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土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究

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2

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土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究

上海交通大学附属中学
高二（9）班
姜北辰 20120923
2011—2

目录
1、 绪论
2、 实验材料及方法
3、 结果与数据分析
4、 分析总结与讨论
5、 参考文献

摘要：
通过对土壤样本进行初筛和复筛，以限制氮源的方法分离出8株具有反硝化能力的微生物，对5株微生物的反硝化能力进行测定，其二周时间硝酸盐降解率最高为100%，最低为66.76％。对此8株菌株的DNA进行PCR扩增,引物为已知的nirS和nosZ反硝化基因的相应引物，发现有三株菌株含有nosZ基因。再对此8株菌株中的7株的16S rDNA进行PCR扩增,鉴定菌种。

关键词：反硝化微生物，菌种鉴定,反硝化菌筛选

1、 绪论:
反硝化作用（denitrification）也称脱氮作用。反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐,释放出分子态氮（N2)或一氧化二氮（N2O）的过程。大部分反硝化细菌是异养菌,例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示:
C6H12O6+12NO3-→6H2O+6CO2+12NO2-+能量
CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2+4N2+8OH—+能量
反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中氮素营养的含量，对农业生产不利。农业上常进行中耕松土，使土壤与氧气充分接触以防止反硝化作用.反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3—减少，消除因硝酸积累对生物的毒害作用。所以我们应尽量发挥其有利的一面，为人类所利用。
反硝化微生物对于硝酸根离子的还原步骤如右图，若要从微生物代谢角度验证菌株是否为反硝化菌最简单有效的方法便是测定nirS和nosZ基因是否存在.由于
N2O和NO都是温室气体,是否含有nosZ基因对于菌种的用途有着实际且重要的意义，即可以使土壤中微生物代谢产生的N2O和NO还原成氮气[1]。本实验的目的便是通过筛选土壤中的反硝化菌，测定反硝化能力，鉴定其是否含有nirS和nosZ基因，对此进行综合分析，找出反硝化能力较强的菌株，最终制备纯培养的反硝化菌菌株。实验完成后,此菌株将有十分广大的应用前景。例如，将对农田等生态系统中其他微生物产生的N2O和NO等温室气体还原,减少温室气体的排放,为维持环境的稳定起到积极作用.

2、 实验材料与方法
（1） LB液体培养基 （每1000ml)
10g蛋白胨
5g酵母提取物
10g NaCl
若加入15g琼脂粉则为LB固态培养基成分.
（2） TSA培养基：
胰蛋白胨0。75g/L
大豆胨 0。25g/L
NaCl 0。25g/L
（3） Giltay培养基
A溶液：KNO3 1。0g。天冬酰胺1.0g，1%BTB酒精溶液5mL，蒸馏水500mL
B溶液：柠檬酸钠8.5g， MgSO4·7H2O 1。0g,FeCl3·6H2O 0。05g，KH2PO41。0g,CaCl2·2H2O 0。2g，蒸馏水500mL
混合A、B溶液，加入1%mol/L的NaOH溶液调节pH为7。1，灭菌备用。
（4） 琼脂糖凝胶电泳
① 全基因组电泳：
TAE buffer 30ml
琼脂糖0.8％(0。24g)
② PCR产物电泳：
TAE buffer 50ml
琼脂糖1.2%（0。6g）
均加入荧光剂EB 1微升
（5） Bead—Beater法所用试剂
① bufferZ :10mM Tris—HCl, 150mM NaCl, pH 8.0 （1。21g Tris碱，8。755g NaCl, 加HCl调至pH 8.0, 配成1L溶液）
② 10％SDS(C12H25OSO3Na）100g溶于1L水 pH 5.3
③ 氯仿-异戊醇（24：1）
④ 苯酚(pH 8.0）
⑤ 无水乙醇
⑥ Eirconium beads
⑦ Screw tube
（6） PCR反应体系(25μl）
10×buffer 2。5μl
Taq酶 0.25μl
MgCl2 2μl
dNTP 2μl
primer1 0。5μl
primer2 0。5μl
水 16。25μl
模板 1μl
nosZ nirS
primer1 nosZ F R3cd
primer2 nosZ R cd3aF
（7） 修正PCR反应体系（50μL）
10×buffer 5μL
Taq酶 1μL
dNTP 7μL
primer1 1μL
primer2 1μL
模板 1～2μL
DMSO 1μL
ddH2O 33μL
（8） PCR反应引物序列及条件
目的基因
引物
引物序列(5’~3')
反应条件
nirS［2]
cd3aF
GTS AAC GTS AAG GAR ACS GG
94℃ for 2min,30×（94℃ for 30s,51℃ for 1min,72℃ for 1min),72℃for 10min
R3cd
GAS TTC GGR TGS GTC TTG A
NosZ［3］
nosZ F
CGY TGT TCM TCG ACA GCC AG
94℃ for 2min,3×（94℃ for 30s，65℃ for 1min，72℃ for 40s），4×（94℃ for 30s,60℃ for 1min，72℃ for 1min),18×(94℃ for 30s,55℃ for 1min,72℃ for 1min)，72℃ 10min
nosZ R
CAT GTG CAG NGC RTG GCA GAA
（9） 化学转化体系：
pMD18-T载体 0.5μL
DNA 4.5μL
Solution I 5μL
载体与Solution I为TaKaRa公司产品
（10） 仪器、试剂:
普通离心机、冷冻离心机、超净台、恒温培养箱、摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、紫外分光光度仪、PCR仪、凝胶电泳槽、水浴锅、冰浴、金属浴仪、紫外照胶仪、快检器，实验所用化学药品均为分析纯。
（11） 初筛：
先将土壤样本稀释100倍作为样本.提取样本，稀释为10-3、10—4、10-5、10—6、10-7、10-8六个梯度，各500微升.其中， 10—5、10—6、10—7三个浓度各涂两个平板，其余各涂一个平板。再加上10-2浓度在平板上进行划线，总计10个平板。平板上培养基为TSA培养基。然后将平板放入厌氧培养箱中18℃培养一个星期。
（12） 菌落集中培养：
另取一平板，在其背面贴上50格的方格纸，然后从10—6和 10—7的平板上挑取菌体分别接种在每个格子的左上（记为A）和右下方（记为B)。（其上菌落的编号方法：方格号+位置，例:10A、44B).共计100个菌落。将此平板与先前各平板一道放入厌氧培养箱继续培养一周。此平板记作“平板A"
（13） 复筛：
使用移液枪头挑取平板A上较明显且较有代表性的10个菌落接种进预先加好Giltay培养基与BTB的大试管内，记下编号，培养一周.
接种到大试管中的细菌编号：
17A、17B、19A、19B、23A、23B、38B、41A、42A、43A。
BTB变蓝的试管编号：
17A、17B、19A、19B、23A、38B、41A、43A.
将所有平板密封放入冰箱保存，将大试管放入振荡培养箱继续培养.一周后，提取大试管中的培养液,开始测量硝酸盐的降解程度。此时,菌已在大试管中培养三周（28℃）。使用仪器为紫外分光光度仪，波长为220nm与275nm。记录实验数据，将结果进行数学模型拟合,推算出硝酸盐降解程度。
（14） DNA提取与PCR扩增：
① 配制LB液体培养基100ml，取16个试管，将有反硝化能力的8株菌株接种到试管中,进行好氧培养，16小时后放4℃保存。
② 使用煮菌法从平板A上提取DNA,把已知的反硝化基因nirS和nosZ基因为目的基因，使用相应引物，进行PCR扩增，电泳后比对。通过研究比对看具有反硝化能力的菌是否含有这两种基因.
③ 取4℃保存的菌液使用Bead—beater法提取高纯度DNA。
④ 用此DNA作为扩增16S rDNA的模板，引物为16S rDNA全程引物（27F、1492）。同时使用此DNA对目的基因PCR作复核,重复三次实验.
（15） 琼脂糖凝胶电泳(8个菌株的DNA样品+阳性对照+阴性对照）
使用30ml规格0.8％的琼脂糖- TAE buffer溶液,取全基因组DNA样品3μl，无菌水2μl，缓冲液1μl在塑料膜上点样混匀后注入凝胶的孔内，电压80V。使用50ml规格的琼脂糖- TAE buffer溶液，取PCR扩增DNA样品3μl，无菌水2μl，缓冲液1μl在塑料膜上点样混匀后注入凝胶的孔内，电压120V。结束后放入暗箱内拍照，比对.
（16） 16S rDNA电泳产物的割胶回收
制备回收胶，紫外灯下割取明亮条带于1。5ml Ep管中。
使用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收16S rDNA。
（17） 使用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收16S rDNA
① 称胶重
② 加适量Binding buffer（XP2） 放入60℃水浴10min使胶融化。
③ 组装DNA column和2ml 收集管
④ 加入700μl样品，1000×g离心1min
⑤ 倒去液体加700μl Binding buffer（XP2） 重复一次1000×g离心1min
⑥ 最大转速空转2min,放65℃烘箱5min
⑦ 加DNA洗脱缓冲液50μl，1000×g离心1min
（18） 化学转化
① 取感受态大肠杆菌细胞（DH10B)，放冰上融化。
② 配制10μl体系（T载体0.5μl，solution I 5μl，样品4。5μl）
③ 加入转化体系后，冰上放置30min
④ 42℃热激90s 放冰上2-3min
⑤ 加入1ml LB，37℃ 1小时培养
⑥ 涂布在加Amp的固态LB上，培养16小时。
⑦ Amp固态LB成分：Amp 250μl， IPTG 80μl， Xgel 320μl
（19） 质粒快检
① 挑取平板上的白色菌落另取平板培养。
② 在1.5ml EP管中各加入40μl快检液I（50μl 10mmol/EDTA pH 8。0）
③ 用枪头刮取菌体于EP管中，充分震荡
④ 各加入20ml快检液II 65℃烘箱 15min
⑤ 加入10μl快检液III（酸酚）充分震荡，12000rpm 5min
⑥ 取上清5μl点样电泳

3、 结果与数据分析
（1） 初筛方法所得出结论：在反硝化微生物的厌氧培养涂布平板中,样本稀释倍数以10-6与10-7浓度最为合适，此时菌落数从10个到50个不等。一周后长出菌落直径1～2mm，两周后长出的菌落直径为3~4mm，菌落形态十分容易辨别。
（2） 复筛结果:共挑取有代表性的十株菌株接种至加Giltay培养基与BTB的大试管中,一星期后，十个试管中有八个变色，记录其编号.在平板A上观察变色的八个菌落形态，得出以下数据:
表一:菌落形态
编号
大小
形状
边缘
厚度
颜色
透明度
17A
大
不规则
光滑
较薄
黄
半透明
17B
小
圆形
光滑
较厚
黄
半透明
19A
大
不规则
光滑
较厚
黄
半透明
19B
大
不规则
光滑
较厚
黄
半透明
23A
大
不规则
粗糙
较薄
白
半透明
38B
大
不规则
光滑
较厚
黄
半透明
41A
小
不规则
粗糙
较薄
白
不透明
43A
大
不规则
粗糙
较厚
白
不透明
（3） 使用紫外分光光度仪进行硝酸盐降解程度的测定，紫外光波长为220nm和275nm，此时已培养两周时间.以菌落形态有代表性为标准，测定了8个菌株中的5个，得出以下数据：
表二：8个菌株中5株的吸光度实测值
吸光度实测值
A220
A275
A校正（A220-2A275）
原液
0.387
0。008
0.371
17A
0。353
0。091
0.171
17B
0.330
0.164
0.002
19A
0.419
0。122
0.175
19B
0.490
0。121
0.248
23A
0。352
0.146
0.060
对获得的吸光度数据进行处理，得到表三：
表三：5株菌株的降解率
编号
原浓度（mg/l)
降解率
原液
167.28
---——
17A
38。05
77。25％
17B
-0.48
100。28％
19A
38。96
76.71％
19B
55.60
66。76％
23A
12.75
92。38%
分析比较实验数据，发现17B，17A，23A三株菌株的反硝化能力最强。同时发现17B的实验数据存在负值，说明实验存在误差。
（4） 关于以16S rDNA基因PCR反应条件的改进：
在实验过程中，为了找到扩增菌株样品16S rDNA的最适条件，使用温差梯度PCR仪，设置51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃六个梯度为退火温度，电泳后得出以下结果:
marker 57℃ 55℃ 61℃ 59℃ 57℃ 55℃ 53℃ 51℃
发现当退火温度为55℃到57℃时PCR效果最好，因为此时条带较亮，说明DNA浓度较高，而61℃明显太高。最终确定16S rDNA的PCR反应条件为:
94℃ for 2min, 30×（94℃ for 30s, 55℃ for 1min， 72℃ for 1min）,72℃ for 10 min, 15℃ forever.
（5） 凝胶电泳结果
说明：为了简便标记，将原有菌株重新编号，17A、17B、19A、19B、23A、38B、41A相应更改为1、2、3、4、5、6、7号菌株
① nirS与nosZ基因鉴定结果
该实验重复四次，第一次PCR扩增失败，第二次出现较多非特异条带。分析实验过程中可能出现的问题,对PCR的反应体系作出修改，见“实验材料和方法（7)修正PCR体系”.第三次与第四次结果相同如图所示。
nosZ阳性 7 6 5 4 3 2 1 nirS阳性 7 6 5 4 3 2 1
图片中marker左边为以nosZ基因为目的基因的PCR产物的电泳情况，marker右边为以nirS基因为目的基因的PCR产物的电泳情况，与相应阳性对照比较得出结论：第1、3、4号菌株含有nosZ基因，但没有菌株含有nirS基因。
② 16S rDNA的电泳结果，如图：

marker 7 6 5 4 3 2 1
1.5kb→

③ 16S rDNA的PCR扩增完成后,进行割胶回收，为了为化学转化做准备，对割胶回收产物DNA进行电泳,观察其浓度是否足够.如图所示，5、6、7号菌株回收ＤＮＡ浓度较低，在化学转化时用上全部DNA回收产物。
marker 1 2 3 4 5 6 7 marker

④ 化学转化完成后,在培养16小时的Amp的LB平板上挑取白色菌落每个菌株各6个菌落，接种到新的Amp的LB平板上继续培养，12小时候挑取菌落做快检，同时把菌液加40%甘油放入菌种管中-40℃保存。快检结果显示仍有少量空质粒存在，丢弃相应菌种管。

此图显示，左起第5、7、9列为空质粒。因为空质粒为极个别现象，在此仅显示全部快检结果的一部分。
（6） 菌种鉴定结果
每株菌株送3管菌液至公司测序，公司为上海英俊生物技术有限公司.对7株菌株样品的16S rDNA测序结果与基因库相比对，得到表四：
表四:菌种鉴定结果
菌株编号
最相似菌种
相似度
1→17A
Aeromonas hydrophila
99％
2→17B
Aeromonas hydrophila
99％
3→19A
Aeromonas media
98％
4→19B
Aeromonas media
99％
5→23A
Serratia fonticola
99%
Acinetobacter sp。
99%
6→38B
Aeromonas media
99％
7→41A
Serratia fonticola
99％
其中,共分离得到三种细菌，嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、中间气单胞菌（Aeromonas media）、居泉沙雷氏菌（Serratia fonticola)。值得注意的是，5号菌株2个克隆鉴定为居泉沙雷氏菌，但另一个克隆鉴定为不动杆菌属的某种(Acinetobacter sp。),由于此属细菌在自然环境中分布极广，且粘附性强，疑似为菌种管被外源菌污染所致。

4、分析总结与讨论
本课题较成功地分离出8株反硝化菌株。分析比较实验数据，菌株17B，17A，23A的反硝化能力最强。电泳的结果显示,菌株17A、19A、23A含有nosZ基因。菌种鉴定的结果显示，分离得到了三种细菌，分别为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）（17A、17B)、中间气单胞菌(Aeromonas media）（19A、19B、38B）、居泉沙雷氏菌（Serratia fonticola）（23A、41A)。
气单胞菌属和沙雷氏菌属的细菌之前未被报道有反硝化能力,从此次实验的结果来看，极有可能改变人们对于反硝化现象的认识,反硝化作用不仅仅存在于如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等其它人们已熟知的细菌中，气单胞菌属和沙雷氏菌属也有拥有反硝化能力的菌株。另外，nosZ基因在三个菌株中的发现表明可以充分利用这几种菌株在把温室气体N2O还原成氮气，可以用在土壤中使土壤中其它微生物代谢产生的N2O充分还原,起到保护环境的作用，其对nirS基因的缺乏可以有效避免还原施在农田里的氮肥而降低肥效。当然，有关制备好的菌株的具体应用还有待进一步实验与探究。

5、参考文献
［1］Philipport—Finding the missing link between diversity and activity using denitrifying bacteria as a model functional community,2005
［2]Michotey V， Mejean V， Bonin P —mparison of methods for quantification of cytochrome cd1-denitrifying bacteria in environmental marine samples，2000
[3]K.Kloos et al ，2001

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