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第四章第四章 光谱分析技术及相关仪器光谱分析技术及相关仪器FF光谱分析（光谱分析（Spectral Analysis）：指所有对物指所有对物质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。作用引起的能谱改变的分析。FF光谱分析法：光谱分析法：基于物质发射的电磁辐射及电磁基于物质发射的电磁辐射及电磁辐射与物质的相互作用而建立起来的分析方法。辐射与物质的相互作用而建立起来的分析方法。第一节第一节 光谱分析技术基础理论与分类光谱分析技术基础理论与分类FF吸收光谱吸收光谱（absorption spectrumabsorption spectrum）物质对不同物质对不同波长光的吸收程度不同而产生的光谱。波长光的吸收程度不同而产生的光谱。FF发射光谱发射光谱 由物质分子或原子吸收了外来的能由物质分子或原子吸收了外来的能量后发生分子或原子间的能级跃迁而产生的光谱。量后发生分子或原子间的能级跃迁而产生的光谱。一、光谱分析技术的基础理论一、光谱分析技术的基础理论JJ光的波粒二象性：微粒性光的波粒二象性：微粒性 波动性波动性 E E 为光子的能量；为光子的能量；为光波的频率（为光波的频率（HzHz）；）；h h为普朗克常数（为普朗克常数（6.6266.626）；）；c c为光速（为光速（2.9977102.9977108 8m ms s）；）；为光波的波长为光波的波长 S2S1S0S3E2E0E1E3h l物质的吸收光谱:在连续光谱中某些波长的光被物质吸收后产生的光谱被称作吸收光谱,包括分子吸收光谱和原子吸收光谱。吸收光谱取决于物质的结构。JJ朗伯-比尔定律：I I0 0：入射光强度入射光强度 C:C:溶液浓度溶液浓度 b:b:液层厚度液层厚度 I:I:透射光强度透射光强度 T:T:透光度透光度 A:A:吸光度吸光度 k:k:吸光系数吸光系数bI0IJJ发射光谱发射光谱发射光谱发射光谱:物质所发射的光物质所发射的光被光谱仪器分解而成的光被光谱仪器分解而成的光谱。谱。JJ发射光谱分析方法就是根发射光谱分析方法就是根据每种元素特有的线光谱据每种元素特有的线光谱来识别或检查各种元素。来识别或检查各种元素。发发射射光光谱谱线状光谱线状光谱由原子或离子被激 发而发射 带状光谱带状光谱由分子被激发而发射 连续光谱连续光谱由炙热的固体或液 体所发射 二、光谱分析技术的分类二、光谱分析技术的分类 分子吸收法分子吸收法:可见与紫外分光光度法、红外光谱法可见与紫外分光光度法、红外光谱法 分子光谱分子光谱 分子发射法分子发射法:分子荧光光度法分子荧光光度法光谱技术光谱技术 原子吸收法：原子吸收法：原子吸收法原子吸收法 原子光谱原子光谱 原子发射法：原子发射法：发射光谱分析法、原子荧光法等发射光谱分析法、原子荧光法等 第二节第二节 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计:能从含有各种波长的混合光中将每能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器。一单色光分离出来并测量其强度的仪器。n n分析精密度高分析精密度高n n测量范围广测量范围广n n分析速度快分析速度快n n样品用量少样品用量少 射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光根据使用的波长范围不同分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。紫外紫外-可见分光光度计：工作波段在可见分光光度计：工作波段在200nm200nm800nm800nm的分光光度计。其中：的分光光度计。其中：200nm200nm400nm400nm为紫外光区。为紫外光区。400nm400nm800nm800nm为可见光区。为可见光区。属于分子吸收光谱仪。属于分子吸收光谱仪。721 721 可见分光光度计可见分光光度计722722系列系列系列系列 可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计 SP-756PSP-756P紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 TENSORTENSOR系列红外光谱仪系列红外光谱仪系列红外光谱仪系列红外光谱仪 光源光源光源光源单色器单色器单色器单色器吸收池吸收池吸收池吸收池检测器检测器检测器检测器显示系统显示系统显示系统显示系统一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结可见分光光度计的基本结构和工作原理构和工作原理紫外紫外-可见分光光度计的基本结构示意图可见分光光度计的基本结构示意图 光源（光源（光源（光源（light sourcelight source）：）：）：）：提供入射光的装置。提供入射光的装置。要求要求:1.1.能在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱；能在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱；2.2.有足够的辐射强度并能长时间稳定。有足够的辐射强度并能长时间稳定。常用的光源有热辐射灯（钨灯、卤钨灯等），气体常用的光源有热辐射灯（钨灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等。汞灯）等。几种常见光源比较几种常见光源比较几种常见光源比较几种常见光源比较光源波长范围(nm)特 点钨灯3202500钨丝易蒸发，寿命短。用于可见光区卤钨灯3202500加入卤素使用寿命延长，稳定性好氢灯185375用于紫外区氘灯185375发光强度比氢灯高35倍汞灯254734用于紫外或荧光分析仪单色器（单色器（单色器（单色器（MonochromatorMonochromator）：）：）：）：是将来自光源的复合光分解为是将来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的装置。单色光并分离出所需波段光束的装置。n n入射狭缝：限制杂散光进入；入射狭缝：限制杂散光进入；n n色散元件：将复合光分解为色散元件：将复合光分解为 单色光，有棱镜和光栅两种；单色光，有棱镜和光栅两种；n n准直镜：将来自色散元件的准直镜：将来自色散元件的 平行光束聚集在出射狭缝上；平行光束聚集在出射狭缝上；n n出射狭缝：将固定波长范围出射狭缝：将固定波长范围 的光射出单色器，可以限制的光射出单色器，可以限制 通带宽度。通带宽度。吸收池（吸收池（吸收池（吸收池（absorption cellabsorption cell）：）：）：）：是用来盛放被测溶液的是用来盛放被测溶液的器件。在可见光区常用无色光学玻璃或塑料制作；在紫器件。在可见光区常用无色光学玻璃或塑料制作；在紫外区需用能透紫外线的石英或熔凝石英制作。外区需用能透紫外线的石英或熔凝石英制作。n n同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射应严格同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射应严格保持一致。指纹、油污及池壁上的沉淀物都会影响吸收保持一致。指纹、油污及池壁上的沉淀物都会影响吸收池的透光性能。池的透光性能。JJ通过改进吸收池的几何形状，可提高通过改进吸收池的几何形状，可提高“光程光程/体积体积比比”，即尽可能延长单位体积的光程。常用的有：，即尽可能延长单位体积的光程。常用的有：n n 微型吸收池（微型吸收池（微型吸收池（微型吸收池（Microdrill absorption cellMicrodrill absorption cell）：“光程光程/体积体积比比”提高了近提高了近1010倍。倍。n n 多光路吸收池（多光路吸收池（多光路吸收池（多光路吸收池（Multipie-path absorption cellMultipie-path absorption cell）：）：）：）：在吸收在吸收池壁上装有反射镜，使光线在溶液中经多次反射后才离开池壁上装有反射镜，使光线在溶液中经多次反射后才离开吸收池，大大增加了有效光程，提高了测定的灵敏度。吸收池，大大增加了有效光程，提高了测定的灵敏度。检测器：检测器：检测器：检测器：把光信号转换为电信号的装置。把光信号转换为电信号的装置。n n对检测器的要求：对检测器的要求：1.1.产生的电信号与照射到它上面的光强有恒定的函数关系；产生的电信号与照射到它上面的光强有恒定的函数关系；2.2.波长响应范围大；波长响应范围大；3.3.灵敏度高；灵敏度高；4.4.响应速度快，一般要求小于响应速度快，一般要求小于10-810-8s s；5.5.产生的电信号易于检测、放大，噪声低。产生的电信号易于检测、放大，噪声低。检测器工作原理检测器工作原理检测器工作原理检测器工作原理 n n光照射在某些金属表面，会有光电子从金属表面逸出，光照射在某些金属表面，会有光电子从金属表面逸出，这种光电效应称为外光电效应。利用外光电效应可以制这种光电效应称为外光电效应。利用外光电效应可以制成光电管和光电倍增管。成光电管和光电倍增管。n n光深入到物体内部，将物体内部原子中的一部分束缚电光深入到物体内部，将物体内部原子中的一部分束缚电子激发成自由电子，但这些电子并不逸出物体，而是留子激发成自由电子，但这些电子并不逸出物体，而是留在物体内部从而使物体导电性增强，称为内光电效应。在物体内部从而使物体导电性增强，称为内光电效应。利用内光电效应可制成光敏电阻、光敏二极管以及光电利用内光电效应可制成光敏电阻、光敏二极管以及光电池。池。几种常用检测器比较几种常用检测器比较几种常用检测器比较几种常用检测器比较检测器 工 作 原 理 特 点光电管外光电效应简单,灵敏度低光电倍增管外光电效应与多级二次发射体相结合灵敏度比光电管高200多倍光电二极管阵列外光电效应，由一行光敏区和二行读出寄存器构成可同时检测多个波长的光强度。寿命长、光谱响应范围宽、可靠性高、读出速度快光电池内光电效应结实、便宜、使用方便。但产生的电流大小不稳定电荷耦合器件模拟集成电路芯片能同时多谱线检测，极大地提高分析速度信号显示系统信号显示系统信号显示系统信号显示系统:是把放大的信号以适当的是把放大的信号以适当的方式显示或记录下来的装方式显示或记录下来的装置。置。信信号号显显示示装装置置直读直读检流计检流计电位调节电位调节指零装置指零装置自动记录自动记录和数字显和数字显示装置示装置二、影响分光光度法准确性的因素二、影响分光光度法准确性的因素FF 单色性不纯的影响单色性不纯的影响FF 杂散光的影响杂散光的影响FF 吸收池的影响吸收池的影响FF 电压、检测器负高压波动的影响电压、检测器负高压波动的影响FF 其它因素的影响其它因素的影响（一）单色性不纯的影响（一）单色性不纯的影响（一）单色性不纯的影响（一）单色性不纯的影响n n光的吸收定律只是在入射光为单色光的条件下成立，而光的吸收定律只是在入射光为单色光的条件下成立，而通常所指的单色光是指有一定谱带宽度的光谱。由于单通常所指的单色光是指有一定谱带宽度的光谱。由于单色器的类型和质量不同，得到的单色光纯度不同，加上色器的类型和质量不同，得到的单色光纯度不同，加上使用中狭缝宽度调节不当，都可造成入射光的单色性不使用中狭缝宽度调节不当，都可造成入射光的单色性不纯。从而使仪器读数不准，造成测量误差。纯。从而使仪器读数不准，造成测量误差。（二）杂散光的影响：（二）杂散光的影响：n n有两种两种原因引起的杂散光：有两种两种原因引起的杂散光：1.1.仪器中光学、机械零件的反射和散射等原因使所采用的仪器中光学、机械零件的反射和散射等原因使所采用的测定波长的光偏离正常光路，在不通过样品的情况下直接测定波长的光偏离正常光路，在不通过样品的情况下直接照射到单色器。这种杂散光波长与测定波长相同；照射到单色器。这种杂散光波长与测定波长相同；2.2.由仪器的光学系统设计制作缺陷引起。如不必要的反射由仪器的光学系统设计制作缺陷引起。如不必要的反射面、光束孔径不匹配、光学元件表面的擦痕、光学系统的面、光束孔径不匹配、光学元件表面的擦痕、光学系统的像差、不均匀色散以及由于机械零部件加工不良、位置错像差、不均匀色散以及由于机械零部件加工不良、位置错移、仪器内壁防眩黑漆脱落等。移、仪器内壁防眩黑漆脱落等。（三）吸收池的影响（三）吸收池的影响（三）吸收池的影响（三）吸收池的影响n n由于吸收池的质量不好或使用保管不善，吸收池不配由于吸收池的质量不好或使用保管不善，吸收池不配套，透光面被污染上油污、指纹、沉淀，吸收池与光套，透光面被污染上油污、指纹、沉淀，吸收池与光路不垂直等原因都可影响捡测结果的准确性。路不垂直等原因都可影响捡测结果的准确性。（四）电压、检测器负高压波动的影响（四）电压、检测器负高压波动的影响（四）电压、检测器负高压波动的影响（四）电压、检测器负高压波动的影响n n如果仪器电源电压波动过大，超过了仪器的稳压范围或如果仪器电源电压波动过大，超过了仪器的稳压范围或稳压器质量不好，都可引起光源电压、检测器负高压波稳压器质量不好，都可引起光源电压、检测器负高压波动，造成光源光强波动和检测器噪声增大，使捡测结果动，造成光源光强波动和检测器噪声增大，使捡测结果准确度降低。准确度降低。（五）其它因素的影响（五）其它因素的影响（五）其它因素的影响（五）其它因素的影响n n吸光度读数刻度误差、仪器安装环境（如振动、温度吸光度读数刻度误差、仪器安装环境（如振动、温度变化）、化学因素（如荧光、溶剂效应等）等也可影变化）、化学因素（如荧光、溶剂效应等）等也可影响捡测结果的准确度。响捡测结果的准确度。三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型JJ按其光学系统分可分为按其光学系统分可分为 单波长分光光度计单波长分光光度计 单光束单波长分光光度计单光束单波长分光光度计 双光束单波长分光光度计双光束单波长分光光度计 双波长分光光度计双波长分光光度计 单波长单光束分光光度计特点单波长单光束分光光度计特点单波长单光束分光光度计特点单波长单光束分光光度计特点 单光束光路，从光源到试样至接收器只有一个光通道；单光束光路，从光源到试样至接收器只有一个光通道；仪器只有一个色散元件，工作波长范围较窄；仪器只有一个色散元件，工作波长范围较窄；通常采用直接接收放大显示的简单电子系统，用电表或通常采用直接接收放大显示的简单电子系统，用电表或数字显示；数字显示；结构简单、附件少、功能范围小，不能做特殊试样如浑结构简单、附件少、功能范围小，不能做特殊试样如浑浊样品、不透明样品等的测定。浊样品、不透明样品等的测定。检测准确性不够稳定，不能用于精密分析。检测准确性不够稳定，不能用于精密分析。检测准确性不够稳定，不能用于精密分析。检测准确性不够稳定，不能用于精密分析。单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计光源光源光源光源单色器单色器单色器单色器吸收池吸收池吸收池吸收池检测器检测器检测器检测器显示显示显示显示系统系统系统系统721721型分光光度计光路图型分光光度计光路图型分光光度计光路图型分光光度计光路图751751型分光光度计光路图型分光光度计光路图型分光光度计光路图型分光光度计光路图单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计n n在出射狭缝和样品吸收池之间增加了一个光束分裂器或在出射狭缝和样品吸收池之间增加了一个光束分裂器或斩波器，用一定的频率将一个光束交替分成两路，使一斩波器，用一定的频率将一个光束交替分成两路，使一路经过参比溶液，另一路经过样品溶液，然后由一个检路经过参比溶液，另一路经过样品溶液，然后由一个检测器交替接收或由两个匹配器分别接收两路信号。测器交替接收或由两个匹配器分别接收两路信号。单波长双光束分光光度计特点单波长双光束分光光度计特点单波长双光束分光光度计特点单波长双光束分光光度计特点1.1.从光源到检测器有试样光路和参考光路两条通路；从光源到检测器有试样光路和参考光路两条通路；2.2.采用两个光栅或棱镜加光栅的双单色器，能有效地提高分辨采用两个光栅或棱镜加光栅的双单色器，能有效地提高分辨率和降低杂散光；率和降低杂散光；3.3.可以自动进行波长扫描、自动记录光谱曲线，也可以外接计可以自动进行波长扫描、自动记录光谱曲线，也可以外接计算机，实现自动化运行；算机，实现自动化运行；4.4.可装备各种附件，功能范围宽。可装备各种附件，功能范围宽。比值比值光源光源光源光源单色器单色器单色器单色器吸收池吸收池吸收池吸收池检测器检测器检测器检测器显示显示显示显示系统系统系统系统光束分裂器光束分裂器光束分裂器光束分裂器单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计双波长分光光度计工作原理双波长分光光度计工作原理双波长分光光度计工作原理双波长分光光度计工作原理n n将从同一光源发出的光分为两束，分别经两个单色器将从同一光源发出的光分为两束，分别经两个单色器分光后得到两束不同波长（分光后得到两束不同波长（1 1，2 2）的单色光，经斩）的单色光，经斩光器使两束光以一定频率交替照射同一样品，测定两光器使两束光以一定频率交替照射同一样品，测定两个波长下的吸光度差值（个波长下的吸光度差值（A=AA=A11-A-A22），将），将AA用于用于计算结果。计算结果。双波长分光光度计波长选择原则双波长分光光度计波长选择原则双波长分光光度计波长选择原则双波长分光光度计波长选择原则1.1.被测物在一个波长上有最大吸收峰，在另一个波长上没有被测物在一个波长上有最大吸收峰，在另一个波长上没有吸收或很少吸收；吸收或很少吸收；2.2.非被测物在两个波长上的吸收相同。非被测物在两个波长上的吸收相同。双波长分光光度计优点双波长分光光度计优点双波长分光光度计优点双波长分光光度计优点n n只要只要 1 1、2 2选择适当，选择适当，AA就是消除了非特征性吸收干就是消除了非特征性吸收干扰的吸光度值。将扰的吸光度值。将AA用于计算结果能较好的解决由于用于计算结果能较好的解决由于非特征吸收信号（如试样的浑浊、吸收池与空气界面非特征吸收信号（如试样的浑浊、吸收池与空气界面以及吸收池与溶液界面的折射差别等）影响而带来的以及吸收池与溶液界面的折射差别等）影响而带来的误差，结果更准确。误差，结果更准确。双波长分光光度计双波长分光光度计双波长分光光度计双波长分光光度计 四、紫外四、紫外-可见分光光度计性能可见分光光度计性能评价指标评价指标FF(一一)波长准确度和波长重复性波长准确度和波长重复性 FF(二二)光度准确度光度准确度 FF(三三)光度线性范围光度线性范围 FF(四四)分辨率分辨率 FF(五五)光谱带宽光谱带宽FF(六六)杂散光杂散光 FF(七七)基线稳定度基线稳定度FF(八八)基线平直度基线平直度(一一一一)波长准确度和波长重复性波长准确度和波长重复性波长准确度和波长重复性波长准确度和波长重复性n n波长准确度是指仪器波长指示器上所示波长值与仪器此时波长准确度是指仪器波长指示器上所示波长值与仪器此时实际输出的波长值之间的符合程度。实际输出的波长值之间的符合程度。n n波长重复性是指在对同一个吸收带或发射线进行多次测量波长重复性是指在对同一个吸收带或发射线进行多次测量时，峰值波长测量结果的一致程度。时，峰值波长测量结果的一致程度。n n波长误差来源于色散元件传动机构的运动误差、波长度盘波长误差来源于色散元件传动机构的运动误差、波长度盘的刻划误差、狭缝中心位置偏移和装校误差等。而波长重的刻划误差、狭缝中心位置偏移和装校误差等。而波长重复性则取决于上述各种机构中间隙的稳定性。复性则取决于上述各种机构中间隙的稳定性。(二二二二)光度准确度光度准确度光度准确度光度准确度n n光度准确度是指仪器在吸收峰上读出的透射率或吸光光度准确度是指仪器在吸收峰上读出的透射率或吸光度与已知真实透射率或吸光度之间的偏差。该偏差越度与已知真实透射率或吸光度之间的偏差。该偏差越小，光度准确度越高。小，光度准确度越高。n n光度准确度测试方法主要有标准溶液法和滤光片法。光度准确度测试方法主要有标准溶液法和滤光片法。标准溶液多采用酸性重铬酸钾溶液。标准溶液多采用酸性重铬酸钾溶液。(三三三三)光度线性范围光度线性范围光度线性范围光度线性范围n n指仪器光度测量系统对于照射到接收器上的辐射功率与指仪器光度测量系统对于照射到接收器上的辐射功率与系统的测定值之间符合线性关系的功率范围，即仪器的系统的测定值之间符合线性关系的功率范围，即仪器的最佳工作范围。最佳工作范围。n n检测方法检测方法溶液稀释法：配制适当浓度的溶液，按照溶液稀释法：配制适当浓度的溶液，按照一定的倍数逐步稀释，分别测定其吸光度，根据测得的一定的倍数逐步稀释，分别测定其吸光度，根据测得的吸光度计算吸光系数，以吸光度为横坐标，相应的吸光吸光度计算吸光系数，以吸光度为横坐标，相应的吸光系数为纵坐标，绘制吸光系数系数为纵坐标，绘制吸光系数-吸光度曲线，曲线的平吸光度曲线，曲线的平坦区域即为仪器的线性范围。坦区域即为仪器的线性范围。(四四四四)分辨率分辨率分辨率分辨率n n指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间隔，此指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间隔，此间隔越小分辨率越高。它是分光光度计质量的综合反间隔越小分辨率越高。它是分光光度计质量的综合反映。映。n n单色器输出的单色光的光谱纯度、强度以及检测器的单色器输出的单色光的光谱纯度、强度以及检测器的光谱灵敏度等是影响仪器分辨率的主要因素。光谱灵敏度等是影响仪器分辨率的主要因素。(五五五五)光谱带宽光谱带宽光谱带宽光谱带宽n n光谱带宽（光谱带宽（Spectral band widthSpectral band width）是指从单色器射出的单色）是指从单色器射出的单色光最大强度的光最大强度的1/21/2处的谱带宽度。它与狭缝宽度、分光元处的谱带宽度。它与狭缝宽度、分光元件、准直镜的焦距有关，可以认为是单色器的线色散率的件、准直镜的焦距有关，可以认为是单色器的线色散率的倒数与狭缝宽度的乘积。倒数与狭缝宽度的乘积。n n测量方法：测量钠双线（测量方法：测量钠双线（589.0nm589.0nm、589.6nm589.6nm）的宽度。由）的宽度。由于元素灯谱线本身的宽度大大小于单色器的宽度，故测得于元素灯谱线本身的宽度大大小于单色器的宽度，故测得的光谱带宽可以认为就是单色器的光谱带宽。的光谱带宽可以认为就是单色器的光谱带宽。(六六六六)杂散光杂散光杂散光杂散光n n除所需波长单色光以外其余所有的光都是杂散光，是测量除所需波长单色光以外其余所有的光都是杂散光，是测量过程中的主要误差来源，会严重影响检测准确度。过程中的主要误差来源，会严重影响检测准确度。n n可用截止滤光器测定杂散光：截止滤光器对边缘波长或某可用截止滤光器测定杂散光：截止滤光器对边缘波长或某一波长的光可全部吸收，而对其它波长的光却有很高的透一波长的光可全部吸收，而对其它波长的光却有很高的透光率，因此测定某种截止滤光器在边缘波长或某一波长的光率，因此测定某种截止滤光器在边缘波长或某一波长的透光率，即表示杂散光的强度。透光率，即表示杂散光的强度。(七七七七)基线稳定度基线稳定度基线稳定度基线稳定度n n是指在不放置样品的情况下，扫描是指在不放置样品的情况下，扫描100%T100%T或或0%T0%T时读数偏时读数偏离的程度，是仪器噪声水平的综合反映。一般取最大的离的程度，是仪器噪声水平的综合反映。一般取最大的峰缝之间的值作为绝对噪声水平。如果基线稳定度差，峰缝之间的值作为绝对噪声水平。如果基线稳定度差，光度准确度就低。光度准确度就低。(八八八八)基线平直度基线平直度基线平直度基线平直度n n是指在不放置样品的情况下，扫描是指在不放置样品的情况下，扫描100%T100%T或或0%T0%T时基线倾时基线倾斜或弯曲的程度。斜或弯曲的程度。n n在高吸收时，在高吸收时，0%0%线的平直度对读数的影响大；在低吸收线的平直度对读数的影响大；在低吸收时，时，100%100%线的平直度对读数的影响大。线的平直度对读数的影响大。n n基线平直度不好，可使样品吸收光谱中各吸收峰间的比值基线平直度不好，可使样品吸收光谱中各吸收峰间的比值发生变化，给定性分析造成困难。发生变化，给定性分析造成困难。五、紫外五、紫外-可见分光光度计常见可见分光光度计常见故障及排除方法故障及排除方法 n n分光光度计常见故障包括光路、电路故障。根分光光度计常见故障包括光路、电路故障。根据故障不同应采取不同的排除措施。接通电源据故障不同应采取不同的排除措施。接通电源后，指示灯不亮，仪器不工作，可能是电路故后，指示灯不亮，仪器不工作，可能是电路故障；读数表不能调零（即障；读数表不能调零（即0 0T T）和不能置）和不能置100100T T则可能是光路故障或微电流放大器损坏。需根则可能是光路故障或微电流放大器损坏。需根据具体情况采取不同的处理方法。据具体情况采取不同的处理方法。第三节第三节 荧光光谱仪荧光光谱仪某些物质吸收光能量后，可发射波长与激发光波长某些物质吸收光能量后，可发射波长与激发光波长相同或不同的光，当激发光源停止照射试样，再发相同或不同的光，当激发光源停止照射试样，再发射过程立即停止，这种再发射的光称为荧光射过程立即停止，这种再发射的光称为荧光（fluorescencefluorescence）。包括分子荧光和原子荧光。）。包括分子荧光和原子荧光。n n荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与定量分析的方法。的定性与定量分析的方法。n n荧光光谱仪：采用荧光分析法来测量的仪器。荧光光谱仪：采用荧光分析法来测量的仪器。荧光产生机制荧光产生机制n n物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基态最低能级的物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基态最低能级的分子被激发到第一电子激发态和其它电子激发态的各个振分子被激发到第一电子激发态和其它电子激发态的各个振动能级。到达激发态的各个振动能级的分子，和周围的分动能级。到达激发态的各个振动能级的分子，和周围的分子（如溶剂分子）碰撞，并把部分能量以热能的形式传给子（如溶剂分子）碰撞，并把部分能量以热能的形式传给周围的分子，自己降落到单线第二电子激发态的最低振动周围的分子，自己降落到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后，由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃能级。然后，由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，同时以发光的形式释放出其能量。这种光即为荧光。迁，同时以发光的形式释放出其能量。这种光即为荧光。荧光分析的特点荧光分析的特点荧光分析的特点荧光分析的特点JJ优点：灵敏度高（可达优点：灵敏度高（可达10 g10 g数量级）；选择性强，有利数量级）；选择性强，有利于分析复杂的多组分混合物；用样量少、特异性好、操于分析复杂的多组分混合物；用样量少、特异性好、操作简便。作简便。LL缺点：对温度、缺点：对温度、pHpH值等因素变化比较敏感；应用范围较值等因素变化比较敏感；应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，或与某些试剂作用后窄，只能用来测量发荧光的物质，或与某些试剂作用后发荧光的物质。发荧光的物质。-12（一）激发光谱和荧光光谱（一）激发光谱和荧光光谱（一）激发光谱和荧光光谱（一）激发光谱和荧光光谱n n任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即激发光谱任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrumexcitation spectrum）和荧光光谱）和荧光光谱(fluorescence(fluorescence spectrum)spectrum)。它们是荧光分析中定性和定量的基础。它们是荧光分析中定性和定量的基础。一、荧光分析的基本原理一、荧光分析的基本原理 激发光谱激发光谱激发光谱激发光谱：将激发光的光源用单色器分光，连续改变将激发光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长的激发激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长的激发光照射下，物质溶液发射的荧光强度的变化。以激发光光照射下，物质溶液发射的荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质的激发即可得到荧光物质的激发 光谱。从激发光谱图上可找光谱。从激发光谱图上可找 到发生荧光强度最强的激发到发生荧光强度最强的激发 波长波长exex。荧光光谱：荧光光谱：荧光光谱：荧光光谱：用用exex作激发光源，并固定强度，让物质发射作激发光源，并固定强度，让物质发射的荧光通过单色器分光，测定不同波长的荧光强度。以荧的荧光通过单色器分光，测定不同波长的荧光强度。以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得荧光光谱。光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得荧光光谱。荧光光谱中荧光强度最强的波长为荧光光谱中荧光强度最强的波长为 em em。n n荧光物质的荧光物质的exex和和emem 是鉴定物质的根据，也是鉴定物质的根据，也 是定量测定中所选用的是定量测定中所选用的 最灵敏的波长。最灵敏的波长。（二）物质的分子结构和荧光的关系（二）物质的分子结构和荧光的关系（二）物质的分子结构和荧光的关系（二）物质的分子结构和荧光的关系n n强荧光物质在分子结构上具有如下特征：强荧光物质在分子结构上具有如下特征：具有大的共轭具有大的共轭-双键结构，共轭体系越大，越容易产生双键结构，共轭体系越大，越容易产生荧光。荧光。具有刚性平面结构。荧光量子产率高的荧光物质，其分具有刚性平面结构。荧光量子产率高的荧光物质，其分子多为平面构型，并具有一定的刚性。子多为平面构型，并具有一定的刚性。具有最低的单线电子激发态具有最低的单线电子激发态S S1 1为为-型。型。若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加。若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加。荧光光谱仪的工作原理荧光光谱仪的工作原理荧光光谱仪的工作原理荧光光谱仪的工作原理n n荧光物质所发出的荧光强度在激发光的频率、强度以荧光物质所发出的荧光强度在激发光的频率、强度以及液层厚度不变时与溶液的浓度成正比。由此可以通及液层厚度不变时与溶液的浓度成正比。由此可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。过测定荧光强度来求出该物质的含量。n n荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强弱，荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强弱，而不是物质对光谱的吸收强弱，属于发射光谱分析，而不是物质对光谱的吸收强弱，属于发射光谱分析，荧光光度计和荧光分光光度计属于发射光谱仪器。荧光光度计和荧光分光光度计属于发射光谱仪器。荧光光谱仪分类荧光光谱仪分类荧光光谱仪分类荧光光谱仪分类n n荧光光度计（荧光光度计（fluorophotometerfluorophotometer）n n荧光分光光度计（荧光分光光度计（fluorospectrophotometerfluorospectrophotometer）n n 二者的区别在于荧光光度计采用滤光片做单色器，结构二者的区别在于荧光光度计采用滤光片做单色器，结构较简单，功能也较差，而荧光分光光度计采用棱镜或光栅较简单，功能也较差，而荧光分光光度计采用棱镜或光栅为色散元件，结构较复杂，功能较强，但价格远远高于荧为色散元件，结构较复杂，功能较强，但价格远远高于荧光光度计。光光度计。二、荧光光谱仪分类及结构荧光光谱仪分类及结构FluoscenceFluoscence荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计FP-6500荧光分光光度计JascoJasco荧光光谱仪荧光光谱仪荧光光谱仪荧光光谱仪ARL 9800 ARL 9800 系列系列系列系列 X X射线荧光光谱仪射线荧光光谱仪射线荧光光谱仪射线荧光光谱仪 荧光光谱仪的主要结构荧光光谱仪的主要结构荧光光谱仪的主要结构荧光光谱仪的主要结构n n激光光源：激发样品中荧光分子产生荧光。常用汞弧灯、激光光源：激发样品中荧光分子产生荧光。常用汞弧灯、氢弧灯及氘灯等。氢弧灯及氘灯等。n n单色器：分离出所需要的单色光。仪器有两个单色器，一单色器：分离出所需要的单色光。仪器有两个单色器，一是激发单色器，用于选择激发光波长；二是发射单色器，是激发单色器，用于选择激发光波长；二是发射单色器，用于选择发射到检测器上的荧光波长。用于选择发射到检测器上的荧光波长。n n样品池：放置测试样品，用石英做成。样品池：放置测试样品，用石英做成。n n检测器：接受光信号并将其转变为电信号。检测器：接受光信号并将其转变为电信号。n n记录显示系统：检测器出来的电信号经过放大器放大后，记录显示系统：检测器出来的电信号经过放大器放大后，由记录仪记录下来，并可数字显示和打印。由记录仪记录下来，并可数字显示和打印。光源光源光源光源激发激发单色器单色器单色器单色器吸收池吸收池吸收池吸收池检测放大系统检测放大系统检测放大系统检测放大系统荧光光度计结构示意图发射发射单色器单色器单色器单色器荧光分光光度计光路图荧光分光光度计光路图荧光光谱仪的使用与维护荧光光谱仪的使用与维护荧光光谱仪的使用与维护荧光光谱仪的使用与维护n n严格按照仪器规定的操作步骤进行操作。一旦仪器出了故障，严格按照仪器规定的操作步骤进行操作。一旦仪器出了故障，特别是光学部件的故障，必须请专门人员进行检修。特别是光学部件的故障，必须请专门人员进行检修。n n在使用过程中应注意以下问题：在使用过程中应注意以下问题：1.1.电源：电压，电流，电源的稳定须符合仪器的规定。电源：电压，电流，电源的稳定须符合仪器的规定。2.2.光源：启动后需预热光源：启动后需预热20min20min，灯及其窗口须保持清洁。，灯及其窗口须保持清洁。3.3.单色器：应注意防潮、防尘、防污和防机械损伤。单色器：应注意防潮、防尘、防污和防机械损伤。4.4.光电倍增管：加高压时切不可受外来光线直接照射。光电倍增管：加高压时切不可受外来光线直接照射。5.5.样品池：使用时应同一个方向插放，不能经常磨擦。样品池：使用时应同一个方向插放，不能经常磨擦。6.6.防止眼睛损伤：操作者不能直视光源，以免紫外线损伤眼睛。防止眼睛损伤：操作者不能直视光源，以免紫外线损伤眼睛。三、荧光光谱仪的应用三、荧光光谱仪的应用常规分析（如定性和定量分析、化学表征、色谱流出物的检常规分析（如定性和定量分析、化学表征、色谱流出物的检测等）；测等）；获得分子信息（如测量分子内间距、决定键合平衡、研究结获得分子信息（如测量分子内间距、决定键合平衡、研究结构变化等）；构变化等）；医药研究（如研究膜结构和功能、确定抗体的形态、研究生医药研究（如研究膜结构和功能、确定抗体的形态、研究生物分子的异质性、评价药物的相互作用、确定酶的活性和反物分子的异质性、评价药物的相互作用、确定酶的活性和反应、荧光免疫分析、监测体内化学过程等）；应、荧光免疫分析、监测体内化学过程等）；环境监测（如水和空气中污染物的鉴别和计量等）。环境监测（如水和空气中污染物的鉴别和计量等）。第四节第四节 原子光谱分析仪原子光谱分析仪FF优点优点:分析速度快、操作简便、分析速度快、操作简便、选择性好、灵敏度高、测定范选择性好、灵敏度高、测定范围广、试剂用量少等，可同时围广、试剂用量少等，可同时测定多种元素，不必进行复杂测定多种元素，不必进行复杂的分离处理。的分离处理。LL缺点缺点:测定多个不同元素时需更测定多个不同元素时需更换元素灯，有些元素的测定灵换元素灯，有些元素的测定灵敏度还有待提高。敏度还有待提高。原子光谱原子光谱分析仪器分析仪器原子吸原子吸收光收光谱仪谱仪原子发原子发射光射光谱仪谱仪原子荧原子荧光光光光谱仪谱仪一、原子吸收法和原子吸收光谱仪一、原子吸收法和原子吸收光谱仪 FF原子吸收光谱法原子吸收光谱法(Atomic Absorption Spectroscopy(Atomic Absorption Spectroscopy，AAS)AAS)基本原理：基本原理：基本原理：基本原理：从空心阴极灯或光源中发射出一束特定波长从空心阴极灯或光源中发射出一束特定波长的入射光，在原子化器中待测元素的基态原