酶联免疫吸附双抗体夹心法.pptx

酶联免疫吸附双抗体夹心法一、一、实验目得目得 1 掌握酶联免疫吸附实验掌握酶联免疫吸附实验(ELISAELISA)得原理得原理2 熟悉酶联免疫吸附实验得操作方法熟悉酶联免疫吸附实验得操作方法二、实验原理二、实验原理vv基础知识基础知识基础知识基础知识 1971年瑞典学者Engvail与Perlmann,荷兰学者Van Weerman与Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质得固相免疫测定方法,即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中得前沿课题,它就是一种特殊得试剂分析方法,就是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)得基础上发展起来得一种新型得免疫测定技术。vv甲胎蛋白甲胎蛋白甲胎蛋白甲胎蛋白(fetoprotein fetoprotein fetoprotein fetoprotein,AFPAFPAFPAFP)一种含一种含4%4%碳水化合物得单链糖蛋白碳水化合物得单链糖蛋白,分子量分子量70KD70KD,半衰期半衰期 5 5天天,由由592 592 个氨基酸残基得单肽链组成。基因位于第个氨基酸残基得单肽链组成。基因位于第4 4对染对染色体色体4q1124q214q1124q21区域区域,由由 15 15 个外显子与个外显子与1414个内含子组成个内含子组成,属于血清中一种属于血清中一种球蛋白球蛋白,就是一种胚胎性相关蛋白。自就是一种胚胎性相关蛋白。自19631963年发现以来年发现以来,作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用于作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用于临床。它对原发性肝癌得早期诊断具有重要意义临床。它对原发性肝癌得早期诊断具有重要意义,同时对同时对肝细胞癌得鉴别诊断肝细胞癌得鉴别诊断,流行病学调查与理论研究都很有价流行病学调查与理论研究都很有价值。值。v原理原理原理原理一一一一 ELISAELISA得基础就是抗原得基础就是抗原(或抗体或抗体)得固相化及抗原得固相化及抗原(或抗体或抗体)得酶得酶标记。结合在固相载体表面得抗原标记。结合在固相载体表面得抗原(或抗体或抗体)仍保持其免疫学活仍保持其免疫学活性。性。v原理二原理二原理二原理二 抗原抗原(或抗体或抗体)可通过共价键与酶连接形成酶结合物可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶而此种酶结合物仍能保持其免疫学与酶学活性。结合物仍能保持其免疫学与酶学活性。v原理三原理三原理三原理三 固相上得酶量与标本中受检物质得量呈一定得比例。加入酶固相上得酶量与标本中受检物质得量呈一定得比例。加入酶反应得底物后反应得底物后,底物被酶催化成为有色产物底物被酶催化成为有色产物,产物得量与标本中产物得量与标本中受检物质得量直接相关受检物质得量直接相关,故可根据呈色得深浅进行定性或定量分故可根据呈色得深浅进行定性或定量分析。由于酶得催化效率很高析。由于酶得催化效率很高,间接地放大了免疫反应得结果间接地放大了免疫反应得结果,使使测定方法达到很高得敏感度。测定方法达到很高得敏感度。ELISAELISA得三条基本原理得三条基本原理双抗体夹心法双抗体夹心法v方法方法方法方法 用已知抗体包被用已知抗体包被,加入待测抗原加入待测抗原,再加酶标抗体再加酶标抗体,加底物显加底物显色。色。固相固相固相固相(包被包被包被包被)抗体抗体抗体抗体Ab+Ab+样样品品品品(抗原抗原抗原抗原Ag)+Ag)+酶标酶标抗体抗体抗体抗体Ab*Ab*Ab-Ag-Ab*+Ab-Ag-Ab*+底物底物底物底物(TMB)(TMB)显显色色色色v应用应用应用应用 这种方法欲测得抗原必须有两个可以与抗体结合得部位这种方法欲测得抗原必须有两个可以与抗体结合得部位这种方法欲测得抗原必须有两个可以与抗体结合得部位这种方法欲测得抗原必须有两个可以与抗体结合得部位,因为其一端要与包被于固相载体上得抗体作用因为其一端要与包被于固相载体上得抗体作用因为其一端要与包被于固相载体上得抗体作用因为其一端要与包被于固相载体上得抗体作用,而另一端而另一端而另一端而另一端则要与酶标记特异性抗体作用则要与酶标记特异性抗体作用则要与酶标记特异性抗体作用则要与酶标记特异性抗体作用。双抗体夹心法图示双抗体夹心法图示双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+-E EE EE EE EE EE EE EE EE E三、实验仪器三、实验仪器&试剂试剂v仪器 全自动酶标仪、全自动酶标洗板机v试剂试剂试剂试剂 待测血清、抗待测血清、抗待测血清、抗待测血清、抗-AFP-L3-AFP-L3 抗体、封闭蛋白溶液、辣根过抗体、封闭蛋白溶液、辣根过抗体、封闭蛋白溶液、辣根过抗体、封闭蛋白溶液、辣根过氧化物酶氧化物酶氧化物酶氧化物酶(HRP)(HRP)、底物四甲基联苯胺、底物四甲基联苯胺、底物四甲基联苯胺、底物四甲基联苯胺(TMB)(TMB)、显色液、终止、显色液、终止、显色液、终止、显色液、终止液液液液OR:OR:甲胎蛋白甲胎蛋白甲胎蛋白甲胎蛋白(AFP)(AFP)定量测定试剂盒定量测定试剂盒定量测定试剂盒定量测定试剂盒(酶联免疫法酶联免疫法酶联免疫法酶联免疫法)四、实验步骤四、实验步骤获得获得AFPAFP未标定抗体未标定抗体将将AFPAFP抗体与固相抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合得洗涤除去未结合得抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留得蛋白结合位点表面残留得蛋白结合位点洗涤并除去未结合得封闭蛋白洗涤并除去未结合得封闭蛋白加血清形成加血清形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物洗涤除去其她洗涤除去其她未结合得物质未结合得物质 加加HRPHRP酶标抗体生成酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体得复合物得复合物 彻底洗涤未结合彻底洗涤未结合 得得HRPHRP酶标抗体酶标抗体 加底物四甲基联苯胺加底物四甲基联苯胺(TMB(TMB)进行酶催化反应进行酶催化反应 根据颜色反应得程度根据颜色反应得程度进行进行AFPAFP得定量测定得定量测定12大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流详细步骤详细步骤1、标准品得稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10 孔,在第一、第二孔中分别加标准品100l,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100l 分别加到第三孔与第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l,混匀;然后在第三孔与第四孔中先各取50l 弃掉,再各取50l 分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50,混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l,混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。(稀释后各孔加样量都为50l,浓度分别为(1800ng/L,1200ng/L,600ng/L,300ng/L,150ng/L)。2、加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l,然后再加待测样品10l(样品最终稀释度为5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。3、温育:用封板膜封板后置37温育30 分钟。4、配液:将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用5、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此重复5 次,拍干。6、加酶:每孔加入酶标试剂50l,空白孔除外。7、温育:操作同3。8、洗涤:操作同5。9、显色:每孔先加入显色剂A50l,再加入显色剂B50l,轻轻震荡混匀,37避光显色15 分钟、10、终止:每孔加终止液50l,终止反应(此时蓝色立转黄色)。11、测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔得吸光度(OD 值)。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)常用底物常用底物:(1)(1)邻苯二胺邻苯二胺(OPD)(OPD):反应显橙黄色反应显橙黄色,应避光应避光,致癌性。致癌性。(2)(2)四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB):TMB:TMB就是一种脂溶性较强得基团就是一种脂溶性较强得基团,由于这种高度得脂溶性由于这种高度得脂溶性,使其易形成多聚体使其易形成多聚体,在在HRPHRP活性部活性部位产生粗大得、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。酶反应用位产生粗大得、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。酶反应用HCLHCL或或H2SO4H2SO4终止后终止后,TMBTMB产物由蓝色呈黄色产物由蓝色呈黄色,最适吸收波长最适吸收波长为为 450nm450nm。五、结果分析五、结果分析以标准物得浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品得OD 值由标准曲线查出相应得浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物得浓度与OD 值计算出标准曲线得直线回归方程式,将样品得OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品得实际浓度。六、思考题六、思考题试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？(一)固相载体(二)抗原(三)试验样品(四)结合物 (五)洗涤剂与稀释剂(六)底物(七)作用时间 (八)试验得重复性(精确度)(九)对使用仪器要求