HPLC及其在中药分析中的应用.ppt

2024/5/22周三1高效液相色谱法及其在中药分析中的应用2024/5/22周三2慢慢中等中等快快色谱分离色谱分离色谱分离色谱分离Temporal course淋洗液淋洗液2024/5/22周三3按溶质在分离过程中的原理：按溶质在分离过程中的原理：吸附色谱吸附色谱分配色谱分配色谱离子交换色谱离子交换色谱体积排阻色谱体积排阻色谱亲和色谱亲和色谱液相色谱的分类液相色谱的分类2024/5/22周三4按色谱固定相的形式按色谱固定相的形式：平板色谱（平面色谱）平板色谱（平面色谱）柱色谱柱色谱按分离的压力按分离的压力高压液相色谱（高效液相色谱）高压液相色谱（高效液相色谱）中压液相色谱中压液相色谱常压液相色谱常压液相色谱液相色谱的分类液相色谱的分类Hdp关系图关系图2024/5/22周三52024/5/22周三6一般也把吸附色谱法称为液固色谱法。液固色一般也把吸附色谱法称为液固色谱法。液固色谱法的固定相一般为固体吸附剂，常用的是：谱法的固定相一般为固体吸附剂，常用的是：碳酸钙、硅胶、氧化铝、氧化镁、活性炭等。碳酸钙、硅胶、氧化铝、氧化镁、活性炭等。其中硅胶最为常用。其中硅胶最为常用。吸附色谱对中等分子量的油溶性样品可获得最吸附色谱对中等分子量的油溶性样品可获得最佳的分离，而对强极性或离子型的样品，有时佳的分离，而对强极性或离子型的样品，有时会发生不可逆吸附，不能得到满意的结果。会发生不可逆吸附，不能得到满意的结果。液固色谱法液固色谱法2024/5/22周三7吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表明存吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表明存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分子在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的活性中心上进行竞争，同时不在吸附剂表面的活性中心上进行竞争，同时不同溶质之间和同一溶质的不同官能团之间液也同溶质之间和同一溶质的不同官能团之间液也存在竞争。竞争的综合结果就是形成不同溶质存在竞争。竞争的综合结果就是形成不同溶质在吸附剂表面吸附、解吸平衡。在吸附剂表面吸附、解吸平衡。基本原理基本原理：2024/5/22周三8吸附解吸X表示溶质分子，下标m为流动相，s为固定相M表示流动相分子，下标m为流动相，s为固定相n为被溶质分子取代的流动相分子数目用一个式子表示如下：用一个式子表示如下：2024/5/22周三92024/5/22周三10键合相固定相：在硅胶的表明用键合反应键合相固定相：在硅胶的表明用键合反应把官能基团键合到表面上，解决固定相流把官能基团键合到表面上，解决固定相流失的问题。失的问题。正相色谱：流动相极性比固定相极性小正相色谱：流动相极性比固定相极性小反相色谱：流动相极性比固定相极性大反相色谱：流动相极性比固定相极性大键合相液相色谱键合相液相色谱2024/5/22周三112024/5/22周三12高效液相色谱固定相 化学键合相硅胶 octadecyl Si-CHoctadecyl Si-CH2 2 1717-CH-CH3 3 C C1818 octyl Si-CH octyl Si-CH2 2 7 7-CH-CH3 3 C C8 8 cyanopropyl Si-CH cyanopropyl Si-CH2 2 3 3-CN CN -CN CN aminopropyl Si-CH aminopropyl Si-CH2 2 3 3-NH-NH2 2 NHNH2 2 2024/5/22周三13固定相的其他性能 载体的形状 球形 无定形 粒径 310m,1.72.5m 孔径 150 分析分子量300 分析分子量2000的化合物 表面积 键合基团的表面覆盖度 含碳量2024/5/22周三14一般认为键合相色谱的机理分配色谱机理，一般认为键合相色谱的机理分配色谱机理，也有人认为它是吸附色谱机理，其实应该也有人认为它是吸附色谱机理，其实应该是有两种成分在里面，现在又有疏溶剂理是有两种成分在里面，现在又有疏溶剂理论等机理的提出。论等机理的提出。高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器2024/5/22周三152024/5/22周三161.储存和输送液体设备储存和输送液体设备2.进样系统进样系统3.柱系统柱系统4.检测器检测器5.控制和数据处理系统控制和数据处理系统2024/5/22周三17选择流动相的原则：选择流动相的原则：保持色谱柱的稳定性保持色谱柱的稳定性化学惰性化学惰性适合所用的检测器适合所用的检测器对样品有一定的溶解能力对样品有一定的溶解能力清洗、更换方便、毒性小清洗、更换方便、毒性小沸点、粘度等物理性质合适沸点、粘度等物理性质合适2024/5/22周三18反相色谱最常用的流动相：反相色谱最常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。水甲醇体系：大约水甲醇体系：大约5050水的时候粘度最大水的时候粘度最大水乙腈体系：水乙腈体系：3535水的时候粘度最大。水的时候粘度最大。2024/5/22周三19存放流动相的容器一定要惰性的，并且存放流动相的容器一定要惰性的，并且有机溶剂要避光。有机溶剂要避光。输液泵要求流量平稳输液泵要求流量平稳,可以调节的流量可以调节的流量范围宽，耐高压。范围宽，耐高压。一般是柱塞往复泵。一般是柱塞往复泵。2024/5/22周三202024/5/22周三212024/5/22周三22流动相的混合输入和洗脱方式o离线混合 配制 滤过 脱气 o在线混合 低压在线混合 高压在线混合p洗脱 等度洗脱 梯度洗脱2024/5/22周三23高效液相色谱仪器泵系统进样系统包括手动进样和自动进样进样系统包括手动进样和自动进样无论手动进样还是自动进样，都要通过无论手动进样还是自动进样，都要通过六通阀。六通阀进样是高压系统的需要，六通阀。六通阀进样是高压系统的需要，既不影响系统的正常运行又能够让样品既不影响系统的正常运行又能够让样品进到系统中去。进到系统中去。2024/5/22周三242024/5/22周三252024/5/22周三26高效液相色谱仪器进样器2024/5/22周三27反相键合相色谱柱最常用的就是反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，柱，也就是也就是C18柱。柱。柱温箱的温度控制要求比较精确，因为柱温箱的温度控制要求比较精确，因为流体的粘度受温度的影响较大。流体的粘度受温度的影响较大。柱系统包括色谱柱和柱温箱柱系统包括色谱柱和柱温箱2024/5/22周三28测量原理不同分类：测量原理不同分类：光学性质检测器光学性质检测器电学和电化学性质检测器电学和电化学性质检测器热学性质检测器热学性质检测器液相色谱检测器液相色谱检测器2024/5/22周三29紫外可见光检测器紫外可见光检测器示差折光检测器示差折光检测器荧光检测器荧光检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器化学发光检测器化学发光检测器光学性质检测器：光学性质检测器：2024/5/22周三30高效液相色谱仪器检测器紫外吸收检测器有三种类型：紫外吸收检测器有三种类型：固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254nm254nm或或280nm280nm紫外光。紫外光。可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光光二极管阵列检测器光二极管阵列检测器photophotodiodediodearray array detectordetector（PDADPDAD，PDA,DADPDA,DAD）：钨灯和氘灯组合）：钨灯和氘灯组合光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。波长上的光。PDA PDA 可以辅助定性。可以辅助定性。2024/5/22周三31DAD检测器3D图2024/5/22周三32示差折光检测器（示差折光检测器（refractiveindexdetectorRID）：）：溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积之和。之和。RIDRID是通用型的检测器，但是灵敏度不高。是通用型的检测器，但是灵敏度不高。RIDRID不能用于梯度洗脱。不能用于梯度洗脱。2024/5/22周三332024/5/22周三34蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器2024/5/22周三35安培检测器安培检测器电导检测器电导检测器库仑检测器库仑检测器介电常数检测器介电常数检测器极谱检测器极谱检测器电学和电化学检测器：电学和电化学检测器：2024/5/22周三36完成数据采集和对仪器的控制。完成数据采集和对仪器的控制。工作站工作站：2024/5/22周三37超高效液相色谱仪（超高效液相色谱仪（UPLC）超高效液相色谱超高效液相色谱是分离科学中的一个全新类别，它给实验室带来了新奇而强大的能力。UPLC借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。2024/5/22周三38高效液相色谱法在药典中的应用项目项目20002000版版20052005版版含量测定含量测定1091095275272024/5/22周三39HPLC与TLC比较(2005版)含量测定TLC-SCHPLC药材和提取物 15175中成药353522024/5/22周三40HPLCHPLC在中药质量分析和检测中的应用在中药质量分析和检测中的应用o有效成分、指标成分的检测；o杂质或有关物质检查；o添加物或有害残留物质的检测；o中药指纹谱分析2024/5/22周三41有效成分、指标成分的检测 人参皂苷的检测2024/5/22周三42Flavones,Flavanones,andFlavanoneGlycosidesPeakIdentification1.Naringin2.Neohesperidin3.Myricetin4.Quercetin5.Naringenin6.KaempferolColumn:AlltimaC18,3m,100 x4.6mmMobilePhase:A:50mMPotassiumPhosphate,pH2.5B:ACNGradient:(Time,%B)(0,20)(15,40)FlowRate:1.0mL/minDetector:UVat280nmGinkgolidesPeakIdentification1.GinkgolideJ2.GinkgolideC3.GinkgolideA4.GinkgolideBColumn:NucleosilC18,5m,250 x2.1mmPartNo.C-6000BMobilePhase:Water:Methanol:Tetrahydrofuran(70:20:10)FlowRate:0.2mL/minDetector:500ELSD2024/5/22周三43杂质或有关杂质或有关物质检查物质检查2024/5/22周三44添加物或有害残留物质的检测OrganophosphatePesticidesPeakIdentification1.MethylParathion2.Dichlorvos3.Ethoprophos4.AzinphosColumn:AlltimaHPEPSC18,5,150 x4.6mmMobilePhase:(40:60)methanol:waterFlowRate:1.0mL/minDetector:UVat214nm2024/5/22周三45添加物或有害残留物质的检测AflatoxinStandardsPeakIdentification1.AflatoxinG2(0.06g/mL)2.AflatoxinG1(0.20g/mL)3.AflatoxinB2(0.06g/mL)4.AflatoxinB1(0.20g/mL)Column:InertsilODS-3V,5,150 x4.6mmMobilePhase:(50:50)Methanol:WaterFlowRate:1.0mL/minDetector:UVat3652024/5/22周三462024/5/22周三47中药指纹谱分析2024/5/22周三482024/5/22周三492005版版HPLC方法应用方法应用o有效成分有效成分特征成分含量测定特征成分含量测定o多成分指标含量测定多成分指标含量测定o多种检测器应用多种检测器应用2024/5/22周三50有效成分有效成分特征成分含量测定特征成分含量测定2024/5/22周三51有效成分有效成分特征成分含量测定特征成分含量测定多成分指标多成分指标含量测定含量测定2024/5/22周三522024/5/22周三53ELSD检测方法应用银杏叶提取物中银杏酸的限量检查2024/5/22周三54含量含量样品样品以总酸计以总酸计ppm以银杏酸以银杏酸13：0计计ppm样品样品10.40.4样品样品20.20.2样品样品30.40.4样品样品43.83.8样品样品52728样品样品616671662样品样品7524522样品样品823392333样品样品9392390样品样品103163152024/5/22周三552024/5/22周三56高效液相色谱法附录修订内容高效液相色谱法附录修订内容(2005(2005版版)修订内容和特点：修订内容和特点：p明明确确了了HPLCHPLC方方法法的的几几种种分分离离机机制制，为为分分类类应应用提供了基础；用提供了基础；p明明确确了了数数据据处处理理系系统统（色色谱谱工工作作站站）作作为为色色谱信号记录谱信号记录;p以以较较大大篇篇幅幅增增加加了了色色谱谱柱柱、检检测测器器、流流动动相相的的内内容容，适适应应快快速速发发展展的的、日日趋趋成成熟熟的的HPLCHPLC技术的要求。技术的要求。高高效效液液相相色色谱谱法法是是用用高高压压输输液液泵泵将将具具有有不不同同极极性性的的单单一一溶溶剂剂或或不不同同比比例例的的混混合合溶溶剂剂、缓缓冲冲液液等等流流动动相相泵泵入入装装有有固固定定相相的的色色谱谱柱柱，经经进进样样阀阀注注入入供供试试品品，由由流流动动相相带带入入柱柱内内，在在柱柱内内各各成成分分被被分分离离后后，依依次次进进入入检检测测器器，色色谱谱信信号号由由记记录仪或积分仪记录。录仪或积分仪记录。高高效效液液相相色色谱谱法法系系采采用用高高压压输输液液泵泵将将规规定定的的流流动动相相泵泵入入装装有有填填充充剂剂的的色色谱谱柱柱进进行行分分离离测测定定的的色色谱谱方方法法。注注入入的的供供试试品品，由由流流动动相相带带入入柱柱内内，各各成成分分在在柱柱内内被被分分离离，并并依依次次进进入入检检测测器器，由由记记录录仪仪、积积分分仪仪或或数数据据处处理理系系统统记记录录色色谱谱信信号。号。高高效效液液相相色色谱谱法法的的主主要要分分离离机机制制有有吸吸附附、分分配配、离离子交换和排阻作用。子交换和排阻作用。20002000版版 20052005版版2024/5/22周三572024/5/22周三58对仪器的一般要求对仪器的一般要求(2000(2000版版)p所所用用的的仪仪器器为为高高效效液液相相色色谱谱仪仪。色色谱谱柱柱的的填填充充剂剂和和流流动动相相的的组组分分应应按按各各品品种种项项下下的的规规定定。常常用用的的色色谱谱柱柱填填充充剂剂有有硅硅胶胶和和化化学学键键合合硅硅胶胶，后后者者以以十十八八烷烷基基硅硅烷烷键键合合硅硅胶胶最最为为常常用用，辛辛基基硅硅烷烷键键合合硅硅胶胶次次之之，氰氰基基或或氨氨基基键键合合硅硅胶胶也也有有使使用用。离离子子交交换换填填充充剂剂，用用于于离离子子交交换换色色谱谱；凝凝胶胶或或玻玻璃璃微微球球等等填填充充剂剂，用用于于分分子子排排阻阻色色谱谱等等。除除另另有有规规定定外外，柱柱温温为为室室温温，检测器为紫外吸收检测器。检测器为紫外吸收检测器。o在在用用紫紫外外吸吸收收检检测测器器时时，所所用用流流动动相相应应符符合合紫紫外外分分光光度法光光度法(附录附录 A)A)项下对溶剂的要求。项下对溶剂的要求。2024/5/22周三59对仪器的一般要求对仪器的一般要求(2005(2005版版)1 1 所所用用的的仪仪器器为为高高效效液液相相色色谱谱仪仪。仪仪器器应应定定期期检检定定并符合有关规定。并符合有关规定。（1 1）色色谱谱柱柱 最最常常用用的的色色谱谱柱柱填填充充剂剂为为化化学学键键合合硅硅胶胶。反反相相色色谱谱系系统统使使用用非非极极性性填填充充剂剂，以以十十八八烷烷基基硅硅烷烷键键合合硅硅胶胶最最为为常常用用，辛辛基基硅硅烷烷键键合合硅硅胶胶和和其其他他类类型型的的硅硅烷烷键键合合硅硅胶胶（如如氰氰基基硅硅烷烷键键合合相相和和氨氨基基硅硅烷烷键键合合相相等等）也也有有使使用用。正正相相色色谱谱系系统统使使用用极极性性填填充充剂剂，常常用用的的填填充充剂剂有有硅硅胶胶等等。离离子子交交换换填填充充剂剂用用于于离离子子交交换换色色谱谱；凝凝胶胶或或高高分分子子多多孔孔微微球球等等填填充充剂剂用用于于分分子子排排阻阻色色谱谱等等；手手性性键键合合填填充充剂剂用用于于对对映映异构体的拆分分析。异构体的拆分分析。2024/5/22周三60对仪器的一般要求对仪器的一般要求(2005(2005版版)2 2 填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在待测物的保留行为和分离效果。孔径在150150以下的填料适合于分析分子量小于以下的填料适合于分析分子量小于20002000的化的化合物，分子量大于合物，分子量大于20002000的化合物则应选择孔的化合物则应选择孔径在径在300300以上的填料。以上的填料。2024/5/22周三61对仪器的一般要求对仪器的一般要求(2005(2005版版)3 3 以以硅硅胶胶为为载载体体的的一一般般键键合合固固定定相相填填充充剂剂适适用用pH2pH28 8的的流流动动相相。当当pHpH大大于于8 8时时，可可使使载载体体硅硅胶胶溶溶解解；当当pHpH小小于于2 2时时，与与硅硅胶胶相相连连的的化化学学键键合合相相易易水水解解脱脱落落。当当色色谱谱系系统统中中需需使使用用pHpH大大于于8 8的的流流动动相相时时，应应选选用用耐耐碱碱的的填填充充剂剂，如如采采用用高高纯纯硅硅胶胶为为载载体体并并具具有有高高表表面面覆覆盖盖度度的的键键合合硅硅胶胶、包包覆覆聚聚合合物物填填充充剂剂、有有机机-无无机机杂杂化化填填充充剂剂或或非非硅硅胶胶填填充充剂剂等等；当当需需使使用用pHpH小小于于2 2的的流流动动相相时时，应应选选用用耐耐酸酸的的填填充充剂剂，如如具具有有大大体体积积侧侧链链能能产产生生空空间间位位阻阻保保护护作作用用的的二二异异丙丙基基或或二二异异丁丁基基取取代代十十八八烷烷基基硅硅烷烷键键合合硅硅胶胶、有有机机-无机杂化填充剂等。无机杂化填充剂等。2024/5/22周三62对仪器的一般要求对仪器的一般要求(2005(2005版版)4 4 (2)(2)检检测测器器 最最常常用用的的检检测测器器为为紫紫外外吸吸收收检检测测器器，其其他他常常见见的的检检测测器器有有二二极极管管阵阵列列检检测测器器（DADDAD）、荧荧光光检检测测器器、示示差差折折光光检检测测器器、蒸蒸发发光光散散射射检检测测器器、电电化化学学检检测测器器和和质质谱谱检测器等。检测器等。紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测物的质量有关，还与化合物的结器，其响应值不仅与待测物的质量有关，还与化合物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检构有关；示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器属质测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器属质量型检测器，对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待量型检测器，对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱测在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱测定和色谱峰纯度的检查。定和色谱峰纯度的检查。2024/5/22周三63对仪器的一般要求对仪器的一般要求(2005(2005版版)5 5o紫紫外外、荧荧光光、电电化化学学和和示示差差折折光光检检测测器器的的响响应应值值与与待待测测物物的的质质量量在在一一定定范范围围内内呈呈线线性性关关系系，但但蒸蒸发发光光散散射射检检测测器器响响应应值值与与待待测测物物的的质质量量通通常常并并不不呈呈线线性性关关系系，必必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。要时需对响应值进行数学转换后进行计算。o不不同同的的检检测测器器，对对流流动动相相的的要要求求不不同同。如如采采用用紫紫外外检检测测器器，所所用用流流动动相相应应至至少少符符合合紫紫外外-可可见见分分光光光光度度法法（附附录录 A A）项项下下对对溶溶剂剂的的要要求求；采采用用低低波波长长检检测测时时，还还应应考考虑虑有有机机相相中中有有机机溶溶剂剂的的截截止止使使用用波波长长，并并选选用用色色谱谱级级有有机机溶溶剂剂。蒸蒸发发光光散散射射检检测测器器和和质质谱谱检检测测器器通通常常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。不允许使用含不挥发盐组分的流动相。2024/5/22周三64对仪器的一般要求对仪器的一般要求(2005(2005版版)5 5 （3 3）流动相）流动相 由于由于C C1818链在水相环境中不易链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常不应低于溶剂的比例通常不应低于5 5，否则，否则C C1818链的链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。系统不稳定。2024/5/22周三65梯度洗脱梯度洗脱按设定的时间程序改变流动相系统溶剂按设定的时间程序改变流动相系统溶剂组成的比例的洗脱方法组成的比例的洗脱方法.例例:“以乙腈为流动相以乙腈为流动相A，以水为流动相，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱，按下表进行梯度洗脱”(人参人参)2024/5/22周三662024/5/22周三67梯度洗脱梯度洗脱o以有机溶剂相作为流动相A，以水相（含酸、盐等）为流动相B；o使用混合流动相的，以含有机相比例较高的为流动相A，含水比例高的为流动相B。正正文文中中各各品品种种项项下下规规定定的的条条件件除除固固定定相相种种类类、流流动动相相组组分分、检检测测器器类类型型不不得得任任意意改改变变外外，其其余余如如色色谱谱柱柱内内径径、长长度度、固固定定相相牌牌号号、载载体体粒粒度度、流流动动相相流流速速、混混合合流流动动相相各各组组分分的的比比例例、柱柱温温、进进样样量量、检检测测器器的的灵灵敏敏度度等等，均均可可适适当当改改变变，以以适适应应具具体体品品种种并并达达到到系系统统适适用用性性试试验验的的要要求求。一一般般色色谱谱图图约约于于2020分钟内记录完毕。分钟内记录完毕。正正文文中中各各品品种种项项下下规规定定的的条条件件除除固固定定相相种种类类、流流动动相相组组成成、检检测测器器类类型型不不得得改改变变外外，其其余余如如色色谱谱柱柱内内径径、长长度度、固固定定相相牌牌号号、载载体体粒粒度度、流流动动相相流流速速、混混合合流流动动相相各各组组成成的的比比例例、柱柱温温、进进样样量量、检检测测器器的的灵灵敏敏度度等等，均均可可适适当当改改变变，以以适适应应具具体体的的色色谱谱系系统统并并达达到到系系统统适适用用性性试试验验的的要要求求。但但对对某某些些品品种种，必必须须用用特特定定适适用用牌牌号号的的填填充充剂剂方方能能满满足足分分离离要要求求者者，可可在在该品种项下注明。该品种项下注明。2024/5/22周三68按按各各品品种种项项下下要要求求对对仪仪器器进进行行适适用用性性试试验验，即即用用规规定定的的对对照照品品对对仪仪器器进进行行试试验验和和调调整整，应应达达到到规规定定的的要要求求；或或规规定定分分析析状状态态下下色色谱谱柱柱的的最最小小理理论论板板数数、分分离离度度、重复性和拖尾因子。重复性和拖尾因子。色色谱谱系系统统的的适适用用性性试试验验通通常常包包括括分分离离度度、理理论论板板数数、重重复复性性和和拖拖尾尾因因子子等等四四个个指指标标。其其中中，分分离离度度和和重重复复性性是是系系统统适适用用性性试试验验中中更更具具实实用意义的参数。用意义的参数。按按各各品品种种项项下下要要求求对对色色谱谱系系统统进进行行适适用用性性试试验验，即即用用规规定定的的对对照照品品对对色色谱谱系系统统进进行行试试验验，应应符符合合要要求求。如如达达不不到到要要求求，可可对对色色谱谱分分离离条条件作适当的调整件作适当的调整。系统适用性试验系统适用性试验2024/5/22周三69色谱柱的理论板数色谱柱的理论板数(n)(n)分分离离度度（R R）无无论论是是定定性性鉴鉴别别还还是是定定量量分分 析析均均要要求求待待测测峰峰与与其其他他峰峰或或内内标标峰峰之之间间有较好的分离度。有较好的分离度。重复性重复性拖尾因子拖尾因子 2024/5/22周三702024/5/22周三71测定法测定法（1 1）内内标标法法加加校校正正因因子子测测定定供供试试品品中中某某个杂质或主成分含量个杂质或主成分含量（2 2）外外标标法法测测定定供供试试品品中中某某个个杂杂质质或或主主成分含量成分含量（3 3）加校正因子的主成分自身对照法）加校正因子的主成分自身对照法（4 4）不加校正因子的主成分自身对照法）不加校正因子的主成分自身对照法（5 5）面积归一化法）面积归一化法 2024/5/22周三72常规分析中应注意的问题 1 色谱柱与流动相 以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH28的流动相。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。2024/5/22周三73常规分析中应注意的问题 2 紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测物的质量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测物的质量通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。3 不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至少符合紫外-可见分光光度法（附录 A）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。2024/5/22周三74 4 检验中各品种项下规定的条件除固固定定相相种种类类、流流动动相相组组成成、检检测测器器类类型型不不得得改改变变外外，其其余余如如色色谱谱柱柱内内径径、长长度度、固固定定相相牌牌号号、载载体体粒粒度度、流流动动相相流流速速、混混合合流流动动相相各各组组成成的的比比例例、柱柱温温、进进样样量量、检检测测器器的的灵灵敏敏度度等等，均均可可适适当当改改变变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定适用牌号的填充剂方能满足分离要求者，可在该品种项下注明。常规分析中应注意的问题