考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程.doc

(完整word版)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．
6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围
考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。长期以来，人们一直习惯用 Lowry 法来测定蛋白质浓度， 但近些年来， 越来越多的人开始用考马斯亮蓝 G-250显色法来测定蛋白质浓度，与 Lowry 法相比，该方法具有下列优点：①方法简单，只需一种显色液。②反应迅速，只需一步反应，显色可在 5 min 之内完成。③干扰少，许多被认为对 Lorwy 法有干扰的物质（如糖、缓冲液、还原剂和络合剂）不影响该方法。尽管该方法有如此多的优点，但在实际应用中也有其缺点，如线性关系不很好，因此使用该方法测定蛋白质浓度时应特别注意。

动物实验中使用的肝素化生理盐水如何配置？
肝素的抗凝血作用很强，常用来作为全身抗凝剂，特别是在进行微循环方面动物实验时的肝素应用更有重要意义。
　　纯的肝素10 mg能抗凝100 ml血液（按1mg等于100个国际单位，10个国际单位能抗凝1ml血液计）。如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。用于试管内抗凝时，一般可配成1%肝素生理盐水溶液，取0.1ml加入试管内，加热80℃烘干，每管能使5～10 ml血液不凝固。
　　作全身抗凝时，一般剂量为：大鼠2.5～3 mg·(200～300g体重)-1,兔或猫10 mg·kg-1,狗5～10 mg·kg-1。如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。
这是在网上查到的，有没有前辈这样用过
我的实验是取大鼠外周血养细胞，
肝素的使用是：
腹腔注射浓度为50U/100g，10min后再麻醉。
抽血用的一次性针管和50ml离心管内都用20U/ml浓度肝素润管。取出的血放入离心管前，管内预留20U/ml的肝素（根据取得的血量算肝素的ml量）。

根据这段时间的操作，效果很好。

目前多采用肝素盐水作为静脉留置针的封管液,浓度为10U/mL～100U/mL[1]。既要达到预防堵管的目的,又要考虑病人不必出血。 临床上常用100或250ml生理盐水加肝素钠1支（12500u）配置。