.71%），stx2+eaeA+hly+、eaeA+hly+、stx2-eaeA-hly-在不同标本中的分布构成差异均有统计学意义（P0.05）。见表 4。注：a为 Fisher 确切概率法。150 河南预防医学杂志2023 年 2 月第 34 卷第 2 期Henan J Prev Med，Feb.2023，Vol.34,No.2来源阳性数毒力基因携带数stx2+eaeA+hly+eaeA+hly+stx2-eaeA-hly-牛353523(65.71)12(34.29)0(0.00)羊27276(22.22)21(77.78)0(0.00)猪760(0.00)6(85.71)1(14.29)鸡210(0.00)1(50.00)1(50.00)腹泻病人332(66.66)1(33.33)0(0.00)合计747231(41.89)41(55.41)2(2.70)P 值0.01a0.003a0.009a表 4肠出血性大肠杆菌 O157：H7 菌株毒力检测情况n(%)3讨论牛、羊、猪、鸡等动物是 O157：H7 的重要贮存宿主，由粪便排菌污染环境及食物。近年，我国已陆续有十多个省份在食品、家禽、家畜、昆虫、腹泻病患者中检出该潜在致病菌，存在着疫情爆发、流行的威胁6-7。感染 O157：H7 在现阶段缺乏有效的预防和治疗手段，因此需要有快速、高效的检测技术方法，使得疫情得到快速处置。免疫磁珠捕获样品增菌液中的目的菌，排除其他杂菌对结果的干扰，提高了检出率。本研究结果显示，宿主动物和腹泻病人的标本中均能检测到 O157:H7，牛、羊仍是东台市大肠埃希菌 O157:H7主要携带宿主，牛的带菌率最高，与已有的研究结果一致8。腹泻患者检出 O157:H7 主要在 2013、2014年，后续连续 6 年未能监测到。肉制品在这一监测周期未能检出 O157:H7，这说明肉制品市场卫生状况较好，在屠宰、运输、销售的环节没有受到污染。苍蝇在这一监测周期亦未能检出。EHEC O157:H7 的主要致病因子是志贺毒素，由stx 基因编码，是引起人类溶血性尿毒综合征和血栓性血小板减少性紫癜的主要毒力因子，可分为志贺毒素 1 型和志贺毒素 2 型。除此之外，hly 和 eaeA 基因编码的溶血素和对上皮细胞的粘附素也是重要的致病因子。本研究显示，6 129 份标本中，分离有 31 株为携带 stx2 基因的 O157:H7 菌株，占 0.51%。腹泻病人粪中检出的菌 stx2 毒力基因携带率最高，牛、羊粪检出的检出绝对数居多。腹泻病人中的 EHEC O157：H7感染情况少见，仅在 2013 年腹泻病人粪便中检出 2株。与参考文献9相比，江苏省东台市的人、动物粪便标本 EHEC O157：H7 阳性检出率远远低于江苏省徐州市 1999-2011 年的监测结果10。原因可能是文献中O157 分离率包含了不产毒 O157:H7。此外，本监测点分离到的大肠埃希菌 O157:H7 具有三种毒力基因谱stx2+eaeA+hly+、eaeA+hly+、stx2-eaeA-hly-。stx2+eaeA+hly+毒力基因谱检出率为 41.89%，低于 2004 江苏省O157:H7 的监测结果10。stx2+eaeA+hly+在腹泻病人标本携带率最高，eaeA+hly+猪源标本携带率最高。stx2+eaeA+hly+毒力基因谱由此可见，本监测点 O157:H7 分离株主要分为肠出血性大肠埃希菌和肠致病性大肠埃希菌两类，牛源的菌株多为肠出血性大肠埃希菌，羊源的菌株多为肠致病性大肠埃希菌。综上所述，EHEC O157:H7 国家级监测点东台市2012-2021 年 EHEC O157：H7 分离率为 1.21%，牛、羊是主要的携带者。值得关注的是，近两年我们分离得到的菌株多为非产志贺毒素 O157：H7，志贺毒素（STS）主要包含两种不同抗原性形式 stx1 和 stx2，从毒力基因检测结果看，所有样本均未检测出 stx1，stx2检出 31 株，占阳性数的 41.89%。stx2 各年份检出率差异有统计学意义，分析其原因可能为分离过程中毒力丢失，或者可能是近几年我省 EHEC O157：H7 处于非流行期，或者也可能是由于检测手段单一，肠出血性大肠埃希菌的血清型由以往常见的 O157:H7 更迭为其他血清型而未被发现，这需要我们改进监测手段，加强对肠出血性大肠埃希菌的全面监测。致谢本文毒力基因数据来自江苏省疾控中心，特别鸣谢江苏省疾控中心董晨老师参考文献1马婉婉,苏斌,吴家兵,等.安徽省 20052018 年肠出血性大肠杆菌O157:H7监测结果分析J.安徽预防医学杂志,2020,26(1):1-3+37.2白向宁,孟琼,赵爱兰,等.非 O157 产志贺毒素大肠杆菌分离培养方法研究进展J.中华预防医学杂志,2013,47(8):764-766.3中华人民共和国卫生部.全国肠出血性大肠杆菌产志贺毒素大肠杆菌 O157:H7 感染性腹泻监测方案（试行）Z.北京:中华人民共和国卫生部,2000.4XIONG YP,WANG,et al.A novel Escherichia coli O157:H7clone causing a major hemolytic uremic syndrome outbreak inChina.J.PLoS One,2012,7(4):e36144.5郭喜玲,史智扬,顾玲,等.应用多重引物 PCR 技术检测O157:H7 毒力基因J.中华流行病学杂志,2000,21(6):410-412.6汪华,景怀琦,李红卫,等.江苏省淮北地区肠出血性大肠埃希菌 O157:H7 感染性腹泻并发急性肾衰的研究J.中华流行病学杂志,2004,25(11):24-26.7秦淑文,吕华坤,缪梓萍,等.浙江省肠出血性大肠杆菌 O157:H7 动物宿主带菌情况调查J.浙江预防医学,2010,22(10):1-3.8王涛,刘丽云,王娉,等.我国分离的大肠埃希菌 O157:H7 的毒力基因检测分析J.中国人兽共患病学报,2010,26(6):515-注：a为 Fisher 确切概率法。151 河南预防医学杂志2023 年 2 月第 34 卷第 2 期Henan J Prev Med，Feb.2023，Vol.34,No.215郭淳.狂犬病病例的流行病学特征及暴露后预防处置门诊地理可及性研究D.武汉:华中科技大学,2019。16余春,王定明,唐光鹏,等.663 例狂犬病个案流行病学调查分析J.医学动物防制,2016,32(2):145-147.17湖北省第十三届人民代表大会常务委员会.湖北省动物防疫条例N.湖北日报,2021-12-09(8).18山东省人民代表大会常务委员会关于批准 聊城市养犬管理条例 的决定J.山东省人民代表大会常务委员会公报,2020(3):551-560.收稿日期：2022-07-26（上接 117 页）518.9刘加彬,张雷,杨晋川,等.江苏省徐州市肠出血性大肠埃希菌 O157:H7 感染性腹泻的监测研究J.疾病监测,2012,27(4):285-287.10张艺飓,朱凤才,顾玲,等.江苏省肠出血性大肠杆菌 O157:H7 监测资料分析J.江苏预防医学,2004,15(2):3-5.收稿日期：2022-05-20编校中数字正确使用规范1、阿拉伯数字正确使用（1）4 位和 4 位以上数字分节，采用加 1/4 汉字空（或 1/2 阿拉伯数字空）法代替千分撇“，”分节法。年份、部队代号、仪器型号等非计量数字不分节。（2）多位数不能断开转行，如 0.25、23不能将“0.”“23”置行末，而将“25”“%”转至下行首。2、数值范围 数值范围号一律采用浪纹线“”表示，不能采用半字线“-”和二字线“”，也不宜使用一字线“”。但 18%25不得写成 1825%；“31095109”不得写成“35109”，但可写成“（35）109”；表示单位相同的数值范围可将前一数字后单位符号省去，如“10 mmol/L15 mmol/L”可写成“1015 mmol/L”。3、公差表示“73.6 mg/m316.5 mg/m3”可写成“(73.616.5)mg/m3，但不能写成“73.616.5 mg/m3”；“55%4%”写成“(554)%”，但不能写成“554%”。4、并列数值 一组计量单位相同的数值并列出现时，除最后一个数值外，前面的数值单位均可省去，如“0.71 mg、0.34 mg、0.61 mg”可写成“0.71、0.34 和 0.61 mg”。5、数字使用中的注意事项（1）尾数“0”多于 5 位以上数字，可以改写为以万和亿为单位的数。一般情况下不得以十、百、千、十万、百万、千万、十亿、百亿、千亿等作单位（百、千、兆等词头除外）。例如：1 800 000 可写成 180 万；142 500 可写成 14.25 万，不能写成 14 万 2 千 5 百；5 000 字不能写成 5 千字。（2）纯小数必须写出小数点前用以定位的“0”。数值有效位数末尾的“0”也不能省略，应全部写出。例如：1.500、1.750、2.000 不能写作 1.5、1.75、2。（3）数值的修约按照 GB/T8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定 进行，其简明口诀为“4 舍 6 入 5 看齐，5 后有数进上去，尾数为 0 向左看，左数奇进偶舍弃”。例如：修约到一位小数，12.149 修约为 12.1，12.169 修约为 12.2，12.150 修约为 12.2，12.250 修约为 12.2，12.251 修约为 12.3。（4）附带长度单位的数值相乘，每个数值后单位不能省略。例如：5 cm8 cm10 cm，不能写成5810 cm或 5810 cm3。（5）多位数的阿拉伯数字不能拆开转行。152