生物课件-动物细胞工程.ppt

1.为什么要培养动物细胞？为什么要培养动物细胞？2.要培养动物细胞，对取材有何要求？要培养动物细胞，对取材有何要求？实验材料，药性、毒性检测，提取细胞分泌物等实验材料，药性、毒性检测，提取细胞分泌物等选择胚胎细胞或幼年动物组织，因为其分裂增殖能选择胚胎细胞或幼年动物组织，因为其分裂增殖能力强。力强。3.3.培养基是用液体的还是固体的？培养基中的成分培养基是用液体的还是固体的？培养基中的成分有何特点？有何特点？培养基是液体的，成份与动物内环境相似。培养基是液体的，成份与动物内环境相似。动物血清动物血清4.4.动物细胞培养条件有何特点？动物细胞培养条件有何特点？体温和体温和PHPH都应与动物体内环境相似。都应与动物体内环境相似。动物细胞培养动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成组织，将它分散成单个细胞单个细胞，然后放在适，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。5.5.培养动物细胞需要哪些培养动物细胞需要哪些条件条件？液体、营养物质（液体、营养物质（血清血清）、）、PHPH、温度、气体、无菌等、温度、气体、无菌等动物组织块动物组织块动物组织块动物组织块细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞悬液原代培养原代培养原代培养原代培养传代培养传代培养传代培养传代培养胰蛋白酶处理分散成单个细胞胰蛋白酶处理分散成单个细胞胰蛋白酶处理分散成单个细胞胰蛋白酶处理分散成单个细胞幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎细胞贴壁细胞贴壁细胞贴壁细胞贴壁接触抑制接触抑制接触抑制接触抑制原代培养原代培养原代培养原代培养传代培养传代培养传代培养传代培养加入培养液加入培养液加入培养液加入培养液用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等处理贴壁细胞处理贴壁细胞处理贴壁细胞处理贴壁细胞适宜条件适宜条件适宜条件适宜条件不死性细胞不死性细胞不死性细胞不死性细胞电激处理使供电激处理使供电激处理使供电激处理使供体核进入受体体核进入受体体核进入受体体核进入受体卵母细胞构建卵母细胞构建卵母细胞构建卵母细胞构建重组胚胎重组胚胎重组胚胎重组胚胎卵母细胞采集、培养卵母细胞采集、培养卵母细胞采集、培养卵母细胞采集、培养MM期期期期卵母细胞卵母细胞卵母细胞卵母细胞供体牛供体牛供体牛供体牛供体细胞注入供体细胞注入供体细胞注入供体细胞注入去核卵母细胞去核卵母细胞去核卵母细胞去核卵母细胞代孕母牛代孕母牛代孕母牛代孕母牛克隆牛克隆牛克隆牛克隆牛体细胞培养体细胞培养体细胞培养体细胞培养去核卵母细胞去核卵母细胞去核卵母细胞去核卵母细胞去核去核去核去核胚胎胚胎胚胎胚胎移植移植移植移植体细胞核移植过程体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）（体细胞克隆动物）体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题（1 1）成功率非常低）成功率非常低（2 2）克隆动物以表现早衰、生理缺）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题陷等健康问题 1970 1970年，有两位科学家年，有两位科学家做了一个著名的实验：做了一个著名的实验：人人鼠细胞融合的实验，鼠细胞融合的实验，以证明细胞膜上的蛋白以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。质分子是运动的。人人鼠细胞是怎样实现鼠细胞是怎样实现融合的？动物细胞融合有什融合的？动物细胞融合有什么实践意义呢？么实践意义呢？三、三、动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体1.1.细胞融合：细胞融合：是指两个或两个以上的细胞融合为一个细胞的是指两个或两个以上的细胞融合为一个细胞的过程。过程。自然发生：自然发生：受精卵受精卵人工诱导：人工诱导：利用诱导剂诱导动物细胞融合利用诱导剂诱导动物细胞融合 诱导因素：聚乙二醇、诱导因素：聚乙二醇、灭活的病毒灭活的病毒或电激等。或电激等。仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线灭活灭活丧失感染活性（不感染细胞）丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）保留融合活性（诱导细胞融合）什么是什么是病毒的灭活？病毒的灭活？灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。力，但是并不破坏病毒的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理灭活病毒诱导细胞融合的原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。细胞发生融合。因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 正在融合的正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞淋巴细胞与骨髓瘤细胞 正在融合的鸡正在融合的鸡血细胞血细胞动物细胞融合的原理：动物细胞融合的原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性 把两个不同的动物把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞，它们的病毒处理细胞，它们先发生质融合，再出现先发生质融合，再出现核融合，进而形成杂交核融合，进而形成杂交细胞。细胞。融合后的杂交细胞融合后的杂交细胞经过有丝分裂后仍能形经过有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交细胞成两个完整的杂交细胞2.动物细胞融合技术的应用：动物细胞融合技术的应用：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；为制造为制造单克隆抗体单克隆抗体开辟了新途径开辟了新途径 使用相应的抗体检测乙肝病毒使用相应的抗体检测乙肝病毒抗原抗原3.单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式图乙肝病毒模式图乙肝病毒模式图乙肝病毒模式图 凡能够引起机体产生特异性凡能够引起机体产生特异性免疫应答的物质叫做抗原免疫应答的物质叫做抗原。什么是抗原？什么是抗原？例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。抗原决定簇：抗原决定簇：抗原表面具有的某抗原表面具有的某些些特定的化学基团特定的化学基团，能决定抗原特异性能决定抗原特异性，是免疫细胞识别抗是免疫细胞识别抗原的重要依据。原的重要依据。各种抗原的决定簇各种抗原的决定簇数目不同，同一抗数目不同，同一抗原的决定簇可能有原的决定簇可能有多种。多种。什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里?起何作用？起何作用？当机体受到抗原刺激剂后由效应当机体受到抗原刺激剂后由效应B B细胞（浆细细胞（浆细胞）产生的，并且能与该抗原发生胞）产生的，并且能与该抗原发生特异性结合特异性结合的具的具有免疫功能的球蛋白有免疫功能的球蛋白抗体。抗体。抗体分布于血清中，也分布于组织液及外分泌抗体分布于血清中，也分布于组织液及外分泌液中。液中。抗体与相应抗原特异性结合抗体与相应抗原特异性结合 抗体由何种细胞产生？主要分布在哪里抗体由何种细胞产生？主要分布在哪里?血清抗体（也称多克隆抗体）血清抗体（也称多克隆抗体）由由血清血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多克隆多克隆抗体。抗体。特点：特点：产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。抗原不纯抗原不纯抗体不纯抗体不纯 抗原抗原 动物体内动物体内刺激刺激效应效应B B 抗体抗体 每一个每一个B B淋巴细胞只分泌一种淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，化学性质单一，特异性强的抗体特异性强的抗体。如果利用单个如果利用单个B B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆）淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学化学性质单一性质单一、特异性强特异性强的抗体的抗体单克隆抗体单克隆抗体。问题：问题：怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？在体外培养的条件下，一个在体外培养的条件下，一个B B淋巴细胞淋巴细胞能无限增殖形成细胞群吗？能无限增殖形成细胞群吗？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？肿瘤细胞！肿瘤细胞！科勒科勒米尔斯坦米尔斯坦荣获荣获19841984年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖 如果把一种如果把一种B B淋巴细胞与能在体外大量增殖的淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞融合细胞既能大量既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。增殖，又能产生足够数量的特定抗体。如何诱导融合？如何诱导融合？加入聚乙二醇加入聚乙二醇（PEG）如何得到如何得到B B淋巴细胞？淋巴细胞？3.3.制备制备单克隆抗体的单克隆抗体的过程过程细胞两两融合后，有哪细胞两两融合后，有哪些类型？些类型？B-B B-B B-B-瘤瘤(杂交瘤细胞杂交瘤细胞)瘤瘤-瘤瘤 如何筛选出杂交瘤细胞？如何筛选出杂交瘤细胞？单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。相同的。首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞细胞合成细胞合成DNADNA有有D D和和S S两条途径，其中两条途径，其中D D途径能被氨途径能被氨基嘌呤阻断。基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种人淋巴细胞中有这两种DNADNA的合成途径，但一般的合成途径，但一般不分裂增殖。不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有鼠骨髓瘤细胞中只有D D途径，没有途径，没有S S途径，可是能途径，可是能不断分裂增殖。不断分裂增殖。你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？小资料：小资料：在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！加入氨基嘌呤后，使加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，仅有合成途径阻断，仅有 D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的细胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成途径合成DNA而增殖。而增殖。通常通常采用有限稀释克隆细胞的方法采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个，每孔细胞不超过一个，再由这些单细胞克隆生长，再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。最终选出最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。再筛选出再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞阳性孔阳性孔方法方法方法方法抗原抗原抗原抗原-抗体杂交法抗体杂交法抗体杂交法抗体杂交法 在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。方法是不相同的。如何得到大量的单克隆抗体？如何得到大量的单克隆抗体？体内培养体内培养体外培养体外培养单克隆抗体单克隆抗体 化学性质单一、特异性强化学性质单一、特异性强 抗体抗体 抗原抗原 应答应答 抗体的不纯性抗体的不纯性 动物细胞受到抗原刺激动物细胞受到抗原刺激,引起免疫反应产生的球蛋白引起免疫反应产生的球蛋白.不是自己的而又能引起免疫应答反应的物质就是抗原不是自己的而又能引起免疫应答反应的物质就是抗原.一种抗原有多种不同的决定簇一种抗原有多种不同的决定簇,刺激的是多种刺激的是多种B B细胞细胞,作用于作用于不同的不同的B B细胞后细胞后,会产生多种抗体会产生多种抗体,这是多克隆的这是多克隆的,故不纯故不纯!1.1.1.1.制备单克隆抗体的思路制备单克隆抗体的思路制备单克隆抗体的思路制备单克隆抗体的思路 抗原抗原 B B细胞细胞浆细胞浆细胞 抗体抗体 刺激刺激 怎么才能得到纯的抗体怎么才能得到纯的抗体?光纯还不行光纯还不行,还要大量还要大量.怎么办怎么办?但，有但，有问题问题:找，什么细胞能无限繁殖呢找，什么细胞能无限繁殖呢?思路就出来了思路就出来了:要想获单一的纯抗体要想获单一的纯抗体,就必须从一个就必须从一个B B细胞出发细胞出发.让让B B细胞大量繁殖细胞大量繁殖(克隆克隆)就可以产生大量抗体了就可以产生大量抗体了.B B细胞是不能无限繁殖的细胞是不能无限繁殖的.怎么办怎么办?癌癌!只有癌细胞只有癌细胞.但它不能产生抗体但它不能产生抗体.癌细胞能无限繁殖癌细胞能无限繁殖,但不能产生抗体但不能产生抗体.B.B细胞能产生抗体细胞能产生抗体,但不能大但不能大量繁殖量繁殖.融合呀融合呀!只要将两个细胞融合即可互补只要将两个细胞融合即可互补.2.2.2.2.技术思路的重点技术思路的重点技术思路的重点技术思路的重点杂交瘤细胞杂交瘤细胞 HAT筛选筛选McAbMcAb大量培养大量培养PEGPEG诱导细胞融合诱导细胞融合免免免免 疫疫疫疫B 脾脾矿物油矿物油矿物油矿物油骨髓瘤骨髓瘤瘤瘤 问题问题:在培养体系中在培养体系中,有有4 4种细胞种细胞.B.B细胞、瘤细胞细胞、瘤细胞,和杂交细胞。和杂交细胞。我们还是拿不到我们还是拿不到McAb,McAb,怎么办怎么办?筛选！筛出杂交瘤细胞。怎么筛筛选！筛出杂交瘤细胞。怎么筛?又是一个思路问题。又是一个思路问题。关关键键一一步步单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体筛选筛选筛选筛选杂交细胞杂交细胞杂交细胞杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞体外或体内体外或体内体外或体内体外或体内细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养筛选筛选筛选筛选骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤细胞细胞细胞细胞诱导细胞融合诱导细胞融合诱导细胞融合诱导细胞融合特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系提取提取提取提取经过免疫的经过免疫的经过免疫的经过免疫的B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞动物动物动物动物细胞细胞细胞细胞融合融合融合融合技术技术技术技术动物动物动物动物细胞细胞细胞细胞培养培养培养培养技术技术技术技术单单克克隆隆抗抗体体的的制制备备过过程程：特点：既能产生专一特点：既能产生专一特点：既能产生专一特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏度高可大量制备度高可大量制备度高可大量制备度高可大量制备注射抗原注射抗原注射抗原注射抗原免疫免疫免疫免疫4 4、单抗隆抗体的应用、单抗隆抗体的应用作为诊断试剂作为诊断试剂定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病 用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、纯度高、纯度高、纯度高、特异性强特异性强特异性强特异性强，具有，具有，具有，具有准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速的优点。的优点。的优点。的优点。用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物 利用同位素标记单抗，在特定组织成像利用同位素标记单抗，在特定组织成像利用同位素标记单抗，在特定组织成像利用同位素标记单抗，在特定组织成像 制成制成制成制成生物导弹生物导弹生物导弹生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置，将药物定向带到癌细胞所在的位置，将药物定向带到癌细胞所在的位置，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。单克隆抗体的优点：单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物 特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 生物导弹生物导弹单克隆抗体抗癌药物单克隆抗体抗癌药物 疗效高、毒副作用小疗效高、毒副作用小 结合同位素的单抗结合同位素的单抗-生物导弹生物导弹结合同位素的单抗结合同位素的单抗-生物导弹生物导弹单抗单抗放射放射性同性同位素位素动物细胞工程小结动物细胞工程小结动物细胞培养：动物细胞培养：原理、营养、条件、过程、细胞原理、营养、条件、过程、细胞生长特点、结果、应用生长特点、结果、应用动物细胞融合：动物细胞融合：原理、诱导方法、过程、应用原理、诱导方法、过程、应用单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备：原理、过程、特点、应用原理、过程、特点、应用核移植与克隆动物：核移植与克隆动物：供体、受体、核移植方法、供体、受体、核移植方法、克隆动物的方法、克隆动物的遗传特性、应用克隆动物的方法、克隆动物的遗传特性、应用 动、植物细胞工程的比较：动、植物细胞工程的比较：植物组培技术与动物植物组培技术与动物细胞培养技术、植物体细胞杂交技术与动物细胞细胞培养技术、植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术融合技术图中图中B为为_过程，过程，常用常用_作为诱导剂作为诱导剂，该细胞继承，该细胞继承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_ 。B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC 1.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案产破伤风杆菌的抗体实验方案该实验方案的该实验方案的目是目是 ；AA是从小鼠的脾脏中取是从小鼠的脾脏中取得得_,_,该细胞能够该细胞能够产生产生 ；制备单克隆抗体制备单克隆抗体B B细胞细胞专一抗体专一抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌专一抗体分泌专一抗体无限增殖无限增殖单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备1 1 1 1、怎样获得能分泌专一抗体的、怎样获得能分泌专一抗体的、怎样获得能分泌专一抗体的、怎样获得能分泌专一抗体的B B B B淋巴细胞？淋巴细胞？淋巴细胞？淋巴细胞？2 2 2 2、从何处获得较多的、从何处获得较多的、从何处获得较多的、从何处获得较多的B B B B淋巴细胞？淋巴细胞？淋巴细胞？淋巴细胞？3 3 3 3、用什么方法可以使、用什么方法可以使、用什么方法可以使、用什么方法可以使B B B B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？4 4 4 4、怎样筛选出杂交瘤细胞？、怎样筛选出杂交瘤细胞？、怎样筛选出杂交瘤细胞？、怎样筛选出杂交瘤细胞？5 5 5 5、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？6 6 6 6、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？7 7 7 7、怎样获得大量的单一抗体？、怎样获得大量的单一抗体？、怎样获得大量的单一抗体？、怎样获得大量的单一抗体？反复注射特定的抗原，免疫小鼠。反复注射特定的抗原，免疫小鼠。反复注射特定的抗原，免疫小鼠。反复注射特定的抗原，免疫小鼠。小鼠的脾脏小鼠的脾脏小鼠的脾脏小鼠的脾脏PEGPEG、灭活的病毒等、灭活的病毒等、灭活的病毒等、灭活的病毒等利用利用利用利用HATHAT选择培养基培养，筛选选择培养基培养，筛选选择培养基培养，筛选选择培养基培养，筛选否否否否用多孔细胞培养板培养，稀释度要用多孔细胞培养板培养，稀释度要用多孔细胞培养板培养，稀释度要用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。保证每个孔内不多于一个细胞。保证每个孔内不多于一个细胞。保证每个孔内不多于一个细胞。抗原抗体杂交法检测抗原抗体杂交法检测抗原抗体杂交法检测抗原抗体杂交法检测呈阳性反应呈阳性反应呈阳性反应呈阳性反应体内或体外大量培养特异的杂交体内或体外大量培养特异的杂交体内或体外大量培养特异的杂交体内或体外大量培养特异的杂交瘤细胞，从中提取单一抗体。瘤细胞，从中提取单一抗体。瘤细胞，从中提取单一抗体。瘤细胞，从中提取单一抗体。单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体筛选筛选筛选筛选杂交细胞杂交细胞杂交细胞杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞体外或体内体外或体内体外或体内体外或体内细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养筛选筛选筛选筛选骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤细胞细胞细胞细胞诱导细胞融合诱导细胞融合诱导细胞融合诱导细胞融合特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系提取提取提取提取经过免疫的经过免疫的经过免疫的经过免疫的B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞动物动物动物动物细胞细胞细胞细胞融合融合融合融合技术技术技术技术动物动物动物动物细胞细胞细胞细胞培养培养培养培养技术技术技术技术单单克克隆隆抗抗体体的的制制备备过过程程：特点：既能产生专一特点：既能产生专一特点：既能产生专一特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏度高可大量制备度高可大量制备度高可大量制备度高可大量制备注射抗原注射抗原注射抗原注射抗原免疫免疫免疫免疫1975197519751975年年年年KohlerKohlerKohlerKohler和和和和MilsteinMilsteinMilsteinMilstein的单克隆抗体技术在生产和使用的单克隆抗体技术在生产和使用的单克隆抗体技术在生产和使用的单克隆抗体技术在生产和使用抗体方面开创了新纪元，图抗体方面开创了新纪元，图抗体方面开创了新纪元，图抗体方面开创了新纪元，图10101010示单克隆抗体制备流程阶段示单克隆抗体制备流程阶段示单克隆抗体制备流程阶段示单克隆抗体制备流程阶段示意图。请据图回答下列问题：图示意图。请据图回答下列问题：图示意图。请据图回答下列问题：图示意图。请据图回答下列问题：图10101010（1 1 1 1）该技术是在动物细胞培养技术和）该技术是在动物细胞培养技术和）该技术是在动物细胞培养技术和）该技术是在动物细胞培养技术和 技术的基技术的基技术的基技术的基础上发展起来的。础上发展起来的。础上发展起来的。础上发展起来的。（2 2 2 2）图）图）图）图10101010中细胞中细胞中细胞中细胞A A A A体外培养不具有体外培养不具有体外培养不具有体外培养不具有分裂能力，但能分泌分裂能力，但能分泌分裂能力，但能分泌分裂能力，但能分泌 ，细胞细胞细胞细胞B B B B体外培养能够体外培养能够体外培养能够体外培养能够 。（3 3 3 3）动物细胞融合常用的方）动物细胞融合常用的方）动物细胞融合常用的方）动物细胞融合常用的方法是法是法是法是 。图10（1 1）动物细胞融合（）动物细胞融合（）动物细胞融合（）动物细胞融合（2 2）分泌特异性抗体）分泌特异性抗体）分泌特异性抗体）分泌特异性抗体 、无限增殖、无限增殖、无限增殖、无限增殖（3 3）PEGPEG（灭活的病毒、电刺激）（灭活的病毒、电刺激）（灭活的病毒、电刺激）（灭活的病毒、电刺激）（4 4 4 4）细胞融合是随机的过程，在）细胞融合是随机的过程，在）细胞融合是随机的过程，在）细胞融合是随机的过程，在HATHATHATHAT培养基中培养，要筛培养基中培养，要筛培养基中培养，要筛培养基中培养，要筛选出选出选出选出 细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，常向培养液中加入摄取葡萄糖，常向培养液中加入摄取葡萄糖，常向培养液中加入摄取葡萄糖，常向培养液中加入 （激素）。（激素）。（激素）。（激素）。（5 5 5 5）培养）培养）培养）培养2 2 2 2周后，即测定培养细胞周后，即测定培养细胞周后，即测定培养细胞周后，即测定培养细胞的特征，筛选出的特征，筛选出的特征，筛选出的特征，筛选出 细细细细胞置于不同孔内（如图所示）培养。胞置于不同孔内（如图所示）培养。胞置于不同孔内（如图所示）培养。胞置于不同孔内（如图所示）培养。此操作前要将培养细胞稀释到此操作前要将培养细胞稀释到此操作前要将培养细胞稀释到此操作前要将培养细胞稀释到7 7 7 710101010个细胞个细胞个细胞个细胞/ml/ml/ml/ml，每孔滴入，每孔滴入，每孔滴入，每孔滴入0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml细胞稀释液，其目的是细胞稀释液，其目的是细胞稀释液，其目的是细胞稀释液，其目的是 。（6 6 6 6）要获得大量的单克隆抗体，）要获得大量的单克隆抗体，）要获得大量的单克隆抗体，）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞进行可对获得的杂交瘤细胞进行可对获得的杂交瘤细胞进行可对获得的杂交瘤细胞进行 培养。培养。培养。培养。（4 4）杂交瘤、胰岛素（）杂交瘤、胰岛素（）杂交瘤、胰岛素（）杂交瘤、胰岛素（5 5）特异性分泌抗）特异性分泌抗）特异性分泌抗）特异性分泌抗X X蛋白抗体的、保证每个蛋白抗体的、保证每个蛋白抗体的、保证每个蛋白抗体的、保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保证抗体的纯度）、（证抗体的纯度）、（证抗体的纯度）、（证抗体的纯度）、（6 6）体外或体内）体外或体内）体外或体内）体外或体内写出写出写出写出 、所指的细胞工程各称：、所指的细胞工程各称：、所指的细胞工程各称：、所指的细胞工程各称：。实施细胞工程时，所需的受体实施细胞工程时，所需的受体实施细胞工程时，所需的受体实施细胞工程时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是细胞大多采用动物卵细胞的原因是细胞大多采用动物卵细胞的原因是细胞大多采用动物卵细胞的原因是：。多莉面部的毛色是多莉面部的毛色是多莉面部的毛色是多莉面部的毛色是 ，判断依据是判断依据是判断依据是判断依据是：。继植物组织培养之后，克隆绵羊继植物组织培养之后，克隆绵羊继植物组织培养之后，克隆绵羊继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞也具有培育成功，证明动物细胞也具有培育成功，证明动物细胞也具有培育成功，证明动物细胞也具有 。请举例说明克隆绵羊培育成功的请举例说明克隆绵羊培育成功的请举例说明克隆绵羊培育成功的请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义实际意义实际意义实际意义：。2.2.2.2.世界上第一只克隆绵羊世界上第一只克隆绵羊世界上第一只克隆绵羊世界上第一只克隆绵羊“多莉多莉多莉多莉”的培育等程序如图所示。的培育等程序如图所示。的培育等程序如图所示。的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：请仔细看图后回答问题：请仔细看图后回答问题：请仔细看图后回答问题：黑面绵羊去黑面绵羊去核卵细胞核卵细胞白面绵羊卵白面绵羊卵腺细胞核腺细胞核重组细胞重组细胞早期胚胎早期胚胎另一头母绵羊子宫另一头母绵羊子宫克隆绵羊多莉克隆绵羊多莉ab电脉冲处理妊娠、出生核移植核移植核移植核移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植卵细胞体积大，易于操作，卵细胞中有卵细胞体积大，易于操作，卵细胞中有卵细胞体积大，易于操作，卵细胞中有卵细胞体积大，易于操作，卵细胞中有启动核基因表达的物质启动核基因表达的物质启动核基因表达的物质启动核基因表达的物质白色白色白色白色多利的核基因全部来自白面绵阳多利的核基因全部来自白面绵阳多利的核基因全部来自白面绵阳多利的核基因全部来自白面绵阳全能性全能性全能性全能性保存濒危物种，繁殖优良品种，医学上克隆器官保存濒危物种，繁殖优良品种，医学上克隆器官保存濒危物种，繁殖优良品种，医学上克隆器官保存濒危物种，繁殖优良品种，医学上克隆器官3.3.科学家用小鼠骨髓癌细胞与某种细胞融合，得到科学家用小鼠骨髓癌细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓癌细胞融合的是髓癌细胞融合的是 A.A.经过免疫的经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞B.B.不经过免疫的不经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞C.C.经过免疫的经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 D.D.不经过免疫的不经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞A4.4.科学家将雌黑鼠乳腺细胞的细胞核移入白鼠去核科学家将雌黑鼠乳腺细胞的细胞核移入白鼠去核的卵细胞内，待发育成早期胚胎后移植入褐鼠的子的卵细胞内，待发育成早期胚胎后移植入褐鼠的子宫，该褐鼠产下小鼠的体色和性别分别是宫，该褐鼠产下小鼠的体色和性别分别是 A.A.黑、雌黑、雌 B.B.褐、雌褐、雌 C.C.白、雄白、雄 D.D.黑、雄黑、雄 A5.5.将小鼠骨髓瘤细胞与一种将小鼠骨髓瘤细胞与一种B B淋巴细胞融合，可使淋巴细胞融合，可使融合的细胞经培养产生单克隆抗体，其依据是融合的细胞经培养产生单克隆抗体，其依据是 A.B A.B淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖 B.B B.B淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合后才能产生抗淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合后才能产生抗体体 C.C.骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能产生抗体骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能产生抗体 D.D.骨髓瘤细胞可以产生抗体，但不能增殖骨髓瘤细胞可以产生抗体，但不能增殖 （多选）（多选）ACC4 4单克隆抗体是指单克隆抗体是指 A A、单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体 B B、单个、单个B B淋巴细胞增殖产生的抗体淋巴细胞增殖产生的抗体C C、单个杂交瘤细胞增殖产生的抗体、单个杂交瘤细胞增殖产生的抗体 D D、单个抗体通过克隆化，产生大量抗体、单个抗体通过克隆化，产生大量抗体5.5.下列哪一项属于克隆？下列哪一项属于克隆？A.A.将鸡的某个将鸡的某个DNADNA片段整合到小鼠的片段整合到小鼠的DNADNA分子中分子中 B.B.将抗药菌的某基因引人草履虫的细胞内将抗药菌的某基因引人草履虫的细胞内 C.C.将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞瘤细胞 D.D.将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系 D6.6.一只羊的卵细胞核被另一只羊的体细胞核一只羊的卵细胞核被另一只羊的体细胞核置换后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入置换后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入第三只羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。第三只羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。这种克隆技术具有多种用途，但是不能这种克隆技术具有多种用途，但是不能 A A有选择地繁殖某一性别的家畜有选择地繁殖某一性别的家畜 B.B.繁殖家畜中的优秀个体繁殖家畜中的优秀个体C C用于保存物种用于保存物种 D.D.改变动物的基因型改变动物的基因型D7.在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是确的是 （）A.结果是相同的结果是相同的 B.杂种细胞的形成过程基本相同杂种细胞的形成过程基本相同 C.操作过程中酶的作用相同操作过程中酶的作用相同 D.诱导融合手段的手段相同诱导融合手段的手段相同B8.8.已知细胞合成已知细胞合成DNADNA有有 D D 和和 S S 两条途径，其两条途径，其中中D D途径能被氨基嘌呤阻断。途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有人淋巴细胞中有这两种这两种DNADNA的合成途径，但一般的合成途径，但一般DNADNA不分裂增殖。不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：二醇促融，获得杂种细胞。请回答：试管中除融合的杂种细胞外，还有试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融种融合细胞合细胞 2 设计一方法（不考虑机械方法），从培养设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。液中分离出杂种细胞，并说原理。培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞。培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞。加入氨基嘌呤后，使加入氨基嘌呤后，使 D D 合成途径阻断，合成途径阻断，仅有仅有 D D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的胞中的 S S 途径合成途径合成DNADNA而增殖。而增殖。制备单克隆抗体制备单克隆抗体1 1、常规抗体获得的方法及其特点、常规抗体获得的方法及其特点2 2、单克隆抗体制备的原理、单克隆抗体制备的原理 利用利用 产生特异性抗体的功能。产生特异性抗体的功能。利用利用 无限增殖的特性。无限增殖的特性。利用利用 技术将两种细胞融合获得技术将两种细胞融合获得 杂交瘤细胞。杂交瘤细胞。利用利用 技术大量培养杂交瘤细胞。技术大量培养杂交瘤细胞。B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞动物细胞融合动物细胞融合动物细胞培养动物细胞培养3 3、单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备4 4、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用（1 1）融合后的杂种细胞容易成活吗？）融合后的杂种细胞容易成活吗？（2 2）制备单克隆抗体的过程应用了哪些细胞工程）制备单克隆抗体的过程应用了哪些细胞工程技术手段？技术手段？（3 3）在整个制备的过程中要经过几次筛选？在整个制备的过程中要经过几次筛选？思考思考：细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活细胞融合技术、细胞培养技术细胞融合技术、细胞培养技术.筛选得到杂交瘤细胞，筛选得到杂交瘤细胞，.筛选先在多孔培养板上，在每孔只有筛选先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交一个杂交 瘤细胞瘤细胞下培养筛选出特异抗体的细胞群下培养筛选出特异抗体的细胞群怎样筛选出怎样筛选出B B淋巴细胞和骨髓瘤细胞间融合所形淋巴细胞和骨髓瘤细胞间融合所形成的能产生特定抗体的杂交瘤细胞？成的能产生特定抗体的杂交瘤细胞？用抗体检测和克隆化培养得到能分泌所需抗体用抗体检测和克隆化培养得到能分泌所需抗体的杂种细胞的杂种细胞专一抗体检测专一抗体检测。18.18.如何利用杂交瘤细胞来大量生产单克隆抗体？如何利用杂交瘤细胞来大量生产单克隆抗体？将杂交瘤细胞在将杂交瘤细胞在体外大规模培养体外大规模培养，从细胞培，从细胞培养液中就能提取大量的单克隆抗体；养液中就能提取大量的单克隆抗体；把杂交瘤细胞注射到把杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖小鼠腹腔内增殖，再从小，再从小鼠腹腔中提取单克隆抗体。鼠腹腔中提取单克隆抗体。如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的