基于分离培养和高通量测序分析一种自然发酵饲料的微生物组成.pdf

中国饲料2023 年第 17 期科学实验研究基金项目院国家重点研发计划野蓝色粮仓冶科技创新重点专项渊2020YFD0900205冤曰廉江市养殖集团有限公司委托项目渊009冤作者简介院梁国健袁男袁硕士研究生袁从事水产微生物研究袁E-mail院*通讯作者院温崇庆袁男袁博士袁教授袁从事海洋和水产微生物研究袁E-mail院基于分离培养和高通量测序分析一种自然发酵饲料的微生物组成梁国健1袁 洪居恳1袁 丁茂昌2袁 薛明1袁 陈伟哲1袁 梁华芳1袁 温崇庆1*渊1.广东海洋大学水产学院袁广东湛江 524088曰2.海南海昌对虾繁育有限公司袁海南文昌 571300冤DOI院10.15906/11-2975/s.2022100030-03摘要 为揭示一种对虾养殖用自然发酵饲料的微生物组成袁通过 MRS尧营养肉汤渊NB冤尧豆芽汁渊BSJ冤平板分别计数其微生物含量袁并对分离代表菌株 16S rRNA 或 5.8S-ITS 基因进行测序分析和鉴定曰分别利用高通量测序 16SrDNA V4 区和 ITS2 区研究发酵饲料细菌和真菌菌群的多样性遥 分离培养结果表明院MRS尧NB 和 BSJ 平板对发酵饲料乳酸菌尧 细菌和酵母菌的计数结果分别为 4.80伊107尧5.00伊106尧3.95伊106cfu/g曰 从分离代表菌中鉴定出 3 种芽孢杆菌袁4 种分别属于慢生乳杆菌属尧宿主关联乳杆菌属尧干酪乳酪杆菌属和黏液乳杆菌属的乳酸菌袁以及 1 种酵母菌库德毕赤酵母遥 高通量测序分析表明院乳杆菌科在发酵饲料细菌群落中占绝对优势袁并包含 20 个分类操作单元渊OTU冤和 9 个属袁其中乳杆菌属和黏液乳杆菌属相对丰度分别为 66.95%和 3.36%曰假单胞菌科尧依格纳季氏菌科和微杆菌科分别为第 2尧第 3 和第 4 优势科袁其下的假单胞菌属尧食肉蝇单胞菌属尧假棍状杆菌属相对丰度分别为 11.81%尧10.16和 3.58%曰真菌群落中毕赤酵母科占绝对优势袁其次为丝孢酵母科袁两者分别完全由毕赤酵母属和丝孢酵母属构成袁相对丰度分别为 85.73%和 12.54%遥 综上袁该自然发酵饲料中富含乳酸菌尧芽孢杆菌和毕赤酵母等有益活菌袁且乳酸菌种类丰富遥关键词 发酵饲料曰分离培养曰高通量测序曰乳酸菌曰酵母菌曰芽孢杆菌中图分类号 S816.3文献标识码 A文章编号 1004-3314渊2023冤17-0007-08随着水产养殖业的快速发展袁 动物蛋白源短缺尧抗生素与消毒产品滥用尧养殖环境恶化和病害频发等问题日益突出袁给水产行业的健康尧可持续发展带来诸多挑战渊于梦楠等袁2021冤遥 同时袁随着生活水平的提高袁消费者对水产品的安全尧无污染和无残留等要求也更加严格遥 水产品安全涉及诸多影响因素袁 其中饲料安全是关键 渊吴业阳等袁2018冤遥发酵饲料是指饲料原料通过微生物的发酵作用袁 生产的含有微生物及其代谢产物的饲料产品遥 饲料原料经发酵处理后袁 可有效增加营养价值袁并降低其中难以被利用的粗纤维尧抗营养因子或真菌毒素等袁在替代鱼粉等高价原料和野减抗替抗冶方面应用前景广阔渊李爱科等袁2020冤遥 相较于传统饲料袁发酵饲料在水产养殖上能满足绿色尧环保和健康的发展要求袁具有提高饲料利用率袁促进水产动物生长发育袁 增强水产动物免疫抗病和改善养殖生态环境等功效渊于梦楠等袁2021冤遥目前袁 发酵饲料在水产养殖中的研究已有较多报道袁主要体现在菌种筛选尧工艺优化尧饲喂效果以及对水产动物肠道菌群等影响 渊孟阳袁2019曰袁春营等袁2018曰姜燕袁2014曰Zhang 等袁2014曰Man鄄dal 等袁2013冤袁而对发酵饲料本身菌群的研究报道相对较少遥 微生物指标尤其是有益微生物的种类和含量袁 对发酵饲料的品质和应用效果具有重要影响遥 通常采用平板计数法检测发酵饲料的活菌7中国饲料2023 年第 17 期含量渊黄甜等袁2021冤袁但该方法只适合于已知特定目标菌的检测袁无法全面了解菌群组成遥高通量测序技术一定程度上克服了分离培养的局限袁 能够深入探究菌群结构组成与多样性 渊温崇庆等袁2016冤袁在微生物饲料添加剂菌群分析和质量评价上也具有重要应用价值 渊李明等袁2022冤遥 如利用Illumina 高通量测序袁王格等渊2018冤和董胜奇等渊2019冤分别研究了豆粕发酵过程中细菌和真菌群落的组成与变化曰Su 等 渊2021冤 研究了添加酵母菌尧 乳酸菌和中性蛋白酶发酵胚芽粉和面筋为主的玉米加工副产物的菌群变化遥 本研究结合分离培养和高通量测序技术对一种对虾养殖用自然发酵饲料的微生物含量尧 菌群组成与多样性进行分析袁以了解其菌群特征尧挖掘有益菌种资源袁为水产自然发酵饲料的研究和应用提供参考依据遥1材料与方法1.1试验材料1.1.1发酵饲料发酵饲料是以麸皮和豆粕等为原料拌以虾塘养殖海水进行自然固态发酵而成的袁在对虾养殖中具有良好的应用效果遥采集新发酵的成品袁部分样品直接用于分离培养袁部分样品于-20 益暂存用于菌群高通量测序遥1.1.2主 要 试 剂营 养 肉 汤 渊NB冤 培 养 基渊CM106冤袁北京陆桥技术有限责任公司产品曰MRS培养基渊HB0384冤袁青岛海博生物技术有限公司产品曰豆芽汁渊BSJ冤培养基袁参考叶微生物学实验曳渊沈萍等袁2007冤方法配制遥细菌 DNA 提取试剂盒 渊D3350冤尧 酵母 DNA提取试剂盒 渊D3370冤尧 土壤 DNA 提取试剂盒渊D5625冤 和 DNA 胶回收试剂盒 渊D2500冤袁 均为Omega 公司产品遥1.2试验方法1.2.1平板计数和分离纯化参考洪居恳等渊2020冤方法袁用无菌生理盐水稀释样品后袁取适宜梯度稀释液 0.1 mL 分别涂布 NB尧MRS 和 BSJ 琼脂平板袁30 益培养 6 d袁根据菌落数分别计数发酵饲料中一般异养细菌尧乳酸菌和酵母菌含量遥在上述平板计数的同时袁 选取不同类型的代表性单菌落进一步划线纯化后鉴定遥1.2.2菌种鉴定分别采用细菌和酵母菌 DNA提取试剂盒按操作说明提取细菌和酵母菌菌株DNA遥 参考 Xue 等渊2016冤方法以 16S rRNA 基因引物 27F 和 1492R 对细菌 DNA 进行 PCR 扩增曰参考宁为民等渊2021冤方法以 5.8S-ITS 基因引物ITS1 和 ITS4 对酵母菌 DNA 进行 PCR 扩增遥将各菌株阳性扩增产物通过 ABI 370XL 测序仪以相应的扩增引物进行双向测序袁 再拼接完整遥 细菌16S rDNA 序 列 通 过 EzBioCloud 渊https:/ 序列通过 NCBI渊https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/冤数据库与有效发表菌株进行比对分析袁 根据序列相似性进行鉴定遥1.2.3发酵饲料 DNA 提取和菌群 PCR 扩增分别采用细菌和土壤 DNA 提取试剂盒按操作说明提取发酵饲料总 DNA袁每种试剂盒独立提取两次袁并作为两份独立 DNA 样品遥 以细菌试剂盒提取的DNA 为模板袁参考温崇庆等渊2016冤方法以带有标签序列的 16S rRNA 基因 V4 区引物 515F 和 806R进行细菌菌群的 PCR 扩增曰 以土壤试剂盒提取的DNA 为模板袁参考 Zhao 等渊2019冤方法以带有标签序列的真菌 ITS 引物 gITS7F 和 ITS4R 进行真菌菌群的扩增袁每份 DNA 均做 3 次重复扩增遥1.2.4高通量测序和菌群数据分析将每份DNA 的 3 次阳性重复扩增产物混合为一个样品袁通过 DNA 胶回收试剂盒切胶回收目的片段袁进一步定量后构建测序文库袁 通过 Illumina MiSeq 平台分别对发酵饲料的细菌和真菌菌群进行高通量测序遥 分别参照温崇庆等渊2016冤方法和 Zhao 等渊2019冤方法袁对细菌和真菌的高通量测序数据进行处理和分析曰 通过 Excel 软件统计发酵饲料细菌和真菌在门尧科尧属和分类操作单元渊OTU冤水平上的相对序列丰度袁 对平均丰度逸 1.0%的优势门尧科尧属进行分析遥2结果与分析2.1发酵饲料微生物含量和代表菌分离NB尧BSJ 和 MRS 培养基对发酵饲料中微生物计数结果如表 1 所示遥 NB 平板对发酵饲料菌含量的总计数结果为 5伊106cfu/g袁 包含了分别占 94%尧5%和 1%的 3 种类型菌落遥 每种类型各选一个单菌落进一步纯化袁分别编号为 N1尧N2 和 N3遥 BSJ 平板计数结果为 5.25伊106cfu/g袁其中酵母样菌落最为优势渊占 75.24%冤袁且菌落类型单一袁选择 1 个8中国饲料2023 年第 17 期表 1三种培养基分离自然发酵饲料微生物的鉴定结果培养基 代表菌编号N2N3计数结果/渊cfu/g冤2.50伊1055.00伊104序列比对结果Bacillus velezensisCR-502TBacillus siamensisKCTC 13613T10099.86NBN14.70伊106Bacillus paralicheniformisKJ-16T100最相似种最相似菌株相似性/%BSJB13.95伊106Pichia kudriavzeviiYB-25100B21.00伊106Bacillus paralicheniformisKJ-16T100B33.00伊105Bacillus siamensisKCTC 13613T99.93MRSM1Lentilactobacillus buchneri silageiSG162T99.79M2Lacticaseibacillus paracasei toleransJCM 1171T99.86M3Ligilactobacillus acidipiscisNBRC 102163T99.65M44.80伊107Ligilactobacillus acidipiscisNBRC 102163T99.65M5Lentilactobacillus buchneri silageiSG162T100M6Limosilactobacillus panisDSM 6035T99.65M71.50伊106Pichia kudriavzeviiYB-25100编号为 B1 的单菌落进一步纯化遥 此外袁BSJ 平板上还有以 B2 和 B3 为代表的两类相对较小菌落袁数量分别占 19.05%和 5.71%袁 转接 NB 平板纯化后袁分别与 NB 平板上的代表菌落 N1 和 N3 特征完全一致遥 MRS 平板计数结果为 4.95伊107cfu/g袁其中绝大多数渊97%冤菌落相对较小袁选择 6 个略有差异的单菌落渊编号 M1耀M6冤进一步纯化曰MRS平板上另有 3%的菌落为一种较大的酵母样菌落袁随机选 1 个单菌落编号为 M7袁转接 BSJ 平板纯化后袁与 B1 的菌落特征完全一致遥2.2分离菌株的鉴定结果对分离代表细菌 16SrDNA 序列拼接后袁 经 EzBioCloud 数据库与模式菌株比对分析袁鉴定结果如表 1 所示遥 NB 平板分离的 3 种类型代表菌株 N1尧N2 和 N3 分别与副地衣芽孢杆菌渊Bacillus paralicheniformis冤尧贝莱斯芽孢杆菌渊B.velezensis冤和暹罗芽孢杆菌渊B.siamen鄄sis冤模式菌株序列最相似遥 BSJ 平板上两类较小菌落均为细菌袁其中代表菌 B2 与 N1 的序列完全一致袁B3 与 N3 序列只有一个碱基差异袁 菌株 B2渊N1冤和 B3渊N3冤分别被鉴定为副地衣芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌遥 MRS 平板分离菌株 M1耀M6 均为乳酸菌袁包含慢生乳杆菌渊Lentilactobacillus冤尧宿主关联乳杆菌 渊Ligilactobacillus冤尧 干酪乳酪杆菌渊Lacticaseibacillus冤 和黏液乳杆菌渊Limosilacto鄄bacillus冤4 个属袁其中 M1 与 M5 序列完全一致袁均被鉴定为布赫纳氏慢生乳杆菌青贮饲料亚种渊Lentilactobacillus buchneri silagei冤曰M3 与 M4 序列仅有 3 个碱基不同袁 均被鉴定为酸鱼宿主关联乳杆菌渊Ligilactobacillus acidipiscis冤曰而 M2 和 M6分别被鉴定为副干酪乳酪杆菌坚韧亚种渊Lactica鄄seibacillus paracasei tolerans冤 和面包黏液乳杆菌渊Limosilactobacillus panis冤遥MRS 平板分离的 M7 与 BSJ 平板分离的 B1菌株均为酵母菌袁ITS 序列完全一致袁 在 NCBI 数据库比对分析得到的最相似菌种均为库德毕赤酵母渊Pichia kudriavzevii冤渊表 1冤遥可见发酵料中易培养微生物数量和种类上均以乳酸菌为主袁 其次为芽孢杆菌曰而易培养酵母菌完全为库德毕赤酵母遥2.3高通量测序发酵饲料细菌组成对发酵饲料细菌菌群 16S rDNA V4 区高通量测序数据处理后袁两个重复样本分别获得 24420 和 24302 条高质量序列袁共包含 90 个 OTU袁香农渊Shannon冤多样性指数为渊1.32依0.39冤袁归属于6个门尧32个科和50个属遥2.3.1优势细菌门尧科和属如图 1A 所示袁发酵饲料细菌群落中有 4 个优势门袁 其中厚壁菌门渊Firmicutes冤 相对丰度占绝对优势袁 变形菌门渊Proteobacteria冤次之袁而放线菌门渊Actinobacteria冤和拟杆菌门渊Bacteroidetes冤平均相对丰度分别只有 3.61%和 1.07%遥 乳杆菌科渊Lactobacillaceae冤为绝对优势科袁占厚壁菌门丰度 99.46%袁包含 20 个OTU袁由最优势的乳杆菌属渊Lactobacillus冤和第 5优势的黏液乳杆菌属渊图 1B尧1C冤袁以及宿主关联乳杆菌属 渊Ligilactobacillus冤 等 7 个非优势属组成曰 而同属于厚壁菌门的芽孢杆菌科渊Bacil鄄laceae冤及其芽孢杆菌属的丰度仅有 0.02%遥 变形菌门下的假单胞菌科渊Pseudomonadaceae冤和依格纳季氏菌科渊Ignatzschineria_f冤分别为第 2 和第 3优势科渊图 1B冤袁两者逸98.5%的丰度分别由假单胞菌属渊Pseudomonas冤渊第 2 优势属冤和食肉蝇单胞菌属渊Wohlfahrtiimonas冤渊第 3 优势属冤组成渊图1C冤遥 放线菌门序列几乎全部由微杆菌科渊Mi鄄crobacteriaceae冤组成渊图 1B冤袁该科序列又完全由假棍状杆菌属渊Pseudoclavibacter冤组成渊图 1C冤遥拟杆菌门丰度只有几个非优势科或属构成遥9中国饲料2023 年第 17 期表 2高通量测序自然发酵饲料优势细菌OTU 的相对丰度与鉴定结果OTU 编号OTU2相对丰度/%11.81依4.9916S序列比对结果Lactobacillus ultunensisDSM 16047TPseudomonas fluvialisASS-1T97.63OTU165.32依15.92Lactobacillus amylovorusDSM 20531T100最相似种最相似模式菌株相似性/%Pseudomonas pharmacofabricaeZYSR67-ZTOTU310.16依5.99Wohlfahrtiimonas chitiniclasticaS5T99.21OTU43.58依1.76Pseudoclavibacter caeniMJ28T100OTU53.04依1.52Limosilactobacillus reuteriJCM 1112T100Limosilactobacillus antriDSM 16041TLimosilactobacillus frumentiDSM 13145TLimosilactobacillus orisDSM 4864TLimosilactobacillus agrestisWF-MT5-ATLimosilactobacillus portuensisc11Ua_112_MTLimosilactobacillus balticusBG-AF3-ATLimosilactobacillus rudiiSTM3_1TLimosilactobacillus albertensisLr3000TLimosilactobacillus urinaemulierisc9Ua_26_MTLimosilactobacillus panisDSM 6035TLimosilactobacillus caviaeMOZM2T图 1高通量测序自然发酵饲料优势细菌门渊A冤尧科渊B冤和属渊C冤的相对丰度2.3.2优势细菌 OTU乳杆菌尧假单胞菌尧食肉蝇单胞菌尧 假棍状杆菌和黏液乳杆菌等 5 个优势属分别包含 8尧2尧1尧1 和 5 个 OTU遥 相对序列丰度逸1.0%的 OTU 有 5 个袁按丰度大小依次编号为OTU1耀OTU5袁分别属于上述 5 个优势属袁它们的16S rDNA V4 区序列与模式菌株序列的比对信息如表 2 所示遥 OTU1 丰度占绝对优势袁与食淀粉乳杆菌渊Lactobacillus amylovorus冤和厄尔纳拉乳杆菌渊Lactobacillus ultunensis冤模式菌株序列的相似性均 100%曰OTU2 与两种假单胞菌渊Pseudomonas冤模式菌株序列相似性一致曰OTU3尧OTU4 分别与解几丁质食肉蝇单胞菌 渊Wohlfahrtiimonas chitiniclas鄄tica冤和污泥假棍状杆菌渊Pseudoclavibacter caeni冤模式菌株最相似曰OTU5 与 12 种黏液乳杆菌模式菌株的序列相似性均为 100%遥 本研究表明自然发酵饲料优势细菌菌群中袁 乳酸菌不仅在丰度上占绝对优势袁且其种类也最多样遥2.4高通量测序发酵饲料真菌组成高通量测序 ITS 序列数据处理后袁 两个重复样本分别获得18234 和 21917 条高质量序列袁包含 36 个真菌 O鄄TU袁香农多样性指数为渊0.48依0.20冤袁归属于 3 个门尧21 个科和 25 个属遥发酵饲料真菌菌群包含子囊菌门渊Ascomy鄄cota冤和担子菌门渊Basidiomycota冤两个优势门袁其中子囊菌门占 32 个 OTU袁丰度也占绝对优势曰担子菌门只由 3 个 OTU 构成曰唯一的非优势门毛霉门渊Mucoromycota冤仅有一个 OTU 构成袁丰度也极低渊图 2A冤遥 毕赤酵母科渊Pichiaceae冤及其下的毕赤酵母属渊Pichia冤虽然都只是一个 OTU渊OTU1冤构成袁但其丰度占子囊菌门的 98.01%袁占真菌菌群总丰度的 85.73%袁为绝对优势科/属渊图 2B尧2C冤曰德巴利酵母科渊Debaryomycetaceae冤也属于子囊菌门袁占其丰度的 1.41%袁是丰度最低的优势科渊图2B冤袁包含 3 个各由一个 OTU 构成的非优势属袁即假 丝 酵 母 属 渊Candida冤尧 洛 德 酵 母 属 渊Lod鄄deromyces冤和迈耶氏酵母属渊Meyerozyma冤遥担子菌门包含两个科袁 一是丰度仅次于毕赤酵母科的丝孢酵母科渊Trichosporonaceae冤渊图 2B冤袁它由 2 个属于丝孢酵母属渊Trichosporon冤的 OTU 构成袁其中占真菌总丰度 12.53%的 OTU2 对担子菌门尧丝孢10中国饲料2023 年第 17 期图 2高通量测序自然发酵饲料优势真菌门渊A冤尧科渊B冤和属渊C冤的相对丰度酵母科和丝孢酵母属的丰度贡献均超过 99.9%曰另一个是丰度极低的锁掷孢酵母科渊Sporidiobo鄄laceae冤袁仅含 1 个属于红酵母属渊Rhodotorula冤的OTU遥 除了上述属于酵母菌的 6 个优势和非优势属外袁还包括曲霉属渊Aspergillus冤等 19 个丰度总和只占 0.5%的非酵母类真菌属袁它们可能来自饲料原料或发酵过程中空气接触污染遥如上所述袁 发酵饲料真菌菌群中只有 OTU1和 OTU2 这两个优势 OTU袁 两者序列丰度之和高达 98.26%遥 NCBI 比对显示与 OTU1 和 OTU2 的ITS 序列 100%相似且得分最高的分别为库德毕赤酵母和阿萨希丝孢酵母渊T.asahii冤遥 本研究表明发酵饲料真菌菌群多样性相对较低袁 优势种群主要由库德毕赤酵母和阿萨希丝孢酵母构成遥3讨论3.1发酵饲料的微生物学检测发酵饲料因其所用原料尧菌种尧发酵方式及应用对象等不同袁对其品质的检测及评价袁很难有统一的质量标准遥发酵饲料的水分尧 粗灰分和粗蛋白质等常规检测指标以及卫生指标通常参考饲料有关的国家标准袁而微生物检测指标目前主要参考饲料尧 饲料添加剂或食品安全有关微生物渊检测冤的国家或行业标准渊黄甜等袁2021曰陈影等袁2019冤遥这些标准主要针对芽孢杆菌尧 乳酸菌和酵母菌等有益微生物的活菌含量进行计数袁 以及对枯草芽孢杆菌渊B.sub鄄tilis冤等特定目标菌种在形态和生理生化水平上进行鉴定袁 这对以单一或少数特定菌种为主的微生物制剂尧 微生物饲料添加剂或发酵饲料的检测通常是有效的遥 自然发酵饲料蕴含丰富的微生物资源袁其菌种的种类尧数量和性能等因所处环境和发酵条件不同而差异显著渊韩雪等袁2013冤袁常规微生物学检测袁 只能对其中易培养微生物进行计数和分离鉴定遥乳酸菌尧 芽孢杆菌和酵母菌是发酵饲料中最具代表性的关键微生物袁 其含量和种类对发酵饲料的品质和应用效果都具有重要影响遥 本研究首先利用 MRS尧NB 和 BSJ 培养基分别计数发酵饲料中乳酸菌尧细菌和酵母菌含量袁其中 MRS 计数的乳酸菌含量高达 4.8伊107cfu/mL袁分别是 NB 计数细菌和 BSJ 计数酵母菌含量的 9.6 倍和 12.2倍遥分子鉴定表明袁MRS 平板上易培养乳酸菌有 4种袁NB 平板上的 3 类细菌均为芽孢杆菌袁其中两类也出现在 BSJ 平板上袁 而 BSJ 平板上的酵母菌为单一的库德毕赤酵母袁并与 MRS 平板上的酵母菌种类一致遥因此从分离培养及鉴定上看袁本研究自然发酵饲料富含活的乳酸菌尧 芽孢杆菌和酵母菌袁但种类较有限遥本研究通过高通量测序技术发现发酵饲料细菌和真菌菌群中分别含有 90 和 32个 OTU袁在门尧科尧属和种水平上的多样性都远高于分离培养的结果遥结合两种方法袁可以更全面地解析发酵饲料的微生物组成及其潜在功能遥3.2发酵饲料优势细菌组成及其潜在功能乳酸菌是本研究发酵饲料中的绝对优势细菌袁 培养计数含量和高通量测序丰度均最高袁种类也最多遥分离培养的 6 株乳酸菌包含黏液乳杆菌尧 宿主关联乳杆菌尧慢生乳杆菌和干酪乳酪杆菌 4 个属曰菌群测序乳杆菌科占有 20 个 OTU袁共 9 个属袁包含优势的乳杆菌属尧 黏液乳杆菌属以及非优势的宿主关联乳杆菌属等遥 这些菌属以往几乎都属于乳杆菌属袁2020 年才被重新划分成不同的属渊Zheng11中国饲料2023 年第 17 期等袁2020冤袁都可以作为动物甚至人的益生菌遥如占菌群丰度最高的 OTU1 与食淀粉乳杆菌和厄尔纳拉乳杆菌模式菌株 16S 序列相似性均为 100%袁食淀粉乳杆菌可作为人或畜的益生菌袁 也是青贮饲料发酵的重要菌种渊史悦等袁2020冤袁厄尔纳拉乳杆菌则是健康人胃黏膜上的正常菌 渊Roos 等袁2005冤遥 乳酸菌是重要的水产动物益生菌袁饲料经乳酸菌的发酵和代谢作用袁可提高营养价值袁降低抗营养因子和 pH袁并能抑制腐败菌及病原菌渊姚志芳等袁2020冤遥 本研究发酵饲料中蕴含高丰度高活性且种类多样的乳酸菌袁 可有效促进其在对虾养殖中的多重功效遥芽孢杆菌因其具有孢子抗逆性强袁 便于生产和保存袁易于复活袁又能分泌多种胞外水解酶类和代谢活性物质等特点袁 是最广泛使用的水产益生菌之一袁在提高水产动物营养消化尧免疫抗病和改善养殖水质上都能发挥积极作用袁 在提高发酵饲料品质中也具有重要作用遥 本研究芽孢杆菌在发酵饲料菌群测序中的丰度虽然极低袁 但 NB 平板计数含量则有 5伊106cfu/g袁 并主要由副地衣芽孢杆菌组成袁 贝莱斯芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌也占一定比例遥 Makled 等渊2016冤研究发现袁副地衣芽孢杆菌作为益生菌补充在饲料中可显著促进尼罗罗非鱼渊Oreochromis niloticus冤的生长尧消化和免疫遥副地衣芽孢杆菌可分泌高活性的胞外蛋白酶尧脂肪酶以及淀粉酶尧果胶酶尧葡聚糖酶和纤维素酶等碳水化合物水解酶袁基因组中富含纤维素酶尧半纤维素酶和淀粉酶基因袁 不仅可促进饲料发酵中对植物多糖的降解袁也可帮助宿主消化食物成分袁提高饲料尤其是植物性饲料的利用率 渊赵帝等袁2020冤遥近年来贝莱斯芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌对包括对虾在内的水产动物益生作用陆续有报道渊Chen 等袁2021曰洪居恳等袁2020冤遥 因此袁本研究发酵饲料中的芽孢杆菌对对虾都具有潜在的益生作用遥细菌菌群中还存在 3 个在分离培养中未检测到的优势属袁即假单胞菌属尧食肉蝇单胞菌属尧假棍状杆菌属袁 序列丰度分别完全或几乎全部由OTU2渊11.81%冤尧OTU3渊10.16%冤和 OTU4渊3.58冤构成渊图 1C 和表 2 冤遥 与 OTU2 序列最相似的是河流假单胞菌渊Pseudomonas fluvialis冤和药厂假单胞菌渊Pseudomonas pharmacofabricae冤袁但相似性都只有 97.63%袁OTU2 很可能是假单胞菌属其他未知种遥假单胞菌属细菌对对虾一般无致病性袁有些种类还可作为水产动物益生菌 渊Wang 等袁2019冤遥OTU3 序列与解几丁质食肉蝇单胞菌模式菌株序列最相似渊99.21%冤袁该菌可产蛋白酶尧淀粉酶尧明胶酶袁 并具有较强的几丁质酶活性 渊T佼th 等袁2008冤遥食肉蝇单胞菌属细菌可能是临床罕见的兼性致病菌袁 但在自然发酵蔬菜和蚕豆酱中也正常存在渊Liu 等袁2020曰Li 等袁2016冤袁其对水产动物的影响目前鲜见报道遥 因此食肉蝇单胞菌可能是自然发酵饲料中的正常菌群袁 今后需要进一步评估其对水产动物健康的影响及潜在的安全风险遥OTU4 序列与污泥假棍状杆菌模式菌株 100%相似袁对水产动物的影响目前尚不清楚遥3.3发酵饲料优势真菌组成及其潜在功能本研究发酵饲料真菌菌群的多样性明显低于细菌袁优势种群也只有几种酵母菌属构成遥 酵母菌是单细胞的真核微生物袁富含蛋白质尧维生素尧生长因子等多种营养物质袁 细胞壁含有甘露聚糖和葡聚糖等免疫多糖袁 有些酵母菌还能产生虾青素和类胡萝卜素等活性物质袁 因此在水产动物饲料添加剂和益生菌中广泛使用遥 酵母菌在发酵饲料中也具有重要作用袁 可通过自身繁殖增加饲料原料中的营养物质含量袁 并通过一系列酶解反应将饲料原料中大分子物质降解为可直接吸收利用的小分子营养物质袁 进而提高饲料利用率渊姚志芳等袁2008冤遥 酵母菌在发酵中产生的酒香味袁可增加饲料风味和动物采食量曰产生的乳酸尧乙酸尧丙酸可降低饲料 pH袁抑制有害菌的生长渊姚志芳等袁2008冤遥库德毕赤酵母是本研究唯一分离培养的真菌袁菌群测序中占绝对优势的真菌也是该种酵母遥毕赤酵母安全性高袁 包括库德毕赤酵母在内的一些种可作为人用益生菌渊Shruthi 等袁2002冤遥 近年来袁 库德毕赤酵母作为发酵饲料菌种也常有报道渊Su 等袁2021曰Mandal 等袁2013冤遥 丝孢酵母科/属为本研究第 2 优势真菌科/属袁丰度几乎完全由真菌OTU2 贡献遥 OTU2 序列分类上属于阿萨希丝孢酵母遥 丝孢酵母是一类普遍存在于土壤尧水体尧动物和植物等自然生境中袁 也是人体的正常菌群渊Li12中国饲料2023 年第 17 期等袁2020冤遥 阿萨希丝孢酵母蛋白酶活性强袁 耐受pH 范围广袁是一些食品或酿酒发酵中的常见种甚至优势种并在其中发挥积极作用 渊Pu 等袁2021曰Wen 等袁2021冤袁但该酵母对免疫功能低下人群则可能是一种条件致病菌袁 尽管临床上仅有稀少报道渊Li 等袁2020冤袁因此在发酵饲料生产和应用中需要注意该菌可能引起的潜在风险遥4结论本研究结合分离培养和高通量测序揭示了一种对虾养殖用自然发酵饲料中富含乳酸菌尧 芽孢杆菌和毕赤酵母等有益活菌袁 其中乳酸菌含量最高袁种群最丰富袁并以乳杆菌属和黏液乳杆菌属为主曰 芽孢杆菌和酵母菌分别以副地衣芽孢杆菌和库德毕赤酵母占绝对优势遥 同时该自然发酵饲料中也存在食肉蝇单胞菌属尧 假棍状杆菌属和丝孢酵母属等对水产动物功能尚不确定的菌属遥 这一研究结果为水产自然发酵饲料及其有益菌种资源挖掘提供了参考依据遥参考文献1 陈影袁卢宗梅袁张琳袁等.发酵饲料分析检测技术J.当代化工袁2019袁48渊9冤院2060 2063.2 董胜奇袁王格袁张涛袁等.基于高通量测序分析豆粕发酵过程中真菌群落的组成和变化J.华中农业大学学报袁2019袁38渊5冤院92 97.3 韩雪袁郑艳铭袁李研东袁等.天然发酵青贮饲料中优势菌株的分离与鉴定J.中国饲料袁2013袁13院40 41+44.4 洪居恳袁薛明袁宁为民袁等.4 种微生物制剂对凡纳滨对虾育苗水质及仔虾存活的影响J.水产科学袁2020袁39渊3冤院316 323.5 黄甜袁张秀红袁尤雅袁等.生物发酵饲料常规和微生物指标及其检测方法J.湖北农业科学袁2021袁60渊S1冤院291 292袁300.6 姜燕.刺参渊Apostichopus japonicus冤发酵饲料的制作工艺与应用效果研究院博士学位论文D.青岛院中国海洋大学袁2014.7 李爱科袁王薇薇袁王永伟袁等.生物饲料及其替代和减少抗生素使用技术研究进展J.动物营养学报袁2020袁32渊10冤院4793 4806.8 李明袁饶正华袁梁洛源袁等.基于宏基因测序的微生物饲料添加剂菌群结构及质量分析J.中国饲料袁2022,21院23 27.9 孟阳.发酵饲料对凡纳滨对虾的作用效果与机理研究院硕士学位论文D.天津院天津科技大学袁2019.10 宁为民袁温崇庆袁黄雪敏袁等.胶红酵母分离鉴定及其对凡纳滨对虾幼体存活和变态的影响J.水产科学袁2021袁40渊1冤院37 45.11 沈萍袁陈向东.微生物学实验渊第四版冤M.北京院高等教育出版社袁2007院243.12 史悦袁玉柱袁许庆方.食淀粉乳杆菌的应用研究进展J.草学袁2020袁6院1 6.13 王格袁董胜奇袁张涛袁等.基于高通量测序分析豆粕发酵过程中细菌群落结构及多样性J.华中农业大学学报袁2018袁37渊5冤院89 94.14 温崇庆袁何瑶瑶袁薛明袁等.高通量测序分析 DNA 提取引起的对虾肠道菌群结构偏差J.微生物学报袁2016袁56渊1冤院130 142.15 吴业阳袁孙瑞健袁米海峰袁等.生物发酵饲料现状及在水产养殖上应用J.中国饲料袁2018袁13院60 63.16 姚志芳袁冯宇哲袁王磊袁等.酵母菌和乳酸菌在生物发酵饲料中的应用研究进展J.饲料研究袁2020袁43渊10冤院154 158.17 于梦楠袁陈玉珂袁张宇柔袁等.微生物发酵饲料在水产养殖中的应用J.中国饲料袁2021袁2院70 73.18 袁春营袁孟阳袁毕建才袁等.发酵饲料对南美白对虾消化酶活性与肠道菌群的影响J.饲料工业袁2018袁39渊24冤院24 28.19 赵帝袁吴山功袁丰文雯.副地衣芽孢杆菌 FA6 全基因组测序及比较基因组学分析J.水生生物学报袁2020袁44渊2冤院261 267.20 Chen L袁Lv C袁Li B袁et al.Effects of Bacillus velezensis supple鄄mentation on the growth performance袁immune responses袁and intes鄄tine microbiota of Litopenaeus vannamei J.Frontiers in Marine Sci鄄ence袁2021袁8院744281.21 Makled S O袁 Hamdan A M袁El-Sayed A F M.Effects of dietarysupplementation of a marine thermotolerant bacterium袁Bacillus par鄄alicheniformis SO1袁on growth performance and immune respons鄄es of Nile tilapia袁Oreochromis niloticus J.Aquaculture Nutrition.2019袁25渊4冤院1 11.22 Mandal S袁Ghosh K.Optimization of tannase production andimprovement of nutritional quality of two potential low-priced plantfeedstuffs under solid state fermentation by Pichia kudriavzevii isolat鄄ed from fish gutJ.Food Biotechnology袁2013袁27渊1冤院86 103.23 Li H袁Guo M袁Wang C袁et al.Epidemiological study of Tri鄄chosporon asahii infections over the past 23 years J.Epidemiologyand Infection袁2020袁148院e169.24 Li X袁Yue X.Analysis of the microbiota in naturally fermentedcabbage of northeastern part of China by high-throughput sequenc鄄ing of the V3-V4 regions of the 16S rRNA geneJ.International?Journal of Agriculture&Biology袁2016袁18院1153 1158.25 Liu P袁Xiang Q袁Sun W袁et al.Correlation between microbialcommunities and key flavors during post-fermentation of Pixianbroad bean pasteJ.Food Research International袁2020袁137院109513.26 Pu S袁Zhang Y袁Lu N袁et al.Yeasts from Chinese strong flavourDaqu samples院isolation and evaluation of their potential for fortifiedDaqu productionJ.AMB Express袁2021袁11渊1冤院176.27 Roos S袁Engstrand L袁Jonsson H.Lactobacillus gastricus sp.nov.袁Lactobacillus antri sp.nov.袁Lactobacillus kalixensis sp.nov.and Lac鄄tobacillus ultunensis sp.nov.袁isolated from human stomach mucosaJ.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiolo鄄gy袁2005袁55渊Pt 1冤院77 82.28 Shruthi B袁Deepa N袁Somashekaraiah R袁et al.Exploring biotech鄄nological and functional characteristics of probiotic yeasts院A review13中国饲料2023 年第 17 期Analysis of microbial composition in a naturally fermented feed basedon culture isolation and high-throughput sequencingLIANG Gu