miR-27a-3p_RC...毒方抑制上皮间质转化的机制_吴存恩.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 819 miR-27a-3p/RCBTB1/-catenin轴与胃癌临床 特征的关联性及益气化瘀解毒方 抑制上皮间质转化的机制吴存恩，壮雨雯，周锦勇，王琼，钱军，刘沈林（南京中医药大学附属医院，南京 210029）摘要：目的：明确miR-27a-3p/RCBTB1/-catenin与胃癌临床特征的关系，探讨益气化瘀解毒方抑制胃癌上皮间质转化（EMT）的作用机制。方法：生物信息学分析miR-27a-3p、RCBTB1在胃癌中的表达与临床意义；高通量测序检测小鼠肝转移瘤组织内mRNA表达差异；质粒转染构建沉默或过表达miR-27a-3p、RCBTB1的稳定细胞株；Transwell、划痕实验检测胃癌细胞侵袭迁移能力的改变；脾脏注射MFC细胞建立小鼠胃癌肝转移模型并以益气化瘀解毒方干预，检测肝转移瘤数量，苏木精-伊红染色（HE）染色法检测胃癌细胞肝脏浸润情况；RT-PCR、Western Blot检测miR-27a-3p、RCBTB1、-catenin、E-cadherin、Snail的表达。结果：miR-27a-3p在胃癌组织中较正常组织升高（P0.01），且期胃癌组织中miR-27a-3p表达较、期增高（P0.05）。与对照组比较，miR-27a-3p过表达组胃癌细胞侵袭迁移能力增强，miR-27a-3p沉默组细胞侵袭性减弱（P0.01）。高通量测序显示，益气化瘀解毒方组小鼠肝转移瘤组织内RCBTB1较对照组升高，且TargetScan预测RCBTB1为miR-27a-3p的潜在靶基因。与对照组比较，过表达miR-27a-3p能抑制RCBTB1（P0.01），沉默miR-27a-3p能上调RCBTB1表达（P0.01）。生信分析提示，RCBTB1低表达组胃癌患者PFI、DSS较高表达组降低（P0.05）。细胞实验提示，沉默RCBTB1可增强胃癌细胞侵袭性（P0.01），过表达RCBTB1能抑制胃癌细胞侵袭性（P0.01，P0.05）。与对照组比较，益气化瘀解毒方含药血清组E-cadherin表达升高（P0.01），Snail、-catenin表达降低（P0.01，P0.05）。体内实验显示与对照组比较，益气化瘀解毒方组胃癌细胞在肝组织中的浸润减少，肿瘤组织内 miR-27a-3p、-catenin、Snail表达下调（P0.01），RCBTB1、E-cadherin表达上调（P0.01，P0.05）。结论：miR-27a-3p/RCBTB1/-cateni是促进胃癌EMT的重要信号轴，益气化瘀解毒方能调控miR-27a-3p/RCBTB1/-catenin信号以抑制EMT，进而发挥抗胃癌转移的作用。关键词：益气化瘀解毒方；胃癌；临床特征；上皮间质转化；miR-27a-3p/RCBTB1/-catenin基金资助：国家自然科学基金项目（No.82104950），2019国家中医药管理局中医药循证能力建设项目（No.2019XZZX-ZL003），重大疑难疾病中西医临床协作试点，国家中医临床研究基地开放课题（No.JD2019SZXYB01），江苏省卫生健康委医学科研项目（No.H2019094），国家中医药管理局全国名中医传承工作室建设项目（No.2018-119），中医药传承创新平台建设项目，江苏省中医院院级课题（No.Y2020CX57，No.Y2020CX60，No.Y2020CX67，No.Y2021CX06）Relationship between miR-27a-3p/RCBTB1/-catenin axis and clinical features of gastric cancer and the mechanism of Yiqi Huayu Jiedu Decoction inhibiting epithelial mesenchymal trasformationWU Cun-en，ZHUANG Yu-wen，ZHOU Jin-yong，WANG Qiong，QIAN Jun，LIU Shen-lin(Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)Abstract:Objective:To investigate the relationship between miR-27a-3p/RCBTB1/-catenin and the clinical characteristics of gastric cancer,and to explore the mechanism of Yiqi Huayu Jidu Decoction inhibiting epithelial mesenchymal trasformation(EMT).Methods:The expression and clinical significance of miR-27a-3p and RCBTB1 in gastric cancer was 研究报告通信作者：刘沈林，江苏省南京市汉中路155号南京中医药大学附属医院，邮编：210029，电话：[phone]E-mail：内文2.indd 8192023/2/28 10:36:10中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 820 analyzed by bioinformatics.High-throughput sequencing was used to detect the difference of mRNA expression in liver metastatic tumor tissues of mice.Stable cell lines with silenced or overexpressed miR-27a-3p or RCBTB1 were constructed by plasmid transfection.The invasion and migration ability of gastric cancer cells was Detected by Transwell and Wound-healing assays.MFC cells were injected into the spleen to establish liver metastasis model of gastric cancer in mice,and Yiqi Huayu Jiedu Decoction was used for intervention.The number of liver metastases was detected,and the liver infiltration of gastric cancer cells was detected by HE staining.Expression of miR-27a-3p,RCBTB1,-catenin,E-cadherin and Snail were detected by RT-PCR and Western Blot.Results:The expression of miR-27a-3p was higher in gastric cancer than normal tissues(P0.01),mir-27a-3p expression in stage gastric cancer was higher than that in stage,and (P0.05).Compared with the control group,the invasion and migration of gastric cancer cells in miR-27a-3p overexpression group was enhanced,while it got weakened in miR-27a-3p silencing group(P0.01).High-throughput sequencing showed that RCBTB1 in the liver metastatic tumor tissues of mice in Yiqi Huayu Jiedu Decoction group was higher than that in the control group,and TargetScan predicted that RCBTB1 was a potential target gene of miR-27a-3p.Compared with control group,overexpression of miR-27a-3p inhibited RCBTB1(P0.01),while silencing of miR-27a-3p up-regulated the expression of RCBTB1(P0.01).Bioinformatics analysis suggested that PFI and DSS in gastric cancer patients with low expression of RCBTB1 were decreased than those of patients with high expression of RCBTB1(P0.05).In vitro experiments suggested that silencing RCBTB1 can enhance the aggressiveness of gastric cancer cells(P0.01),while overexpression of RCBTB1 can inhibit it(P0.01,P0.05).Compared with control group,the expression of E-cadherin was increased(P0.01),the expression of Snail and-catenin were decreased in Yiqi Huayu Jiedu Decoction containing serum group(P0.01,P0.05).In vivo experiments showed that compared with the control group,the infiltration of gastric cancer cells in the liver tissues of Yiqi Huayu Jiedu Decoction group was reduced,the expression of miR-27a-3p,-catenin and Snail in tumor tissues were down-regulated(P0.01),and the expression of RCBTB1 and E-cadherin were up-regulated (P0.01,P2倍或FC0.5倍且P0.05的基因定义为差异基因。5.Transwell实验检测细胞侵袭能力 将Matrigel基质胶包被好的小室至于24孔板中，向上室加入无血清培养液，室温下水化。将对照组正常AGS细胞，miR-27a-3p过表达对照组、miR-27a-3p过表达组、miR-27a-3p沉默对照组、miR-27a-3p沉默组、RCBTB1沉默对照组、RCBTB1沉默组、RCBTB1过表达对照组、RCBTB1过表达组各组细胞饥饿24 h后，无血清培养液重悬细胞调整细胞浓度为1106/mL。取100 L各组AGS细胞悬液加入Transwell上室，24孔培养板下室内加入完全培养基，于37 的CO2培养箱中培养24 h。吸弃上室悬液，擦去微孔膜上层残余细胞，无水乙醇固定下层穿膜细胞15 min。结晶紫染色穿膜细胞30 min。倒置显微镜以100倍数下拍照，每组取3个随机视野，计数穿膜细胞后取平均值。细胞侵袭抑制率（%）=（1-含药血清组细胞数/对照组细胞数）100%。6.划痕实验检测细胞迁移能力 6孔板中每孔加入8105个AGS细胞，细胞分组同方法“5.”，CO2培养箱中培养至细胞融合率达100%。移液枪头垂直于细胞平面在细胞层上轻柔划痕。无菌PBS漂洗脱落的细胞。按照2 mL/孔加入含0.5%FBS血清培养内文2.indd 8212023/2/28 10:36:11中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 822 液，37、5%CO2培养。倒置显微镜以40倍数下拍照，并通过软件分析比较对照组与实验组间的划痕面积。7.质粒转染实验 混合稀释好的Lipofectamine3000和miR-27a-3p mimic/inhibitor、pcDNA3.1-RCBTB1/si-RCBTB1质粒或相对应的空白质粒，室温孵育20 min后将脂质体复合物加入到 6孔板使转染溶液与胃癌细胞层充分接触，加入无血清培养液于37、5%CO2培养。RT-PCR验证转染效率，转染24 h后进行下一步实验。8.RT-PCR实验检测miR-27a-3p、RCBTB1、-catenin、E-cadherin、Snail表达 Trizol室温下孵育对照组、YHJDL组、YHJDH组的AGS细胞及小鼠肝转移瘤组织，5 min后将裂解液移至1.5 mL Ep管中。每管加入0.2 mL氯仿振荡15 s后室温反应 5 min。4、12 000g离心15 min。将上层水相移入新Ep管中，按0.5 mL/管加入异丙醇，轻微上下颠倒后室温孵育10 min，于4 离心机12 000g离心10 min。吸弃上清液，加入75%乙醇700 L/管轻微漂洗RNA，4 离心机12 000g离心5 min。吸尽管中液体，室温静置干燥沉淀。DEPC水溶解RNA，微量分光光度计测定RNA浓度后保存于-80 备用。TaKaRa试剂盒逆转录按protocol操作逆转录，配制反应体系，ABI7900实时荧光定量仪进行反应。2-Ct法分析结果，比较各组RQ值差异。Ct=Ct目的基因-Ct内参，Ct=Ct实验组-Ct对照组。9.Western Blot实验检测RCBTB1、-catenin、E-cadherin、Snail表达 RIPA裂解液于冰面上裂解对照组、YHJDL组、YHJDH组的AGS细胞及小鼠肝转移瘤组织15 min，超声裂解仪裂解细胞裂解液或匀浆液15 s。4、12 000g离心15 min，收集上清液用微量分光光度计检测各组蛋白质浓度，加入蛋白上样缓冲液高温变性，于-80 冻存备用。预制胶泳道内按照 20 g/孔加入各组蛋白，80 V电泳30 min后，120 V电泳60 min。4 环境中根据目的蛋白分子量，250 mA电流转膜90 min。3%5%封闭液中室温封闭1 h。4 一抗孵育过夜。室温孵育二抗1 h。凝胶成像系统成像拍照，净光密度值统计分析。10.脾脏注射构建肝转移模型、分组给药及取材 收集对数生长期MFC细胞调整终浓度至5106/mL。腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉615小鼠，逐层开腹，夹取系膜将脾脏拉出。按5104/只将细胞注入脾被膜下，棉签按压5 min，逐层缝合腹壁。手术第3天开始灌胃，0.2 mL/20 g，每日2次，连续21 d。体内实验对照组（Control组）每次灌胃0.9%氯化钠溶液；体内实验益气化瘀解毒方低剂量组（YHJDL组）每次灌胃浓度为1.7 g/mL益气化瘀解毒方，相当于人临床用药的15倍；体内实验益气化瘀解毒方高剂量组（YHJDH组）每次灌胃浓度为3.4 g/mL的益气化瘀解毒方，相当于人临床用药的30倍。末次给药后2 h，1%戊巴比妥钠溶液以80 mg/kg剂量作腹腔注射麻醉小鼠，后颈椎脱臼，处死小鼠解剖获取肝脏及转移瘤、拍照。11.HE染色实验检测 解剖后取肝脏转移瘤组织，及时置于中性甲醛固定。取小鼠肝脏组织石蜡包埋，置于切片机上连续切片，42 水中展片，黏附载玻片捞片，60 烘干贴片。放置于烘箱，60，1 h，直至脱蜡，依次放入二甲苯 10 min，二甲苯 10 min，无水乙醇 5 min，无水乙醇 5 min，85乙醇5 min，75%乙醇5 min。冲洗切片，脱蜡，清洗乙醇。石蜡切片放入苏木精染色38 min，流水冲洗，1%盐酸酒精分化数秒，冲洗，0.6%氨水返蓝，再次冲洗。石蜡切片放入伊红染液中染色13 min。切片依次放入95%乙醇 5 min，95%乙醇 5 min，无水乙醇 5 min，无水乙醇 5 min，二甲苯 5 min，二甲苯 5 min中进行脱水透明，晾干，中性树胶封片。观察肝脏转移瘤病理组织变化。12.统计学方法 实验数据使用SPSS 23.0软件进行统计处理，符合正态分布以x-s表示，经t检验分析数据正态性，再根据变量数不同，分别选择one-way ANOVA或two-way ANOVA检验，以P0.05为差异具有统计学意义。结果1.miR-27a-3p在胃癌、正常组织中的表达差异及其对胃癌细胞侵袭迁移能力的影响 见图1。胃癌组织中miR-27a-3p表达显著高于正常组织（P0.01）（图1A-图1B）。期患者胃癌组织中miR-27a-3p表达显著高于、期（P0.05）（图1C）。过表达miR-27a-3p后胃癌细胞AGS侵袭迁移能力增强（P0.01，P0.05），沉默miR-27a-3p后细胞侵袭性被显著抑制（P0.01）（图1D-图1E）。图1 miR-27a-3p在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞 侵袭转移、EMT的影响注：A-B.TCGA数据库、临床样本分析miR-27a-3p在胃癌及正常组织中的表达差异；C.miR-27a-3p在胃癌不同病理分期中的表达差异；D.miR-27a-3p对胃癌细胞侵袭能力的影响（结晶紫染色100）；E.miR-27a-3p对胃癌细胞迁移能力的影响（40）。*P0.05，*P0.01。芽模细胞数2.miR-27a-3p/RCBTB1/-catenin信号轴与胃癌EMT的相关性 见图2-图4。高能量测序结果显示，与Control组比较，内文2.indd 8222023/2/28 10:36:12中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 823 YHJDH组中有167个基因表达上调，263个基因表达下调，将所得上调基因合集与TargetScan、ENCORI数据库预测的miR-27a-3p靶基因取交集后得到6个潜在靶基因（图2A-图2B）。其中，RCBTB1在YHJDH组中的表达较Control组升高，且被预测可能是miR-27a-3p的潜在靶点。TargetScan预测miR-27a-3p的结合位点可能位于RCBTB1的3-UTR区的490497和12071213位置（图2C）。过表达miR-27a-3p能显著抑制RCBTB1（P0.01），沉默miR-27a-3p能显著上调RCBTB1表达（P0.01）（图2D）。RCBTB1低表达的胃癌患者PFI明显降低；在、期患者中，RCBTB1低表达与患者降低的PFI、DSS相关（图3A）。RCBTB1与GSK3B、APC、AXIN1、AXIN2、CDH1的表达均呈正相关（图3B）。沉默RCBTB1后胃癌细胞AGS侵袭性增强（P0.01），而过表达RCBTB1使得细胞侵袭性被显著降低（P0.01，P0.05）（图4）。图4 RCBTB1对胃癌细胞侵袭转移性的调节作用验证注：A.RCBTB1对胃癌细胞侵袭能力的影响（结晶紫染色 100）；B.RCBTB1对胃癌细胞迁移能力的影响（40）。*P0.05，*P0.01。3.益气化瘀解毒方含药血清对胃癌细胞EMT相关分子表达的影响 见图5。与对照组比较，YHJDL组AGS细胞中E-cadherin的mRNA表达显著升高（P0.01），-catenin的mRNA表达显著降低（P0.05）；E-cadherin的蛋白表达显著升高（P0.05），-catenin、Snail的蛋白表达显著降低（P0.05）。YHJDH组AGS细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达均显著升高（P0.01），-catenin、Snail的mRNA和蛋白表达均显著降低（P0.01）。图5 益气化瘀解毒方含药血清对胃癌细胞EMT 相关分子表达的影响注：A.各组胃癌细胞EMT相关分子mRNA表达比较（x-s，n=3）；B.各组胃癌细胞EMT相关分子蛋白表达条带。*P0.05，*P0.01。92 kDa135 kDa29 kDa45 kDa对照组YHJDL组YHJDH组4.益气化瘀解毒方小鼠胃癌肝转移及相关分子表达的 影响 见图6。益气化瘀解毒方能有效减少小鼠胃癌肝转移图2 miR-27a-3p与RCBTB1的结合作用验证注：A.益气化瘀解毒方治疗后小鼠肝转移瘤组织内mRNA表达差异（火山图）；B.韦恩图miR-27a-3p靶基因预测；C.Targetscan预测miR-27a-3p与RCBTB1结合位点；D.miR-27a-3p对RCBTB1的表达影响。*P0.05，*P0.01。图3 RCBTB1与胃癌临床特征、-catenin及EMT 相关分子表达量的关系注：A.RCBTB1与不同分期的胃癌患者预后相关性；B.RCBTB1与-catenin相关调控分子的表达相关性。内文2.indd 8232023/2/28 10:36:18中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 824 灶形成，减少胃癌细胞在肝组织中的浸润。与对照组比较，YHJDL和YHJDH组miR-27a-3p表达均显著降低（P0.01）；YHJDL组肝转移瘤组织内RCBTB1、E-cadherin的mRNA表达升高（P0.01，P0.05），RCBTB1、E-cadherin的蛋白表达升高（P0.01），Snail的mRNA和蛋白表达降低（P0.01）。YHJDH组肝转移瘤组织内RCBTB1、E-cadherin的mRNA和蛋白表达显著升高（P0.01），-catenin、Snail的mRNA和蛋白表达显著降低（P0.01）。图6 益气化瘀解毒方对胃癌肝转移的体内抑制功效及miR-27a-3p、RCBTB1、-catenin、EMT相关分子表达的影响注：A.各组小鼠肝转移瘤；B.各组小鼠肝组织内肿瘤浸润情况（HE100）；C.各组肿瘤组织内相关分子mRNA表达比较（x-s，n=3）；D.各组肿瘤组织内相关分子蛋白表达情况。*P0.05，*P0.01。45 kDa135 kDa29 kDa58 kDa92 kDa讨论MicroRNAs参与恶性肿瘤发生发展等多个环节，通过结合靶mRNA的3-UTR区，调节翻译或降解过程而发挥致癌或抑癌功效10。经转化生长因子-（transforming growth factor-，TGF-）诱导肠癌细胞发生EMT后，miR-27a表达亦随之升高11。在胃癌中，Bmi-1可靶向RKIP诱导miR-27a表达以促进EMT，导致胃癌转移和耐药12。RCBTB1位于人染色体13q12.3-q14.313。有研究14证实抑制RCBTB1能促进脂肪肉瘤细胞生长迁移，抑制脂肪细胞分化引起凋亡抵抗。RCBTB1在转移性肉瘤中的缺失被报道与化疗耐药及转移风险高度相关15。RCBTB1可介导-catenin核聚集而影响家族性渗出性玻璃体视网膜病变16。作为经典Wnt通路的核心效应分子，-catenin与P120-catenin、E-cadherin在胞膜结合并通过-catenin形成E-cadherin/catenins复合物连接到细胞骨架上，从而维持上皮极性和完整性17。当-catenin发生胞膜缺失、胞质积聚和胞核异位时，核内的-catenin与转录因子协作调节Snail等靶标以进一步调控EMT18。本研究中，对TCGA数据库中446例胃癌和45例正常组织以及41例胃癌配对样本分析后发现：胃癌组织中miR-27a-3p表达显著高于癌旁组织，同样的表达趋势在针对胃癌临床组织样本的RT-PCR实验中也得以验证。临床相关性分析显示，期患者胃癌组织中miR-27a-3p表达较、期升高。体外实验证实，过表达miR-27a-3p可增强胃癌细胞侵袭性及EMT分子转变，而沉默miR-27a-3p后，细胞侵袭性被显著抑制。前期研究19-21亦发现，miR-27a介导的Wnt/-catenin通路能够调控胃癌、肠癌以及肺癌细胞EMT，在多种恶性肿瘤的侵袭转移、耐药、凋亡等过程中发挥重要作用。为探索miR-27a-3p调控-catenin的中间效应分子，建立了胃癌肝转移动物模型并以益气化瘀解毒方干预，取肝转移瘤组织测序后得到167个基因上调，263个基因下调。结合TargetScan、ENCORI数据库预测miR-27a-3p靶基因并与测序结果中上调基因取交集，得到6个潜在靶基因（ZBTB42、SUMO2、RCBTB1、CECR2、FAM184A、TMEM170B）。在对TCGA数据库中375例胃癌和32例正常组织样本进行生存分析后发现，ZBTB42、CECR2、FAM184A、TMEM170B的低表达均有利于胃癌患者的生存预后，此结果与本实验预期相反，而SUMO2的表达则与患者预后未见显著相关性。伴有RCBTB1低表达的胃癌患者预后则明显较差，且在进展期胃癌（、期）中，患者PFI和DSS下降趋势更为显著。同时，RCBTB1与已知的4种-catenin负性调控基因（GSK3B、APC、AXIN1、AXIN2）和EMT上皮标志分子CDH1的表达均呈正相关，而其余5种分子均未显示出密切关联。细胞实验进一步证实了miR-27a-3p对RCBTB1的负性调控作用。同时，RCBTB1的功能验证也得以完善，沉默RCBTB1可增强胃癌细胞侵袭性，而当过表达RCBTB1后，细胞侵袭性被显著回复。胃癌发病主要责之于正气内虚，脾胃功能虚损，机体气血阴阳失和，日久化生癌毒22。胃癌的基本病理变化为本虚标实，“脾虚瘀毒”为胃癌的主要病机，气虚、瘀血、癌毒三者结合，是胃癌的关键病理因素23。研究者以归芍六君汤化裁，配合化瘀解毒方药，创制了以“益气健脾，化瘀解毒”为基本治法的益气化瘀解毒方。方中炙黄芪性温升阳，内补中气；党参补脾养胃，健运中气；炒白术去诸经中湿而理脾胃；三者共为君药，益气健脾，调中和胃。当归辛香性开，补血和血；木香辛温入脾胃，理气健中；合用以养血和营、理气和胃。三棱辛散力猛，入血分能破血祛瘀；莪术性烈味辛，去积聚癖块，合用气血双施，化积消癥。石见穿、白花蛇舌草性苦味寒，清热解毒，消肿散结。炙甘草甘平入脾胃，调和诸药，兼以调中补虚。全方一则健脾扶正，滋养后天；一则化瘀消癥，攻邪除结。本课题组前期已开展了相关研究24-25证实益气化瘀解毒方的临床有效性，益气化瘀解毒方联合化疗治疗进展期胃癌，能够有效降低复发转移风险下降，缓解化疗相关不良反应并改善患者生活质量。本研究中，细胞实验结果显示，益气化瘀解毒方含药血清能够减弱胃癌细胞AGS体外增殖、侵袭迁移能力，并抑制miR-27a-3p mRNA表达，上调RCBTB1、E-cadherin，下调-catenin、Snail mRNA及蛋白表达。体内实验证实，益气化瘀解毒方能有效减少小鼠胃癌肝转移灶形成。HE染色提示，益气化瘀解毒方能减少胃癌细胞在肝组织中的浸润。取肝转移内文2.indd 8242023/2/28 10:36:20中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 825 瘤组织进一步行RT-PCR、Western Blot后可见，益气化瘀解毒方能显著抑制肿瘤组织内miR-27a-3p、-catenin、Snail，并上调RCBTB1、E-cadherin表达。益气化瘀解毒方含药血清能有效抑制胃癌细胞株AGS的增殖、侵袭迁移能力，并显著降低miR-27a-3p、-catenin、Snail，升高RCBTB1、E-cadherin表达，表明益气化瘀解毒方通过调控miR-27a-3p/RCBTB1/-catenin信号轴发挥抑制胃癌EMT的作用机制。本研究探讨了miR-27a-3p/RCBTB1/-catenin信号轴与胃癌临床特征的关联性，通过生物信息分析、细胞实验、组织样本加以验证。并通过高通量测序锁定了益气化瘀解毒方通过逆转EMT的调控分子，进一步基于该信号轴深入阐释了益气化瘀解毒方抑制胃癌侵袭转移的作用机制，为该方在中医药防治胃癌侵袭转移的临床应用奠定了初步的分子机制基础。参 考 文 献1 Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.CA Cancer J Clin,2018,68(6):394-4242 宋和平,王婷,李玘蔚,等.中医药对胃癌患者生活质量的影响研究进展.中华中医药杂志,2021,36(1):316-3183 Mehlen P,Puisieux A.Metastasis:A question of life or death.Nat Rev Cancer,2006,6(6):449-4584 Wagner A D,Syn N 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