生物化学实验期末蚕豆病设计性实验报告.ppt

生物化学生物化学实验实验期末蚕豆病期末蚕豆病设计设计性性实验报实验报告告案例分析案例分析 案例分析案例分析v案例：案例：v 患儿，男性，患儿，男性，3岁，因岁，因面色苍白伴血尿面色苍白伴血尿1天入院。天入院。1天前天前食用新鲜蚕豆食用新鲜蚕豆后，今日出现后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样恶心、呕吐、排尿呈酱油样（发生溶血性贫血）色（发生溶血性贫血）色，面色苍白。据家长反映，患者的，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。姐姐也曾发生过类似情况。v 体格检查：体格检查：体温体温38，脉搏脉搏150次次/分分，呼吸呼吸40次次/分分，血压血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩皮肤及巩c膜黄染膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：实验室检查：红细胞红细胞 1.981012/L，血红蛋白血红蛋白53g/L，血清，血清总胆红素总胆红素85.5mol/L，结合胆红素，结合胆红素13.7mol/L，未结合，未结合胆红素胆红素71.8mol/L，尿蛋白（，尿蛋白（+），潜血），潜血(+)，尿胆红素，尿胆红素()，尿胆素原，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。，尿液镜下未见红细胞。红细胞红细胞 1.981012/L （6.0-7.0）1012/L 血红蛋白血红蛋白 53g/L （170-200)g/L 血清总胆红素血清总胆红素 85.5mol/L （3.4-17.1）mol/L 结合胆红素结合胆红素 13.7mol/L 03.42mol/L 未结合胆红素未结合胆红素 71.8mol/L 013.68mol/L 尿蛋白（尿蛋白（+）潜血潜血(+)尿胆红素尿胆红素()尿胆素原尿胆素原(+)实验室检查项目实验室检查项目正常值正常值患儿检查值患儿检查值案例分析案例分析 皮肤及巩膜黄染皮肤及巩膜黄染 黄疸黄疸发病前曾食用发病前曾食用蚕豆蚕豆其姐亦类似病史其姐亦类似病史Bp：80/60mmHgP：150bpm 排尿呈酱油样排尿呈酱油样溶血性贫血溶血性贫血T：38 体温升高体温升高B:40bpm呼吸急促呼吸急促蚕豆病蚕豆病红细胞葡萄糖红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症磷酸脱氢酶缺乏症1案例分析案例分析设计实验设计实验 G6PD基因分析基因分析G6PD确诊试验确诊试验红细胞红细胞G6PD活性测定活性测定G6PD荧光斑点试验荧光斑点试验G6PD筛选试验筛选试验高铁血红蛋白还原试验高铁血红蛋白还原试验特异性不高特异性不高国际血液学标准化委员会国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐推荐 实验设计实验设计G6PDG6PD荧光斑点试验荧光斑点试验22 G6PD 实验原理：实验原理：葡萄糖葡萄糖-6-磷酸（磷酸（G6P）在）在G6PD作用下形成作用下形成6-磷酸葡萄糖（磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使同时使NADP转变为转变为NADPH,后者后者在在340nm波长紫外线照射下产生荧光波长紫外线照射下产生荧光。所以将含有。所以将含有G6P和和NADP等的混合试剂与血混匀，通过观察滤纸上有等的混合试剂与血混匀，通过观察滤纸上有荧光出现荧光出现时间可判断时间可判断G6PD活性活性。NADP NADPH G6P 6PGA实验原理实验原理340nm紫外线荧光荧光试剂：试剂：10mmol/L G6P钠盐、钠盐、7.5mmol/L NADP、1g/dL皂素、皂素、250mmol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.4），），蒸馏水蒸馏水仪器：仪器：长波紫外灯、滤纸、水浴箱长波紫外灯、滤纸、水浴箱G6PDG6PD荧光斑点试验荧光斑点试验 实验流程实验流程G6PDG6PD荧光斑点试验荧光斑点试验 1反应液的配制：反应液的配制：10mmol/l G6P钠盐钠盐0.1ml、7.5mmol/l NADP0.1ml、1g/dl皂素皂素0.2ml、250mmol/l磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲液（液（pH7.4）0.3ml，蒸馏水，蒸馏水0.3ml混匀。混匀。其中除皂素外，均可于其中除皂素外，均可于4下保存半月，皂素必须新鲜下保存半月，皂素必须新鲜配制。反应混合液在室温和冰箱中均不易保存。因此最配制。反应混合液在室温和冰箱中均不易保存。因此最好在临用前根据用量临时混合。好在临用前根据用量临时混合。3.取试管，加取试管，加10l全血全血+100l反应液，混匀，取一滴反应液，混匀，取一滴于滤纸上于滤纸上（第一斑点（第一斑点）作为对照；作为对照；2.2.将上液置于将上液置于3737水浴水浴10min 10min，再取一小滴滴于滤纸，再取一小滴滴于滤纸上上（第二斑点）（第二斑点）实验组实验组 ；4.晾干后，于长波紫外灯下（晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果并计时）观察结果并计时。实验流程实验流程G6PDG6PD荧光斑点试验荧光斑点试验 正常人：正常人：0min0min斑点无荧光，斑点无荧光，5-10min5-10min出现，出现，10min10min荧光最强荧光最强 临床诊断：临床诊断：轻度缺陷者：轻度缺陷者：0-10min0-10min荧光很弱或不出现荧光很弱或不出现 中度缺陷者：中度缺陷者：10-30min10-30min出现荧光出现荧光 严重缺陷者：严重缺陷者：30min30min内不出现荧光内不出现荧光结果分析结果分析G6PDG6PD荧光斑点试验荧光斑点试验 红细胞红细胞G6PDG6PD活性测定活性测定实验原理：实验原理：基本原理同基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是荧光斑点实验。不同的是利用利用紫外光分光光度法紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟定量测定酶活性，即每隔一分钟在在340nm波长测定孵育液中波长测定孵育液中NADPH吸光度（测吸光度（测6次），次），求求每分钟吸光度增加的平均值每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。生成由于所用试剂及体系的不同。方法：方法：WHOWHO推荐的推荐的ZinkhamZinkham;NBT;NBT定量法等定量法等实验原理实验原理 G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法)试管 对照管 测定管 NADP液（ml）0.1 0.1Tris液（ml）0.1 0.1氯化镁液（ml）0.1 0.1蒸馏水（ml）0.68 0.58G6P液（ml）0.1 37预热溶血液（l）20 20立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化实验流程实验流程红细胞红细胞G6PDG6PD活性测定活性测定计算公式：G-6-PD活性（U/gHb）=A/min1000/6.221020/20 Hb(gL-1)A/min:每min吸光度的平均变化值1000/6.22:为微摩尔消光系数1020/20:总容量与溶血液的量之比；实验流程实验流程红细胞红细胞G6PDG6PD活性测定活性测定G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以上即可作出诊断 方法方法 正常值范围正常值范围WHOWHO推荐的推荐的Zinkham (12.012.09)IU/gHb(37)Zinkham (12.012.09)IU/gHb(37)ICSH推荐的Glock与McLoan法 （8.341.59）IU/gHb(37)NBT定量法 （13.130.0）NBT单位Chapman和Dern法 （2.87.31）IU/gHb(25)结果分析结果分析红细胞红细胞G6PDG6PD活性测定活性测定从生化代谢解释患儿的从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果临床表现和实验室检查结果3GSH的主要作用：的主要作用：保护红细胞内的含硫氢基保护红细胞内的含硫氢基 （-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜）血红蛋白、酶蛋白和膜 蛋白的完整性，免遭氧化蛋白的完整性，免遭氧化 与谷胱甘肽过氧化酶共同使与谷胱甘肽过氧化酶共同使 H2O2还原成还原成H2O红细胞红细胞 膜破裂膜破裂溶血性贫血溶血性贫血 （面色苍白）（面色苍白）游离游离Hb肾肾 吸收阈值吸收阈值血红蛋白尿血红蛋白尿/含铁血黄素尿含铁血黄素尿G6PDNADPH+H+GSH红细胞的抗氧化能力红细胞的抗氧化能力血尿、酱油样尿液血尿、酱油样尿液皮肤及巩膜黄染皮肤及巩膜黄染 红细胞红细胞 1.981012/L （6.0-7.0）1012/L 血红蛋白血红蛋白 53g/L （170-200)g/L 血清总胆红素血清总胆红素 85.5mol/L （3.4-17.1）mol/L 结合胆红素结合胆红素 13.7mol/L 03.42mol/L 未结合胆红素未结合胆红素 71.8mol/L 013.68mol/L 尿蛋白（尿蛋白（+）潜血潜血(+)尿胆红素尿胆红素()尿胆素原尿胆素原(+)实验室检查项目实验室检查项目正常值正常值患儿检查值患儿检查值案例分析案例分析体温升高体温升高红细胞破裂红细胞破裂血红蛋白暴露血红蛋白暴露免疫系统攻击免疫系统攻击导致患儿体温升高导致患儿体温升高溶血性贫血溶血性贫血机体缺氧机体缺氧 具有载氧能力的具有载氧能力的Hb含量下降含量下降呼吸急促呼吸急促讨该病发生的分子基础，讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因可以用哪些技术检测什么目的基因？4检测检测G6PD基因基因 此外还可以用通过扩增葡此外还可以用通过扩增葡G6PD基因第基因第10，11，12，13外显子外显子639bpDNA片段结合寡核苷片段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术、酸探针斑点杂交技术、PCR/SSCP分析法、分析法、DNA序列分析、探针技术等方法检测上述基因序列分析、探针技术等方法检测上述基因的点突变。的点突变。体型瘦小与该病症的相关性体型瘦小与该病症的相关性溶血性贫血溶血性贫血体型瘦小体型瘦小缺乏营养缺乏营养营营养养物物质质运运输输不不足足相关相关参考文献参考文献1红细胞葡萄糖红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症磷酸脱氢酶缺乏症OL http:/ 倪福椿倪福椿 邹俊伦邹俊伦 童若春童若春.简易简易G6PD荧光斑点试验荧光斑点试验J.临床检验杂志临床检验杂志,1983(03)3查锡良等查锡良等.肝的生物化学肝的生物化学Z.生物化学，第七版：生物化学，第七版：4194324蚕豆病的基因检测方法蚕豆病的基因检测方法 OL http:/ you!