miR-216a-5p调控...J细胞生物学行为的机制探讨_於潇潇.pdf

33(1):62Feb.,2023生物技术Biotechnology第 33 卷第 1 期2023 年 2 月 收稿日期:2021-10-13 作者简介:於潇潇(1991-),女,江苏省南通人,学士,技师,研究方向:临床检验,E-mail:704904668 。通讯作者:顾益凤(1974-),女,江苏省启东人,硕士,副主任技师,研究方向:临床检验诊断,E-mail:GYFKRY。miR-216a-5p 调控 HMGB1 参与膀胱癌 EJ 细胞生物学行为的机制探讨於潇潇,张小霞,张玲玲,张敏,顾益凤(南通市肿瘤医院检验科,江苏 南通 226361)摘要:目的探究微小 RNA(microRNA,miR)-216a-5p 靶向高迁移率族蛋白 1(HMGB1)调控膀胱癌细胞的增殖、凋亡和侵袭的机制。方法通过双荧光素酶报告验证 miR-216a-5p 与 HMGB1 的靶向关系。人膀胱癌细胞分为4 组:对照组、miR-216a-5p 组、HMGB1 组和 miR-216a-5p+HMGB1 组。通过转染 miR-216a-5p 类似物和/或HMGB1 质粒来提高 miR-216a-5p 和/或 HMGB1 的水平。检测各组 miR-216a-5p 和 HMGB1 蛋白表达水平,以及细胞增殖、凋亡和侵袭能力。结果 miR-216a-5p 与 HMGB1 在膀胱癌细胞中的靶向结合(P 0.05)。HMGB1 蛋白及其细胞的增殖及侵袭水平在 miR-216a-5p 组中明显较对照组低,凋亡率显著高于对照组(P 0.05)。HMGB1组的 HMGB1 蛋白、增殖和侵袭水平显著高于对照组,凋亡率显著低于对照组(P 0.05)。miR-216a-5p+HMGB1组的 HMGB1 蛋白、增殖和侵袭水平显著高于 miR-216a-5p 组且显著低于 HMGB1 组,凋亡率显著低于 miR-216a-5p 组且显著高于 HMGB1 组(P 0.05)。结论miR-216a-5p 可利用靶向抑制 HMGB1 蛋白分泌发挥将膀胱癌的细胞侵袭和增殖和抑制,并加速细胞的凋亡,可能成为膀胱癌潜在的治疗靶点。关键词:膀胱癌;微小 RNA-216a-5p;高迁移率族蛋白 1;增殖;凋亡中图分类号:R737.14 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0010Mechanism of miR-216a-5p regulating HMGB1 participatesin the biological behavior of bladder cancer EJ cellsYU Xiao-xiao,ZHANG Xiao-xia,ZHANG Ling-ling,ZHANG Min,GU Yi-feng(Department of Laboratory,Nantong Cancer Hospital,Nantong 226361,China)Abstract:ObjectiveTo explore the mechanism by which microRNA(miR)-216a-5p targets high mobility group proteinbox 1(HMGB1)to regulate the proliferation,apoptosis and invasion of bladder cancer cells.MethodThe target relationshipbetween miR-216a-5p and HMGB1 was verified by dual luciferase report.Human bladder cancer cells were divided into 4groups:control group,miR-216a-5p group,HMGB1 group and miR-216a-5p+HMGB1 group.The level of miR-216a-5p and/or HMGB1 were increased by transfection of miR-216a-5p mimic and/or HMGB1 plasmid.The expression levels ofmiR-216a-5p and HMGB1 protein in each group,as well as the cell proliferation,apoptosis and invasion abilities were detec-ted.ResultmiR-216a-5p targeted binding HMGB1 in bladder cancer cells(P 0.05).The levels of HMGB1 protein,proliferation and invasion of miR-216a-5p group were obvious lower than control group,and the apoptosis rate(18.46 1.54%)was obvious higher than control group(P 0.05).The HMGB1 protein,proliferation and invasion levels of theHMGB1 group were obvious higher than control group,and the apoptosis rate was obvious lower than control group(P 0.05).The level of HMGB1 protein,proliferation and invasion of miR-216a-5p+HMGB1 group were obvious higher than miR-216a-5p group and obvious lower HMGB1 group,and the apoptotic rate was obvious lower than miR-216a-5p group andobvious higher than HMGB1 group(P 0.05).ConclusionmiR-216a-5p can inhibit the proliferation and invasion ofbladder cancer cells by targeting the expression of HMGB1 protein,and promote apoptosis,which may be a potential therapeutictarget for bladder cancer.Keywords:bladder cancer;microRNA-216a-5p;high mobility group protein box 1;proliferation;apoptosis 膀胱癌作为成年男性人群中容易发生的一类恶性肿瘤,当前临床关于膀胱癌治疗的手段主要包括化学手段及膀胱切除手术等根治性的手段,尽管化学手段、外科的手术及放射治疗手段获取了极大地进步;然而,膀胱癌病人总体的生存率并不是特别高1-2。分析膀胱癌发生和发展的机制具有重要意 1 期於潇潇,等:miR-216a-5p 调控 HMGB1 参与膀胱癌 EJ 细胞生物学行为的机制探讨义。微小 RNA(miRNA)作为单链 RNA,主要由 22个核苷酸所组成且具有高度的保守性,其能够在蛋白转录之后再次对基因的表达实施相应的调控3。新发现的 miR-216a-5p 是抑癌基因中的一类,最新研究发现 miR-216a-5p 在膀胱癌中显著下调,并且低水平的 miR-216a-5p 与膀胱癌不良预后有关4-5,这提示 miR-216a-5p 参与膀胱癌进展,但是对调控膀胱癌进展的作用以及机制仍然不是特别的清楚。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一类多功能细胞因子,是无菌性炎症反应的重要参与者,研究发现 HMGB1 会被 miRNA 靶向调节,并且参与了膀胱癌的转移和复发6。综上,本文主要分析 miR-216a-5p 靶向 HMGB1 调控膀胱癌细胞的相关生物学行为机制。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验材料24、96 孔的组织培养板,美国康宁公司;人类的膀胱癌细胞 EJ,美国 ATCC 公司。1.1.2 试剂Renilla 的荧光素酶和突变检测试剂盒,中国的Beyotime 公司;ECL 的显色试剂盒,美国的 ThermoFisher 公司;荧光素酶相关的试剂盒,美国的 Pro-mega 公司;对凋亡的相关情况给予试剂盒(PI 和Annexin V-FITC),中国的耶森公司。SYBR PremixEx TaqTM相关的试剂盒,日本 TaKaRa 公司;mirNeasyMini 相关的试剂盒和 Trizol,德国 QIAGEN GmbH 公司;HMGB1 的一抗(浓度为 1 800)和二抗(浓度为15 000),美国的 Abcam 公司;硝酸纤维素膜,美国的 Millipore 公司。1.1.3 仪器Nanodrop 2000 检测仪器,美国 Thermo Fisher 公司;ABI7900 型号的 PCR 仪,美国的 ABI 公司;Tran-swell 的相关装置以及基质胶,美国康宁公司;流式细胞仪,美国 Becton 公司。1.1.4 培养基HMGB1 过表达质粒、miR-216a-5p 的类似物(mimic)以及相关的阴性对照(NC),中国的吉玛公司。RPMI 1640 的培养基及其相关的抗体,美国的Gibco 公司。Lipofectamine2000 的仪器,美国的 In-vitrogen 公司。1.2 方法1.2.1 细胞的培养、分组以及对应的转染在 RPMI 1640 培养基中加入人膀胱癌细胞 EJ,培养基主要有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(0.1 mg/mL)。将细胞置于 5%CO2培养箱内 95%湿度和 37 条件下培养。将细胞共分 4 组:miR-216a-5p 组、对照组、miR-216a-5p+HMGB1 组和 HMGB1 组。依据分组的不同分别将 HMGB1 质粒和/或 miR-216a-5p转染后提高 HMGB1 和/或 miR-216a-5p 的浓度水平。字后将细胞加入 6 孔板内实施培养,当细胞生长至 60%之后,添加 5 L 体积的 LipofectamineTM2000 和 100 L 体积的 Opti,共同给予 5 min 时长的孵育作为试剂 A。加入20 ng/L 体积的 miR-216a-5p mimic/HMGB1 质粒和 100 L 体积的 Opti,共同给予 5 min 时长的孵育为试剂 B。最后将 A、B 再次混合并同时给予 20 min 左右时长的孵育。16 h之后结束,给予新的培养基更换,并获取里面的细胞。对照组全部的细胞则转染同样体积的 NC 为对照。1.2.2双荧光素酶报告检测 miR-216a-5p 与HMGB1 的靶向关系 HMGB1 和 miR-216a-5p 之间的碱基结合相对应的位点则是利用 Starbase 网站获取。据其原始具体的序列,在 pGL4 的荧光素酶载体上面负载HMGB1 的 mRNA3端内的非翻译区域(3-UTR),将其看做野生型的(wt-)HMGB1。通过突变相关的试剂盒获取突变型的(mut-)HMGB1。根据之前所描述的转染手段,分别将50 nmol/L 体积的 miR-216a-5p mimic/NC 质粒和1 g 体积的 wt-/mut-HMGB1 转染至数量为 1 104的细胞内。36 h 培养结束后依据 Renilla 公式计算各组细胞之间的荧光素酶具体活性情况。1.2.3 RT-qPCR用 TRIzol 将总 RNA 从细胞内提取出来,采用Nanodrop 2000 仪器定量分析。之后用 mirNeasyMini 的试剂盒将 miRNA 分离。SYBR Premix ExTaqTM设置对应 RT-qPCR 程序:95、2 min,58、20 s,72、20 s,循环40 次,以 U6 作为此次 PCR 试验的内参,用 2-Ct法计算细胞内的 miR-216a-5p相对表达量。36生 物 技 术2023 年1.2.4 Western Blot裂解细胞之后离心(转速 12 000 r/min,温度4,时长 5 min)收集总蛋白。SDS-PAGE(浓度10%)分离蛋白质 40 g,并将其向 PVDF 膜上转移。加入适量的脱脂牛奶(浓度 5%)室温下封闭 2 h,结束后加入 HMGB1 抗体(1 800 比例稀释,4 下过夜),洗涤结束后加入二抗(15 000 比例稀释,室温下孵育 2 h)。用 ECL 处理条带,以 GAPDH 作内参分析 HMGB1 相对表达情况。1.2.5 CCK-8 检测细胞增殖活力将 0.1 mL 细胞悬浮液加入 96 孔板,孵育 48 h,之后将 10 L CCK-8 溶液加入各个孔,孵育 2 h。酶标仪 450 nm 检测各孔内光密度(OD)。1.2.6 流式细胞术检测凋亡用 1 PBS 洗涤细胞并悬浮于 100 L 缓冲液内。分别向其中加 10 L PI 以及5 L 的 Annexin V-FITC,于室温件下暗室中孵育 10 15 min。最后,将缓冲液(则为 400 L)加入样品内,并于 1 h 内用流式细胞仪对细胞的凋亡率进行检测。1.2.7 Transwell 检测侵袭将18 稀释比例的基质胶加至 Transwell 的上室内并置于37 孵育30 min。将完全培养基(体积则为 600 L)填充于 24 孔板的-Transwell 下室内。将细胞加入不含血清的培养基中,37 下饥饿处理24 h。消化结束后,向 Transwell 的上室内加 100 L细胞溶液(细胞数量为 5 105个/mL)。24 h 后将未侵入的细胞全部洗去。侵入下室内的细胞则用95%乙醇固定,0.1%结晶紫室温下染色 20 min。400 倍镜下随机挑选 5 个视野进行细胞计数。1.3 统计学处理所有指标独立检测 3 次,用 SPSS 19.0 软件统计分析,方差分析(ANOVA)评估组间差异,两两对比则用 SNK-q 检验。P 0.05 提示差异显著。2 结果与分析2.1 双荧光素酶报告证明 HMGB1 与 miR-216a-5p 之间的靶向关系 miR-216a-5p 与 HMGB1 靶向结合的具体位点如图 1 中所示。当共同转染 miR-216a-5p 以及mimicMut-HMGB1 之后,相对的荧光素酶活性(0.49 0.10)在细胞内(0.88 0.21)降低明显(P 0.05),提示了 miR-216a-5p 与 HMGB1 的靶向结合,见表 1。图 1 miR-216a-5p 与 HMGB1 mRNA 的 3-UTR 的结合位点Fig.1 The binding site of miR-216a-5p and the3-UTR of HMGB1 mRNA表 1 双荧光素酶报告证明 HMGB1 与 miR-216a-5p之间的靶向关系(相对荧光素酶活性)Tab.1 The dual luciferase report verifies the targetingrelationship between miR-216a-5p and HMGB1(relative luciferase activity)组别Wt-HMGB1Mut-HMGB1miR-216a-5p NC1.00 0.091.04 0.12miR-216a-5p mimic0.31 0.04ab0.98 0.11 注:与 miR-216a-5p NC 组对比,aP 0.05;与 Mut-HMGB1组对比,bP 0.05。Note:aP 0.05 vs miR-216a-5p NC group;bP 0.05 vs Mut-HMGB1 group.2.2 各组细胞转染后的 HMGB1 蛋白和 miR-216a-5p 表达水平 miR-216a-5p 组的 miR-216a-5p 水平显著高于对照组(P 0.05),HMGB1 蛋白的表达水平在HMGB1 组中较对照组高(P 0.05),证实了转染已经成功。HMGB1 蛋白的表达水平在 miR-216a-5p+HMGB1 组中高于 miR-216a-5p 组,且低于HMGB1 组(P 0.05)。见图 2、表 2。图 2 Western Blot 检测转染后各组细胞中 HMGB1 蛋白表达水平注:A:对照组;B:miR-216a-5p 组;C:HMGB1 组;D:miR-216a-5p+HMGB1 组。Fig.2 Western Blot detection of HMGB1 protein expressionlevel in each group of cells after transfectionNote:A:Control group;B:miR-216a-5p group;C:HMGB1 group;D:miR-216a-5p+HMGB1 group.2.3 HMGB1 和 miR-216a-5p 对膀胱癌细胞的增殖相关活力影响 4 组细胞增殖相关的活力对比差异明显(P 0.05)。miR-216a-5p 组细胞的 OD 值(0.72 0.09)较对照组低(0.93 0.08)(P 0.05),46 1 期於潇潇,等:miR-216a-5p 调控 HMGB1 参与膀胱癌 EJ 细胞生物学行为的机制探讨HMGB1 组的 OD 值(1.21 0.15)显著高于对照组(P 0.05),miR-216a-5p+HMGB1 组的 OD 值(0.82 0.10)较 miR-216a-5p 组高较 HMGB1 组低(P 0.05)。表 2 各组细胞转染后的 HMGB1 蛋白和miR-216a-5p 表达水平Tab.2 The expression levels of miR-216a-5p andHMGB1 protein in each group of cells after transfection组别miR-216a-5pHMGB1对照组1.00 0.081.00 0.07miR-216a-5p4.69 0.43a0.27 0.03aHMGB10.87 0.09a2.84 0.25amiR-216a-5p+HMGB13.51 0.31abc1.06 0.10bc 注:与对照组相比aP 0.05;与 miR-216a-5p 组相比,bP 0.05;与 HMGB1 组相比,cP 0.05。Note:aP 0.05 vs control group;bP 0.05 vs miR-216a-5pgroup;cP 0.05 vs HMGB1 group.2.4 HMGB1 和 miR-216a-5p 对膀胱癌细胞的凋亡相关能力影响 4 组细胞凋亡情况对比差异明显(P 0.05)。miR-216a-5p 组细胞的凋亡率(18.46 1.54%)高于对照组(5.39 0.60%)(P 0.05),HMGB1 组的凋亡率(3.28 0.45%)显著低于对照组(P 0.05),miR-216a-5p+HMGB1 组 的 凋 亡 率(10.27 1.35%)显著低于 miR-216a-5p 组,且显著高于 HMGB1 组(P 0.05),见图 3。表 3 各组细胞凋亡率Tab.3 Apoptosis rate of cells in each group组别凋亡率(%)对照组5.39 0.60miR-216a-5p16.46 1.54HMGB13.28 0.45miR-216a-5p+HMGB110.27 1.35图 3 流式细胞术分析 miR-216a-5p 和 HMGB1 对膀胱癌细胞凋亡的影响Fig.3 Flow cytometry analysis of the effects of miR-216a-5p and HMGB1 on the apoptosis of bladder cancer cells2.5 HMGB1 和 miR-216a-5p 对膀胱癌细胞的侵袭相关能力影响 4 组细胞侵袭能力对比差异明显(P 0.05)。miR-216a-5p 组细胞侵袭能力(74.79 2.16)低于对照组(131.04 4.21)(P 0.05),HMGB1 组的侵袭能力(192.65 6.74)显著高于对照组(P 0.05),miR-216a-5p+HMGB1 组的侵袭能力(133.29 3.98)显著高于 miR-216a-5p 组,且显著低于 HMGB1 组(P 3 cm 以及出现肌肉浸润的膀胱癌患者中 HMGB1 的水平更高16。细胞实验则证实提高 HMGB1 蛋白的表达会加速膀胱癌的细胞周期并抑制凋亡17。最重要的是,HMGB1 在肿瘤中受到 miRNA 的靶向调控,如 HMGB1 在胃癌中的表达水平和促癌作用被miR-129-5p 靶向抑制18。本研究在膀胱癌细胞中证实了 miR-216a-5p 靶向结合 HMGB1,并且miR-216a-5p 在过表达之后会靶向抑制 HMGB1蛋白进一步表达。此外,HMGB1 蛋白的过表达不但能够加速膀胱癌细胞具体的增殖、侵袭,抑制凋亡,还会进一步将 miR-216a-5p 抑制增殖、侵袭的作用给抑制住。结合相关文献,本试验结果证实了miR-216a-5p 的 降 低 会 引 起 膀 胱 癌 细 胞 中HMGB1 蛋白表达增加,这会加速膀胱癌的转移;而miR-216a-5p 在过表达之后则会靶向的下降HMGB1 蛋白相应的表达阻断,进而将膀胱癌细胞增殖、侵袭相关能力抑制住,并加速细胞的凋亡。本文也有不足之处,如关于 miR-216a-5p 与HMGB1 的相关性以及在膀胱癌中的临床意义仍需要临床研究验证,miR-216a-5p 靶向抑制 HMGB1蛋白表达以及膀胱癌进展抑制方面的作用仍需要更多动物实验来验证。4 结论miR-216a-5p 能够靶向抑制 HMGB1 蛋白的表达,降低癌细胞的增殖、侵袭,提高癌细胞的凋亡率,从而抑制癌细胞的生长及转移,并加速细胞的凋亡,发挥膀胱癌抑制的作用,提示 miR-216a-5p/HMGB1 可能成为治疗膀胱癌的新靶点。参考文献1 Hamad J,McCloskey H,Milowsky M I,et al.Bladder preservationin muscle-invasive bladder cancer:a comprehensive reviewJ.International Braz J Urol,2020,46(2):169-184.2 Cao R,Yuan L S,Ma B,et al.An EMT-related gene signature forthe prognosis of human bladder cancerJ.Int J Mol Cell Med,2020,24(1):605-617.3 Nammian P,Razban V,Tabei S M B,et al.MicroRNA-126:dualrole in angiogenesis dependent diseases J.Curr Pharm Des,2020,26(38):4883-4893.4 Zhang J,Gao S H,Zhang Y D,et al.MiR-216a-5p inhibits tu-morigenesis in pancreatic 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