生物化学-第3章 蛋白质化学.pdf

第三章蛋白质化学一、蛋白质的概念蛋白质是许多不同的a-氨基酸 按一定的序列通过肽键缩合而成的，具有较稳定的构象,并具有特定生物功能的生物大分子。二、蛋白质的化学组成（一）蛋白质的元素组成：C、H、0、N、微量的磷、铁、锌、铜、铝、碘等元素。其中氮的含量在各种蛋白质中平均为16%。每1g氮相当于6.25g的蛋白质，粗蛋白质=N%*6.25.氮的含量可用凯氏定氮法测定。其原理为：(1)消化：CH2COOH+3H2SO4(浓)-2CO2+3SO2+4H2O+NH3nh22NH3+H2so4一(NH4)2SO4(2)蒸播(NH4)2SO4+2NaOH Na2SO4=2H2O+2NH3T(3)吸收：NH3+4H3B O3(过量)-NH4HB 4O7+5H2O(4)标准盐酸滴定NH4HB4O7+HCI+5H2O NH4CI+4H3B O3 r 0三聚氟胺(c3h6n6)A AH?n/、N、N%重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精三聚氧胺的含氮量为6 6.6%oQ口(-j（二）蛋白质的化合物组成7简单蛋白质结合蛋白质f a 氨基酸简单蛋白质+辅基三、蛋白质的分子大小及分类1四、蛋白质的分布和生物学功能1.酶2.结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性 蛋白、膜蛋白）3.贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）4.物质运输（血红蛋白、Na+.K+.A TPase、电子传递体等）5.细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）6.激素功能（胰岛素）7.接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）8.调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组 蛋白、阻遏蛋白）9.（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白等）第二节氨基酸一、蛋白质的水解酸水解法蛋白质的水解及水解方法Y碱水解法酶法水解酸水解法：A、稀酸水解蛋白质，得到不完全水解产物。如：蛋白陈，牛肉膏。B、浓HCI(6 mol/L)、或4moi/L硫酸于的高温下,真空条件下1024小时可将蛋白质完全水解。优点：酸水解所得的氨基酸不消旋。缺点：(1)色氨酸完全破坏。(2)丝、苏、酪氨酸，半胱氨酸小部分遭破坏。(3)天冬酰胺和谷酰胺的酰胺基被水解下来，生成相应的氨 基酸和铁离子。两种酰胺的总量可直接由水解液中释放 出的氨量求出。应用：酸法水解应用广，常用于氨基酸分析中。7 Ol X)碱水解法:J，A、稀碱水解蛋白质，得到不完全水解产物。B、浓碱：常用5mol/L氢氧化钠或2mol/L氢氧化领于110。（3在真空或充氮条件下进行1020小时水解，得到完全水解产物。优点：不破坏色氨酸。缺点：多数氨基酸遭破坏。产生消旋现象。所得产物是D，LA A的 混合物。应用：常作为酸法水解的补充，测定蛋白质分子中 色氨酸的含量。J酶法水解:蛋白酶和蛋白质在适当温度、pH下保温，得到不完全水解产物。优点：条件温和，氨基酸不破坏，不消旋。（仍保持L一型。）缺点：水解速度慢；因酶有专一性，常需要多种酶配合使用。水解不彻底。应用：用于蛋白质的部分水解。一级结构分析。7基酸的结构和分类（一）常见氨基酸COOHh2n-C1H1、结构通式R非解离形式coo-R两性离子形式二J2、20种氨基酸在结构上的共同特点（1）除脯氨酸以外都是a氨基酸；脯是a.亚氨基酸。（2）除了甘氨酸均有手性碳，具有旋光性。（3）除甘氨酸外，蛋白质分子中的氨基酸都是L.氨基酸。（4）不同的小氨基酸其R基侧链不同，其余部分都相同。3yo种氨基酸的结构和分类(1)按R基的化学结构分类：脂肪族、芳香族和杂环族A、脂肪族氨基酸含一氨基一竣基的中性氨基酸o-H O-CICIIH-+N 3Hc oo-c oo-+1+1h3n-c-h h3n-c-hch3 ch/h3c ch3c oo-c oo+1+Ih3n-c-h h3n-c-h-1-1-CH2 h3c-c-hCH CH2/IH3c CH3 甘氨酸(Gly5G)丙氨酸 缴氨酸 亮氨酸 异亮氨酸，(A la,A)(Val5V)(Lue5L)(lle j)、J J 含羟基或硫的脂肪族氨基酸,o H o-CICor o-CIC.)H O-CICHH o T o-CICH-C-OH I ch3ch2SH丝氨酸(Ser.S)苏氨酸(Thr,T)半胱氨酸(Cys.C)甲硫氨酸(Met,M)酸性氨基酸(两较基一氨基)及酰胺:coo-coo+I+ICH2 ch2COOHCOOHCOO-COO+I+CH2 ch2C CH2q xnh2 q 0 NH2天冬氨酸 谷氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺(A sp,D)(Glu,E)(A sn,N)(Gln,Q)杂环碱性氨基酸:or 2-。一 Hi cIc Ic 十HN+N/N HH2c Ic I c I c I c I c I N+N组氨酸(His,H)精氨酸(A rg,R)赖氨酸(Lys5K)7苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（T yr,Y）色氨酸（T rg,W）C、杂环氨基酸COO+IH3N-C Hch2HC=C+/H N NH%组氨酸（H is,H）COOH2N C Hh2c ch2 xchLMF脯氨酸（Pro/P）（2）根据R基团的酸碱性质分：性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸。（3）按R基的极性分：A、非极性R基氨基酸八种：A la、Vai、Le u lie、Phe Trp、Me t Prob、不带电荷的极性R基氨基酸有七种：Se r、Thr Tyr含羟基；A sn、Gin含酰胺基；Cys 含筑基（-SH）；GlyC、生理条件下带有正电荷的三种碱性氨基酸：Lys、A rg Hisd、生理条件下带有负电荷的两种酸性氨基酸：A sp GluJ分类氨基酸名称三字符号单字 符号中文 简称R基化学结构等电点丙氨酸(al an in e)Al aA丙H，c CH N HrC00H6.02缴氨酸(valine)缴亮H3C CH CH-C00HNH2ch33H3C CHCH2 CH-COOH nh25.975.98非亮氨酸(leucine)氨基极异亮氨酸性(iso leucine)酸h3c ch2 lieI异亮-3 H H c cnh26.02苯丙氨酸(ph en yl al an in e)Ph eF苯丙O5.48-CH 2 CHNH2-COOH色氨酸(trypto ph an)Trpw色0|ch2 CH-COOH nh25.89H蛋氨酸（甲硫氨酸）（meth io n in e）MetM蛋（甲硫）卜hC-5.75-S CH2 CH:chnh2-cooh脯氨酸(pro l in e)ProP脯H2c-1H2c(1 CN，H：h2：H COOH630分类氨基酸名称三字 符号单字 符号中文 简称R基化学结构等电点不 9 电 荷性 a 基.甘氨酸(glycine)G lyG甘H CH-COOHnh2)5.97丝氨酸(serine)SerS丝H O CH 2一CH-COOH nh25.68苏氨酸(threonine)T hrT苏H 3c CH 1 OHCH-COOH nh26.53半胱氨酸(cysteine)CysC半胱H SCH2 CH-COOH nh25.02酪氨酸(tyrosine)T yrY酪HOH3-CH2-CH-COOH nh25.66天冬酰胺(asparagine)AsniN天酰0II _H2N-CCH2-CH-COOH叫5.41谷氨酰胺(glutamine)G inQ谷酰0II _H2N C CH2-CH 2 p-COOH N H z5.65带正电荷极性氨基酸组氨酸(histidine)赖氨酸(lysine)精氨酸(arginine)R组赖HCHI NZCHI N+H7.5974%极性氨基酸 带负电荷天冬氨酸(aspartic acid)谷氨酸(glutamic acid)E精W世-2）NHCH-COOH nh210.76天冬-OOC-CH2-CH-COOH nh22.97省ooc-ch2-ch2-CH-COOHNH2 一3.22二十考儿命质AdkA-畲类据R基团极性分类据R基团化 学结构分类非极性R基团氨基酸（8种）不带电荷（7种）极性R基团氨基酸脂肪族氨基酸带电荷芳香族氨基酸（Phe、T yr、T rp）杂环氨基酸（H is、Pro T rp）带正电荷（3种）带负电荷（2种）据营养学 分类据氨基、竣基数分类必需氨基酸非必需氨基酸一氨基一竣基氨基酸人体必需氨基酸Lys Vai liept r r eh TMTe u n eArg、H is二氨基一竣基氨基酸（Lys、H is、Arg）一氨基二竣基氨基酸（G lu、Asp）KJ（二）蛋白质中的稀有氨基酸OH；H-巧C耳2H.,C5 2CH-COOH n/14羟基脯氨酸6 5 4,h2n-ch2-ch-ch2-ch.OH 5.羟基赖氨酸z ICH凡 1HOOC U/NHzCH(CH 心-VV-(CH2)t CHh/6%；Xc00H(CH 1 1CH/HaN COOH 缚%Jnnn 锁链素：由4个赖氨酸TUUH形成的衍生物。4.1)*CHlCHT00HHjNCHj-CHj-CHj-OOOH出基TRHAC-NH-CHlCElCHHJHCOOHos E NaCElCHlCHlC3HoOH Ir-三、氨基酸的理化性质（一）一般的物理性质1、晶体形状2、熔点3、味感4、溶解度5、旋光性6、紫外吸收性质7)（二氨基酸的两性解离及等电点1、氨基酸是两性化合物，在晶体或水溶液中以兼性 离子形式存在。-H Rif CN2HR j“+I COOH H3NCHCOO-广义的酸碱概念：HA 12.5时，氨基酸分子中所有可解离的基团全部去质子化，分子带负电荷。NH2R-CH-COO-(3)当环境pH处于1.7和12.5之间时，氨基酸的解离 状况和带电性质会随氨基酸种类不同发生很大变化。等电点：当氨基酸溶液在某一pH时，氨基酸分子所带正 负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极 也不向阴极移动，此时溶液的pH即为该氨基酸的等 电点（pl）。等电点时，氨基酸的溶解度最小小结引入等电点概念之后，A A的解离情况与环境PH的关系 可以描述为：A、当环境PH=PI时氨基酸以两性离子形式存在。B、当环境PHVPI时（相当于加入了H+）氨基酸带正电 荷，环境PH偏离等电点越远，氨基酸带正电荷越多；电泳时移向负极。C、当环境PHA PI时（相当于加入了OK）氨基酸带负电 荷，环境PH偏离等电点越远，氨基酸带负电荷越多；电泳时移向正极。3、等电点与氨基酸分子两性解离基团的解离平 衡常数的关系(1)中性氨基酸的解离一氨基一按基A A的 等电点计算：Pl=pKi+pK22(2)碱性氨基酸的解离二氨基一竣基A A的 等电点计算：2(3)酸性氨基酸的解离COOHI CH-NH；ch2COOHOH-H*COT I I CH-NH；卜 COOHAsp1K,coo-Oir I 2 CH-NH；H+|)CH2 iIco(rA即COO-Offch-nh2COO-pKi+pK2一氨基二竣基A A的 _等电点计算：2结论：氨基酸的Pl值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的 基团P。值之和的二分之一。例题:某氨基酸溶于pH7的水中，所得氨基酸溶液的pH为8,问此氨基 酸的pl是大于8、等于8还是小于8?解析：主要从氨基酸的解离特点考虑，先确定其两性离子状态（即等电点状态），然后分析氨基酸溶液变为8时是从水中吸 收了质子还是释放了质子。解答：氨基酸晶体主要以两性离子形式存在，溶于PH7的水中，溶液的pH从7升为8,说明氨基酸在溶解的过程中从水中吸收 了质子。溶液中有如下平衡：A A 土+H20.A A+0H-所以，要使A A+所带电荷为零，必须加碱，这会使pH8,故氨基酸的pl 8oy4、HA NDERSON-HA SSELB A LCH(汉哈二氏公式)质子受体pH二pK，+lg-质子供体应用：(1)已知各离子浓度，求溶液的pH值。(2)根据氨基酸解离基团的pK值，可计算出任何pH 条件下，各离子浓度的比例。例题1：计算赖氨酸的-NH3+20%被解离时 的溶液pH值。解：首先写出解离方程COOH&C00%C00-二 0七 .0M ICHNH3 CH-NH3 CHNHI 田 ir(ch2)4(ch2)4(ch2)4I I;I4NH3 4NH3Lys+Lys+Lys土根据：pK3=10.53 pH=pK+lg20%岛 OK i=z H4COO-I CH-NH2NH,Lys质子受体质子供体所以：pH=10.53+|g-7 0%=9.9例题2:计算A sp的B-COOH三分之二被解离时的溶液pH。解：写出解离方程COOHI CHNH；OH-H*COOHA sp十co(rI I ICHCH2 I COOHk2 coo-oir I g CH-NH；H4|CH2 I co(rA sp1&coo-3 IOHCHNH)H*|2CH.iCOO-A sp*质子受体pK2=3.86 根据：所以：pH=3.86+lgpH=pK+lg2/3-=4 21/3.质子供体5、氨基酸的PH缓冲作用当环境pH在接近氨 基酸的任一解离基 团的pKa附近时，氨基酸对外来的酸 碱（pH）具有缓 冲作用。将1 mol甘氨酸溶于 水，溶液的pH约等 于6,此时甘氨酸以 兼性离子形式存在。A:用标准盐酸滴定B:用标准NaOH滴定H2.34和pH9.6 0处，Gly具有缓冲能力。起点：100%Gly+净电荷：+1 第一拐点：50%Gly+,50%Gly 平均净电荷：+0.5pH=pK+lg Gly /Gly+=pKl=2.34第二拐点：100%Gly土净电荷：0等电点pl第三拐点：50%Gly，50%Gly-平均净电荷：05pH=pK2+lg Gly-/Gly =pK2=9.6终点:100%Gly-净电荷:-13)pHOH-（摩尔浓度）H2NCHOCHH 2一1 CICICICnnncH+吁粤H xc/HN+NHCOOHH H10pH 68420 1.6 2.0 3.0OH一（摩尔浓度）(b)例题1：下列氨基酸在生理pH范围内缓冲容量最大的 氨基酸是()(1)Gly(2)His(3)A sp(4)Trp例题2：Glu(pKi a-COOH 2.19,pK2 a-NH3+9.6 7,pKR R-COOH 4.25,pl 3.22)写出解离方程指出Glu-和Glu二各一半时的pH值指出Glu总是带正电荷的pH范围指出Glu土和Glir能作为缓冲液使用的pH范围解离方程:Glu-和Glu=各50%时pH为9.67pH H+Q+cooHCHO I_ _ ch2IN(CH2OH)2cooch2nh2cooI ch2Inhch2oh用标准NaOH滴定氨基酸甲醛滴定法：根据标准NaOH的消耗量计算出样 品溶液中a 氨基酸的浓度。应用：判断蛋白质水解或合成的进度7 vMH.JJ，4二硝基氟苯（DNFB）的反应R弱OH-02N/F r NO,H2NCH-COOHRO2NNH-CH COOH+HFNO,2,4.二硝基苯氨基酸，黄色（简写DNP.氨基酸，可用乙酸抽提）多肽或蛋白质N端氨基酸的a 氨基也能与DNFB 反应，生成DNP多肽或DNP蛋白质。具体的应用步骤简述如下：A、多肽链的ccN”与DNFB反应，生成DNP 多肽链。B、酸法完全水解产生各种氨基酸和黄色的DNP 氨基酸。C、利用DNP氨基酸在有机溶剂中的溶解度与其它氨基 酸不同，可以用乙醛把DNP氨基酸抽提出来。CL X)D、所得DNP-氨基酸经纸层析，从纸层析图谱上的黄色斑 点位置可鉴定N-端氨基酸的种类。I：NH-保护热 NH保护基这个反应使氨基酸的竣基活化合成多肽 口(3)脱竣酶催化的脱竣反应、J3、A-NR2和A-COOH共同参与的反应(1)、成肽反应R1 0 R2 Ri：0:R2I III-I-h2o.H2N-C-C-OH+HNcCOOH-邸丁 c-COOHI-|H H H H：H：H肽键肽及肽键的概念:二肽、三肽多肽。短肽的命名：如甘氨酰丙氨酸丙氨酰甘氨酸）与黄三酮的反应+HQ年三酮水合荀三酮+RCHCOOH水合苛三酮（无色）NH200/yV0还原性年三酮HOH脯氨酸和羟脯氨酸与黄三酮反应产生黄色物质，其余 所有的a-氨基酸与黄三酮反应均生蓝紫色物质。H,CCH,h、j&-cooh tT H4、个别R基团参与的反应7(1)筑基(-SH)的性质a氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或断裂oooc chch2 nh3+ooc chch2 nh3+SH 00CCH-CH2氧化 ih3+sr I还原 sSH 00Cch-ch2b过甲酸的作用下，-SH或二硫键被氧化成磺酸基 _C-SH易与碘乙酸反应形成稳定的烷基衍生物（2）个别R基团参与的颜色反应反应基团反应试剂及现象苯环（苯丙、色、酪）与浓硝酸黄色反应酚羟基（酪）吗I噪基（色）脏基（精）与福林酚蓝色反应 与重氮化合物橘黄色反应 与硝酸汞、硝酸红色反应 与乙醛酸及硫酸紫红色反应 碱性，与a蔡酚和次滨酸盐 红色反应四、氨基酸的分离、分析和鉴定 层析一也叫色层分析，又叫色谱 满足四个基本条件：1、水不溶性惰性支持物2、流动相（溶剂系统）3、固定相4、样品混合物的分配系数不同怅循才局则/b理居忻注吊力力:分配层析（基于溶解度不同）纸层析，薄层层析 离子交换层析（基于电荷性质不同）分子筛过滤层析（基于分子大小不同）亲和层析（基于亲和力不同）高效液相色谱（HPLC）:是一种快速、灵敏的分离生物分子的方法。与常规的 层析法相比，HPLC采用的介质颗粒细，表面积大，这样的 介质极大地提高了分辨率。但由于颗粒过细，又会增加流 动阻力，使洗脱速度减慢。因此需要对溶剂系统采用较高的压力，以有效增加洗脱速度。(一)分配层析-以纸层析为例介绍1、原理 溶质在流动相中的溶解度分配系数二-溶质在固定相中的溶解度2、操作步骤：辨滤纸纹方向铅笔划线作标记毛细管点样(0.2-0.3cm)卷筒，展层等计算：Rf=-Y31展层剂的种类中性展层剂：正丁醇+水（或苯酚+水）一用于单向层析 碱性展层剂：正丁醇：12%股4。氏95%乙醇=13：3：3 酸性展层剂：正丁醇：80%甲酸：水=15：3：2（后两种常用于双向层析-P88。）4、影响Rf值的因素：A、物质结构对Rf值的影响B、展液（流动相）pH对Rf的影响C、展层方式 D、滤纸对Rf的影响F、温度对Rf的影响 1 1 J(二)离子交换层析(1)离子交换柱层析的概念用离子交换剂作为水不溶性支持物兼固定相，装成层析柱,用不同pH和不同离子强度的缓冲液做流动相(洗脱液)构 成的柱层析技术。(2)离子交换剂及其种类离子交换树脂，离子交换纤维素，离子交换葡聚糖等。(3)强酸型阳离子交换树脂 常用于分离氨基酸混合物洗脱液PH2-3时上柱，用逐 步提高洗脱液的pH和/逐渐增加盐浓度的方混合AA样品法，依次洗脱下酸性 氨基酸，中性氨基酸,碱性氨基酸。RSO1,洗脱的先后顺序取决 于氨基酸的所带电荷与 离子交换树脂的静电吸 引和疏水相互作用两者 的综合作用的结果0利用阳离子交换树脂对谷氨酸稀溶液的回收浓缩1、交换上柱：谷氨酸稀溶液PH 3.2R-SOyH+G-NH+R=6OG-NH.+H+2、交换洗脱：R-SO-3 G-NH3+NA+-HSQ-3.NA+G-NH3+3、用过的树脂用酸处理再生：R-SO.NA+HCI-RSOo.H+NACIO 0o/7限珑 鞋戢弱林仪凝的嫣域合物分析勰JcooGin HPAsNIHHKQ7H 2on、CIC)2ho第三节肽一、肽的结构NIH OHC1、肽键和肽的概念 2、氨基酸顺序、氨基酸的顺信是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述 五肽可表示为：S e r-Va 1-Tyr-A sp-G 1 n（丝氨酰缴氨酰酪氨 酰天冬氨酰谷酰胺）3、肽链的两个末端、氨基酸残基、肽平面、肽键、二硫键4、肽链的形式：链状，环状，分支状。-J,工二、肽的理化性质三、生物活性肽的功能1.谷胱甘肽2.催产素和加压素3.脑肽2m第四节蛋白质分子的结构与功能一级结构：多肽链的氨基酸顺序。氨基酸借助于 肽键和二硫键连接成多肽链。二级结构：多肽链借助于氢键形成A-螺旋，B-片层等结构元件。三级结构：多肽链借助于非共价力折叠成特定走 向的球状实体。四级结构:具有三级结构的亚基借助于非共价力缔合成寡聚蛋白,a一、蛋白质分子的一级结构与功能（一）一级结构的涵义蛋白质一级结构又称共价结构，是指蛋 白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序，也称 化学结构。事实上，蛋白质一级结构研究还包括：肽链的数目、肽链末端氨基酸种类、二硫键 位置等。二）蛋白质一级结构的测定1、测定蛋白质分子中多肽链的数目2、拆分蛋白质分子中的多肽链 3、断裂链内二硫键4、分析多肽链的N末端和C末端5、测定多肽链的氨基酸组成 6、多肽链部分裂解成肽段 7、测定各个肽段的氨基酸顺序8、确定肽段在多肽链中的顺序 9、确定多肽链中二硫键的位置71、分离纯化蛋白质并测其分子量，确定A A残基数目氨基酸残基数目=蛋白质分子量1102、测定蛋白质中多肽链的数目3、拆分蛋白质分子的多肽链并将多肽链根据它们的大 小或/和电荷不同进行分离纯化变性剂：8moi/L的尿素或6 mol/L的盐酸服或SDS断开二硫键：0筑基乙醇+碘乙酸或过氧甲酸H O 八I IL N C C H CH2ch20I IIN C CB-茄基乙醇A8moi/L尿素或6 mol/L盐酸服SHHNoII C ch20I IIn C-*C I IH HHCH.COOJ过甲酸氧化法断开二硫键7 j半胱氨磺酸 衍生物4、断开链内二硫键5、分析每一多肽链的氨基酸组成（酸水解法）6、鉴定多肽链的N-端和C-端残基N-端采用-Sange r试剂Edman试剂 一氨肽酶法p硼氢化锂法O端采用.脱解法一竣肽酶法（常用）/1竣肽酶A能释放除了Pro、A rg Lys之外的所 有C-末端残基；竣肽酶B只水解以A rg、Lys为C-末 端残基的肽键；两者混合能释放除了 Pro之外的任 一C-末端残基。竣肽酶A、B均不作用于C-末端第 二位为Pro的C-末端的残基的肽键。-A A-A A-Lys-A A-A A-A rg 较肽酶A不作用-A A-A A-Pro_A A_A A_Ly s、-A A-A A-A rg.-A A-A A-A A-pro 一A A-A A-pro-A A竣肽酶B只作用竣肽酶A、B均不作用J7、裂解多肽链成较小片断常用的裂解多肽链的方法:酶法断裂r胰蛋白酶：断裂赖氨酸或精氨酸残基的竣基参 与形成的肽键胰凝乳蛋白酶：它断裂三种苯环氨基酸的竣基 参与形成的肽键胃蛋白酶:适pH=2,断裂位点多;确定二硫键位置时常用它（因为二硫键在酸性条件下稳定）O O OH|H|H|-N C C NCCN C C H|H(H|澳化鼠（CNB r）:断裂由甲硫氨酸竣基参与形学裂解法成的肽键羟胺（NH2OH）断裂：pH=9时能专一断裂A sn-Gly之间的肽键A sn-Gly在蛋白质中出现的频率很低，对分子质量大的蛋 白质序列测定十分有用。8、测定各肽段氨基酸顺序：目前常用Edman降解法或氨基酸自动分析仪9、重建完整多肽链的一级结构7J例题：N.末端残基H,C末端残基S第一套肽段：QGS PS E2VE RLA HQWT 第二套肽段：SEQ WTQG VERL A PS HQ 推断：末端残基：H S第一套肽段：HQWTQGSEQVERLAPS 第二套肽段：HQWTQGSEQVERLA PS一级结构全序列为：HQWTQGSEQVERLA PSy确定原多肽链中二硫键的位置对于含有二硫键的蛋白质，利用上述方法测定完多肽链 氨基酸顺序后，需要确定链内和链间二硫键的位置，常用方 法是对角线电泳法。第一向电泳：将酶解后的混合液点到滤纸中央，pH6.5的条件 下进行第一向电泳。肽段按其大小及电荷不同分开。然后，把滤纸暴露在过甲酸蒸汽中，使一S-S-断开第二向电泳：滤纸旋转90。角，在与第一向完全相同条件下进行第二向电泳。含磺酸基的肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们偏离了对角线。肽斑用苛三酮显色。-对角线电泳图解胃蛋白酶水解含二硫键的蛋白质I混和肽段点到滤纸中央 第I r向pH6.5第一向电泳第一向滤纸暴露于过甲酸蒸气中,使二硫键断裂pH6.5第二向电泳（注：两个方向的电泳条件完全相同）7（,工 j）一级结构举例：牛胰岛素、牛胰核糖核酸酶、细胞色素C、血红蛋白等 目前，已有10万种以上的蛋白质完成了一级结构的测定。HGl y-Il e-Val-Gl u-Gl n-Cys-Cys-Al a-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gl n-Leu-Gl u-Asn-Tyr-Cys-Asn OH1 5 6 7 15 20 21 S SB链 f fHPh e-Val-Asn-Gl n-His-Leu-Cys-Gl y-Ser-His-Leu-Val-Gl u-Al a-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gl y1 5 7 10 15 19 20Gl u-Arg-Gl y-Ph e-Ph e-Tyr-Th r-Pro-Lys-Al aOH21 25 30牛胰岛素的化学结构7J（三人 级结构与功能的关系蛋白质的天然构象即空间结构是由氨基酸排列顺序决定的（1）核糖核酸酶的变性与复性：An fin sen通过核糖核酸酶的研究证明：蛋白质的 氨基酸序列决定其蛋白质的三维结构，蛋白质的三维结构又决定蛋白质的功能。核糖 核酸酶的功能是水解核糖核酸，它是由124个氨基酸残基组成的一条肽链，含有四对 二硫键，使得核糖核酸酶折叠成一个球状分子。如果将天然核糖核酸酶在8mo i/L的胭 中用3-疏基乙醇处理，则分子内的四对二硫键即被破裂，球状分子变为一条松散的多 肽链，同时酶活性完全丧失。但当用透析法除去还原剂和变性剂后，此酶经氧化又可 自发地折叠成原有的天然构象，酶活性又可以恢复（见图）1.一级结构的变异与分子病正常红 细胞镰刀形 红细胞生理条件下电荷：Glu-Val 亲水疏水 正常红细胞与镰刀形红细胞 的扫描电镜图链N端氨基酸排列顺序12345678Hb-A（正常人）VaLHis-Leu-Thr-Pro-Glu-Ghi-Lys.Hb-S（患 者）VaLHis-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys.7 3 1、丁）2、7级结构与生物进化同源蛋白质：J在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。r序列同源性：同源蛋白质氨基酸顺序的相似性 特点不变残基：构成或维持活性中心的空间构象I可变残基：残基差异的数目反映出物种在系统进化中的关系远近。例如：细胞色素C在所有的生物中都是电子传递链的组分P95表3-8：J不同生物CYTC与人CYTC氨基酸残基的差异数 7生物种类氨基酸差异数生物种类氨基酸差异数黑猩猩0响尾蛇14猴子1海龟15兔子1金枪鱼21猪、牛、羊10小麦35狗11酵母44驴11马12鸡13亲缘关系越接近，其氨基酸组成的差异越小,亲缘关系越远，氨基酸组成簪异越大。7例如：牛胰岛素分子的激活(1)前胰岛素原：核糖体上合成，含信号肽(疏水性氨基酸多)，信号 肽引导新生肽链进入内质网腔。(2)胰岛素原：在内质网腔，信号肽被信号肽酶切除成为胰岛素原。(3)活性胰岛素：高尔基体，切除C肽，成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体。7二、蛋白质的空间结构:一）维系蛋白质分子构象（三维结构）的化学键1、氢键：是稳定蛋白质二级结构的主要作用力。定向效应：极性基团间2、范德华力J诱导效应：极性与非极性基团间 I分散效应：非极性基团间3、疏水相互作用：4、盐键（离子键）：是正电荷与负电荷之间的一种静电 相互作用5、配位键6、二硫键：八），-j/多肽链维持蛋白质分子构象的作用力a.盐键 b.氢键 c.疏水相互作用&范得华力e.二硫键蛋白质中存在的几种键能大小键氢键范德华力疏水作用盐键二硫键键能(KJ/MOL)13304812201230210蛋白质分子的二级结构1.多肽主链折叠的空间限制因素(1)a-碳原子的二面角(6和4)(2)酰胺平面(肽平面)二面角：两相邻酰胺平面之间，能以共同的C。为定点 而旋转，绕Cq-N键旋转的角度称。角，绕C-Ca键旋转的角度称力角。和中称作二面角，亦称构象角。谈基氧带部分负电，酰胺氮带部分正电，形成一、+/Ca 偶极。实际上所有蛋白的肽键以反式构象存在；-N|外在图6-8b中被注释了。酰胺平面（肽平面）：图6-2 肽平面。（a）由于共振和不可旋转，每个肽键都有部 分双键的性质。（b）3个键分开了多肽链中连续的N-Ca键和 caC键可分别以键角0和“旋转。cN键不能自由旋转。骨架中的其他单键能阻碍旋转，视R基团的大小和带电性而 定。（c）按惯例，当两个肽键侧面相接，。碳在同一平面，位置如图所示一汝日才力和“宜为在蛋白质中，这种构象是不存 在的，因为。较基的氧原子和a氨基的氢原子立体重叠了。为 了显示原子间的连接，图中小球所代表的每个原子要比范德一工二级结构的涵义及基本类型9蛋白质的二级结构：指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元.主要有以下类型:1、a 一螺旋(a he lix)2、0折叠(p-ple ate d she e t)3、0一转角(p-turn)4、无规则卷曲(nonre gular coil)一(1)a螺旋-蛋白质分子中最常见最稳定的一 种二级结构构象，它是多肽链主链环 绕一个中心轴有规律的盘旋前进形成 的螺旋形构象，由于最初发现与0(-角 蛋白中，故称a螺旋。天然蛋白质中主要是右手螺旋。右手螺旋c较基末端)典型右手A螺旋的结构特征A、主链环绕中心轴（虚设的）按右手螺旋方向盘旋，每隔 3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈。C=0与前面第四个氨基酸残基的N-H形成氢键，由氢键封闭 的环是13元环。）肽链上所有的肽键都参与链内氢键的形成。C、螺旋体中所有氨基酸残基R侧链都伸向外侧。D、典型的右手Q_螺旋可表示为3.613?.一；T-c4nhCqHc“n-影响A-螺旋形成及稳定的因素A、R基团的电荷性质多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基,不 能形成稳定的a-螺旋。如多聚Lys、多聚Glu在生理pH7 时不能形成a螺旋。B、R基团的大小R基大，特别是碳原子上具有分支（如Vai、He、Thr）不易形成a-螺旋；R基较小，且不带电荷的氨基酸利于a-螺旋的形成。如多 聚丙氨酸在PH7的水溶液中自发卷曲成a-螺旋。C、脯氨酸中止a-螺旋。卷发是一项生物化学工程1、头发（a-螺旋）卷曲成型2、涂还原剂，加热：还原二硫键形成游离的筑基，湿热 气体使氢键断开，引起多肽链的a-螺旋 结构解旋。图3-64角蛋白分子间的二硫键3、20分钟后洗掉还原剂，二硫键重新形成，但这些半 胱氨酸对与处理前不同。4、涂加氧化剂：稳定新形成的二硫键5、拆开发卷，洗涤、冷却头发：多肽链回复a-螺旋构象。新形成的二硫键造成头发纤维的扭曲和变形。7、T J(2)B-折叠片(蚕的丝心蛋白)涵义：由两条或两条以上的肽段充分伸展并侧向聚集，按肽链 长轴方向平行排列在一起，相邻肽链的埃基和亚氨基之间形成氢 键的一种折叠式片层结构。种类及结构特点：平行式、反平行式稳定结构的化学键：链间氢键J 1(3)B-转角(U型回折其特征为:由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。主链骨架以180返回折叠。第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H 生成氢键，二面角取值恒定。口 这类结构主要存在于球状蛋白分子表面。甘氨酸、脯 氨酸、天冬酰胺、丝氨酸等啰出现在小转角序列中。（4）无规卷曲泛指那些不能被归入明确的二级结构（折叠片或螺旋）7的多肽区段一是明确而稳定的二级结构无规则卷曲2.纤维状蛋白质(1)a角蛋白(2)丝心蛋白(3)胶原蛋白(4)弹性蛋白7（三）二级结构和三级结构层次的过渡态构象（超二级结构和结构城）1.超二级结构（1）超二级结构涵义在蛋白质分子中特别是在球状蛋白质分子中，由两个以上二级结构单元（主要是a 螺旋和B折叠片）相互聚集形成的有规则的 二级结构的组合体。在多种蛋白质中充当三 级结构的构件。3(2)超二级结构的主要类型：aa pap ppp2.结构域多肽在二级结构或超二级结构的基础上形成三级 结构的局部折叠区，是相对独立的紧密球状实体。是球状蛋白质的独立折叠单位。单结构域：较小的蛋白质 或亚基往往是单个结构域 的，等同于三级结构。多结构域：大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的 球状构象，彼此以松散的肽链相连，形成所谓的“校链”区，使结构域之间可以发生相对移动，有利于蛋白质的，活性中心结合底物，发生变构效应等。（四）球状蛋白质与三级结构1、三级结构的涵义在一级和二级结构的基础上，再进行三维多向性盘曲形 成近似球状的构象称为蛋白质的三级结构。涉及主链和侧 链所有原子和原子团的空间排布关系，但不讨论亚基间和 分子间的排布。2、球状蛋白质三维结构的特征（1）球状构象（2）亲水表面疏水核（3）次级键稳定结构（4）表面的疏水性凹穴3三级结构构象举例肌红蛋白：单结构域蛋白质，由一条肽链和一分子血红素构成。由8段长短不等的直 的a螺旋组成，分子中几乎80%的 A A残基处于a螺旋 内；8段螺旋分别命名为 A、B、CHo 拐弯处是由18个 氨基酸组成的松散 肽段（无规卷曲）。（辅如二c oo/H2Cch2H/原口卜咻与Fe 2+构成 的化合物；Fe 2+可形成6个配位键，其中4个与口卜咻环中4个 口比咯环的N原子结合，一个键与肌红蛋白的F8(93)位上的His的咪 哇基结合，空一个配位 键与分子氧发生可逆的 结合。OOCch2ch2CH2JDistal hrstidineFIGURE 5.27The Oxygen-Binding Site of Heme Created by a Folded Globin Chain.From H R Htxton.et il.r finnapkt&Bocherrnwy O 1992,p 43Z%4 27,RepnMed by pcrmtwon of PrmHM.Im.Upper Sddk R/vir.M蛋白质分子的四级结构四级结构的涵义由多条肽链组成的蛋白质分子中,每一条肽链都独立形成三级结构,这样的三级结构单位再相互缔合,从而构成蛋白质的四级结构。(1)寡聚蛋白(2)亚基与肽链(3)亚基与单体蛋白(4)稳定四级结构的作用力疏水相互作用，范得华也氢键和离子键等。ill红蛋白分子的结构和功能（1）结构：Hb的亚基与 肌红蛋白相似（2）血红蛋白的变构效应与氧合曲线变构效应（别构效应）：变构蛋白:工作肌肉毛细血管中氧饱和分数(Y)红蛋白（Mb）与血红蛋白（Hb）氧结合曲线比较第五节 蛋白质的重要理化性质 蛋白质的胶体性质蛋白质的两性解离和等电点 蛋白质的变性作用 蛋白质的沉淀作用 蛋白质的颜色反应 蛋白质的紫外吸收性质J/一、蛋白质的胶体性质真溶液：分子颗粒直径V1nm胶体溶液：分子颗粒直径1nm100nm悬浊液：分子颗粒直径100nm1、蛋白质是一种亲水胶体(hydrophilic colloid)2、蛋白质亲水胶体稳定的因素J(1)水化膜：每克蛋白质能结合0.30.5克水(2)双电层：二、蛋白质的两性解离和等电点1、两性解离 UJ 蛋白质是两性电解质。可解离基团主要来自侧链上的功能团。还有少数的末端a-竣基和a-氨基。2、等电点和等离子点3、根据蛋白质的电荷不同对其纯化的方法(1)等电沉淀(2)蛋白电泳：如，血清蛋白醋酸纤维膜电泳(3)离子交换层析：如DEA E纤维素(阴离子交换剂)，分离 胃蛋白酶(pl=1.0)，胰岛素(pl=5.3),卵清蛋白(pl=4.6),细胞色素(pl=10.7)的混合物，初始pH6.0三、蛋白质的变性作用1、变性作用的概念2、变性因素及其作用机理(1)物理因素：热，紫外线，超声波，剧烈搅拌、研磨等(2)化学因素：服、M：主要破坏疏水相互作用。酸、碱：改变带电状况，破坏盐键、氢键。有机溶剂：影响疏水作用，氢键和静电引力。重金属：与蛋白质的酸性基团结合，破坏盐键、氢键7 J3、变性蛋白质的性质(1)理化性质的改变(2)生化性质的改变(3)生物活性丧失4、蛋白质变性作用的意义(1)理论意义：分子