血管内皮细胞培养.doc

(完整word)血管内皮细胞培养血管内皮细胞（endothelial cell， EC)体外培养1概述 血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心,血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0。11m，长约2550m，宽约1015m，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合,细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体(内含有与凝血有关的第因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外,还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长,改变脂质代谢，维持血管壁的完整性,调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈“鹅卵石样镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。2培养方法 EC生长在血管内表面,由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属(人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等)的EC能在体外培养成功.人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层,可促进EC的粘附与生长.2。1 方法原理 用酶消化法,酶消化机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层.2。2 介绍几种主要EC的分离2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离2。2.1。1 人脐带动、静脉（或其它大血管）a 在37水浴中,预热培养用的所有无菌溶液，备用。b在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 g/ml链霉素的DHanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入DHanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹.c注入0。1胶原酶(1型）溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后,用注射器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈,放入37无菌的D-Hanks液中,消化15min后取出。d收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液(pH 7。2）冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心710min。e去上清液,加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用.f其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离,然后用线结扎血管各分支，再依上述步骤分离EC。2。2.2 酶消化法小血管内皮细胞的分离 2。2。2。1 兔主动脉，大鼠主动脉 因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。 a将动物主动脉取出后放DHanks中，将血管外的脂肪细组织分离干净,用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转,使内膜翻在外面。将另一端折入腔内0。5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。 b用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0。1%胶原酶溶液的小瓶内，盖上瓶盖在37水浴中轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化1520min后，见酶液稍有混浊,即加入等量的含20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。 c收集消化后的酶溶液以1500r/min离心5min，弃上清，用20小牛血清M199培养液重新悬浮细胞。 2。2.3 酶消化机械刮脱法猪主动脉EC的分离 a麻醉状态下，在颈部切口,分离并剪断颈动脉，放血处死。在无菌条件下，作胸腹联合切口,迅速打开胸腔，分离并取出胸主动脉和腹主动脉，置含D-Hanks液的培养皿中，尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织，然后用DHanks液多次冲洗血管外表及血管管腔内的凝血，再放入新装有DHanks的溶液中。 b纵何剪开血管，反复冲洗干净血管内壁后，在另一无菌大培皿中，滴加薄薄一层0.125胰蛋白酶和0.01 EDTA的混合消化液，将主动脉内膜面朝下铺在酶混合液之上。在37条件下，让内膜与酶溶液充分接触并消化1020min，再加入含少量20小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。 c把上述主动脉移至另一无菌培养皿，用小手术刀轻轻将内皮刮下.先顺向有次序地刮内膜12次，然后再横向刮12次，用M199液将内皮细胞收集到离心管中，以1000r/min离心710min，去上清,用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞备用. 2。2.4 机械刮脱法血管内皮细胞的分离取长度为20cm的大血管,用D-Hanks液将血管内、外冲洗干净后，无菌条件下沿纵轴剪开，使血管内皮朝上向外暴露，再用D-Hanks液冲洗2次，然后用刮刀轻轻刮取内膜表面的内皮细胞，刮取时,动作应轻柔均匀,刮刀与表面的角度约为60，每处只能刮1次,不可刮血管的边缘，刮下的细胞悬浮于M199液中,以1000r/min离心710min，去上清，再重复洗涤1次，重新悬浮于20小牛血清M199培养液中备用。2。2。5 还有微血管内皮细胞的分离及干贴法分离EC等,但较少用.2.3 EC原代培养及传代培养2。3.1 原代培养 将分离好备用的EC用含100 U/ml青霉素和100g/ml链霉素以及20%小牛血清的M199培养液（M199完全培养液）调整细胞浓度为1.52.0105/ml，接种到以0。1纤连蛋白或1明胶包被已干燥的平皿或培养瓶中.放37、5 CO2和饱和湿度的孵育箱中培养。24h后弃去培养液，用D-Hanks液淋洗1次,以去除未贴壁或死亡的细胞，换入等量的M199完全培养液，继续孵育箱中培养。每23d换M199完全培养液1次,换液时将原培养液弃掉1/22/3，然后加入新鲜的M199完全培养液至原来的量，67d后细胞可融合成单层内皮细胞,即可传代。2.3。2 传代培养2.3.2。1 待原代培养细胞长至融合状态后，弃培养液，用预温的DHanks液淋洗2次，加入终浓度0.125%胰蛋白酶、0。01% EDTA混合消化液，正好形成一浅层液面将细胞复盖，室温下（2025）消化12min。2。3.2。2 镜下见细胞稍收缩变圆，细胞间隙增宽后,立即翻转培养瓶，弃酶液。可再用D-Hanks液轻洗1次或直接加入新鲜M199完全培养液后，用吸水管（滴管）将细胞轻轻吹打下来，按12或13的比例传代.2.3。2。3 每隔23d换液1次，每次换掉2/3量,待细胞长至融合状态后，再次传代。2.4 观察结果用酶消化进行的原代培养，从动脉内膜上消化收集下来的内皮细胞，30min后即开始贴壁，呈扁平短梭形或多角形分散生长；46h后大部分细胞已贴壁，并开始生长,分裂，24h后形成数量不等的细胞群,约67d融合成片。传代培养的EC，10min后贴壁，57d融合成单层。2。5 内皮细胞的鉴定2.5.1 光镜检查 在倒置相差显微镜下可观察到活细胞呈扁平的短梭形或多角形,大小均匀，胞核清晰，呈卵圆形。有核的区域较无核的区域突出,细胞呈单层“鹅卵石样”或“铺路石样镶嵌排列。2.5.2 透射电镜检查 经切片技术处理后可观察到具有特征性的细胞器(webelpalade,WP小体）,但兔及猪的EC无W-P小体。2。5.3 第因子相关抗原免疫荧光检测 EC用PBS冲洗干净，放入乙醇和丙酮(11）溶液中固定10min,空气晾干，加入第因子相关抗原抗血清（兔抗人因子相关抗原抗血清）,37孵育60min.用PBS冲洗干净，晾干后加第一动物IgG荧光抗体（羊抗兔IgG荧光抗体），37孵育30min。PBS冲洗干净，晾干，最后用缓冲甘油封片，在荧光显微镜下观察到EC的胞浆内呈显较强的黄绿色荧光，是鉴定体外培养EC最可靠的标志.因第因子只存在于内皮细胞、巨核细胞和血小板中,其它细胞无第因子，但培养的猪主动脉内皮细胞也无此因子。2.6 注意事项2。6.1 接种材料的制备 血管取材的离体时间不宜过长，一般不超过6h,万一不能当时培养，则应放置4下保存(但不应超过24h)，血管内、外表面的血迹必须充分洗净，以免残留的RBC及血液中某些因子影响EC的贴壁或生长。2.6.2 酶消化液浓度的选择 0.1%(型）胶原酶溶液,0.25%胰蛋白酶溶液，0。25胰蛋白酶0。02 EDTA混合消化液，0。125%胰蛋白酶0.01% EDTA混合消化液（常用于传代），根据实验情况选定。掌握好酶液的消化时间是内皮细胞存活的关键（原代培养）。2.6。3 杂细胞的排除 细胞传代时，加入酶消化液之后，置显微镜下观察，12min即可见大部分EC收缩变圆,而杂细胞(主要是成纤维细胞）仍然贴壁。此时,立即加入M199完全培养液以终止酶的活性,然后弃去其液体，加新鲜M199完全培养液，轻轻将细胞吹打下来,传到另一培养瓶，如此经过23次，可得到较纯的EC。其次有人使用含肝素的完全培养液（在液体中加入90U/ml的肝素）可使EC纯度提高。2。6。4 EC的培养条件EC培养条件要求比较严格，培养液的pH温度,抗生素的种类和含量,血清质量和活性，ECGF的质量和含量,EC分离时所受到的创伤,孵育箱的培养条件，都对EC的生长有重要影响。2。6。4。1 小牛或胎牛血清的质量对EC的生长影响很大，胎牛血清较小牛血清更好。一般原代培养用20，传代培养用10%血清,常用培养基为M199,pH 7.2为宜。2。6。4.2 塑料培养瓶或皿较玻璃或皿更利于EC生长，培养瓶或皿铺上纤连蛋白，明胶或胶原，以利EC的贴壁生长，但应首选纤连蛋白,因它对蛋白和DNA的测定无显著影响。2.6.4.3 EC的传代培养一般EC的传代比例是12或13.如需要单次传代，扩大体外培养规模时，可以120以上的比例进行传代，这样可在短期内获得大量的EC，进行冻存或实验工作,但单次传代,扩大体外培养规模,须在培养液中加入内皮细胞生长因子（endothelial cell growth factor，ECGF），只是该因子价格较昂贵.EC经多次传代后其形态和生物学特性会有所改变,并且其生长期有限，不断衰退，故不宜作长期传代培养，一般生长期在2030d左右，如实验需要可重复从原代建立培养。体外培养EC用于评价抗动脉粥样硬化的药效学实验 现介绍几种常用的实验方法 1保护血管内皮细胞（endothelial cells，EC）药的实验损伤学说认为，机械、化学、免疫、感染等引起EC损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的起始因素，反复的EC损伤引起单核巨噬细胞、血小板粘附,可致AS斑块形成。对血管内皮具有保护作用的药物可使EC免受有害因子的损伤，可能有抗AS作用。1.1原理 将EC置于适宜的培养液中进行培养,将EC以缺氧，损伤剂造成细胞损伤，通过形态学、功能、生长等指标观察药物抗损伤效应.1。2实验方案 取传代后制成单细胞悬液的EC，用含10%小牛血清的M199液调细胞至2105/ml，接种入用0.1纤连蛋白包被的96孔（100 l/孔）或24孔(0.5ml/孔)板中培养，待细胞融合即可进行实验.通常设:正常组（不加药，不加损伤剂）；损伤组（不加药只加损伤剂）；若干给药组(加不同剂量药物,加损伤剂，或不加损伤剂）.给药组细胞首先给含药M199液，培养数h（一般624h），使药物与细胞充分作用，然后用Hanks液洗去全部药液，加损伤剂.1.2.1 多聚阳离子损伤加入含多聚赖氨酸培养液200 l或500 l，终浓度200nmol/L，孵温箱培养2h后,实验观察检测结果.1。2。2 氧自由基损伤加入含黄嘌呤的培养液100 l或250 l，终浓度10 mol/L，同时加入含黄嘌呤氧化酶100 l或250 l终浓度200 mol/L，孵育箱培养16h，即可观察检测结果。1。2.3 缺氧损伤缺氧培养,供应含3%氧气的混合气体（CO2和N2）37培养34h，可观察检测结果。1.3 结果观察1.3.1 形态观察 正常生长的EC光镜下呈梭形或多角形,镶嵌排列成铺路石状，相互融合，单层致密。损伤的细胞形态细长如柳叶，大小不匀，分布不均，间隙增宽。1。3.2 3HTdR掺入测定 EC损伤后吸去原液体，加入含3HTdR培养液（1 ci/200l/孔，3。7104Bq）掺入24h，收集样品，以液闪仪检测3H-TdR的掺入率，损伤越重,DNA合成减少,3H-TdR掺入率就愈低。1.3.3 细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH）测定 因细胞被损伤可使内含物渗出到培养液中，随着损伤的加重，渗出物增多，其测定方法与以前介绍练习的用LDH释放法检测NK细胞活性的操作相类似.2促进EC合成或释放一氧化氮（nitric oxide，NO）药物的实验2.1 原理 EC能释放多种活性因子，其中NO为血管舒张因子，能阻止AS病变的形成，故试验观测NO释放的多少，就可确定药物抗AS及其机理的方式之一。2。2 实验设计与样品的收集 取第2代生长良好的EC，常规制备单细胞悬液，调细胞浓度为2105/ml，接种于24孔板，0.5ml/孔，待呈融合状态时，去上清，用无血清无酚红的M199液淋洗23次，即可进行实验。2.2。1 观察药物对EC分泌NO的量效关系 正常组（加入无血清无酚红的M199）；含药物的M199溶液组（一般分为5个药物浓度）；含药物的M199及EDTA溶液组(选定一个有效药物浓度，EDTA的终浓度为0。02%）,每孔总体积0.5ml（原量）,设复孔6个，置孵温箱中培养24h，收集上清样品,待测NO的含量(或以OD值表示）.2。2.2 观测药物对EC分泌NO的时效关系 同样设上述三组，后二组选定一个有效的药物浓度,在孵育箱中培养0.5、1、2、4、6h后，分别收集上清液样品，在酶标仪上550nm处检测OD值。2。2.3 NO浓度的测定 取3份体积的上清液+1份体积的Gress试剂（10对氨基苯磺酸,0。1% N-奈基乙二胺，2.5ml 磷酸)混合后,在550nm波长处检测OD值,或用NO检测试剂盒检测，从已知标性的曲线上换算得出其含量的浓度,以mol/L表示。用t检验比较组间差异性。2。2。4 形态学观察比较各实验组的变化。2。2.5 结果分析 具有促进NO合成和释放的药物，在适当的浓度下可使量效实验的给药组上清液中NO浓度升高，并呈量效关系；药物+EDTA组上清液中NO浓度可能不变,这是因为有EDTA螯合了钙离子，影响了EC中NO合成酶的激活所致。在时效关系实验中，单给药组可呈时效关系曲线，其它二组基本不变。在形态方面，试验24h后有促进NO合成和释放的药物,(单给药组）EC仍呈融合状态，变化不明显。余EC呈边缘皱缩,细胞间隙增大，细胞质中有大小不等的颗粒状空泡。3用6-酮前列腺素F1放射免疫检测盒间接检测药物促EC分泌前列腺环素（PGI2）的水平。我们已知PGI2是最强的血管扩张剂和血小板聚集抑制剂，EC是PGI2的主要合成场所。PGI2很不稳定，尤其在体内，半衰期只有23min无法直接测定，只能通过其稳定的代谢物6-酮PGF-1的测定来间接反映PGI2的含量.3。1 原理 抗6酮PGF-1抗体与血浆或EC上清液中的6酮-PGF1抗原结合形成特异性抗原抗体复合物,向该反应体系中加入一定量的3H标记的6酮PGF1作为示踪剂，当抗体量不足时，示踪剂与样品中的6酮PGF1竞争抗体。加入第二抗体或活性炭将抗原抗体复合物和游离的抗原分开，测定抗原抗体复合物放射性，即可算出样品中6酮-PGF1的含量，具体操作按试剂说明书进行。3.2 注意事项 EC培养上清液中的6酮-PGF-1含量比血浆高许多培，检测时可适当稀释。4氧化型低密度脂蛋白介导单核细胞粘附的实验4。1 原理 当前认为单核细胞（monocyte,MC）粘附于血管内皮细胞（vasculer endothelial cell，VEC)是循环MC进入动脉内膜，并且局部形成泡沫细胞的前提，故实验观测oxLDL（oxide low density lipoprotein，oxLDL）对MC与VEC间的粘附。且已有试验证明经oxLDL处理的VEC可提高对MC的粘附力45倍,36h达高峰，经oxLDL处理的MC也可提高对VEC的粘附性，1h即达高峰并继续24h。因此观察oxLDL对MC与VEC间的粘附是研究抗动脉粥样硬化药的作用机理之一。4。2 放射性同位素标记MC法测定oxLDL介导VEC的粘附作用 用51Cr标记的MC细胞与培养的VEC孵育，然后洗掉未粘附的MC，加入NaOH溶解与EC粘附的MC。通过测定放射性即可算出与VEC粘附的MC百分率.4.2.1 白细胞的分离 抗凝全血(EDTANa2 12mg/ml血）+等量6%的右旋糖酐生理盐水液，于37静置30min，使RBC沉淀,吸出上层液体于3ml淋巴细胞分离液上，2000r/min20离心，在二层液面交界处为MC，离心管底部为多形核白细胞（polymorpho nuclear neutrophil cell，PMNC），分别吸出两种WBC,加D-Hanks液1000r/min10去上清，加Tris-NH4Cl缓冲液（0。16mol/L NH4Cl和0。17mol/L Tris，91混合pH7。2）1ml作用35min溶解RBC，补足D-Hanks液到原体积，1000r/min10，去上清，再悬浮于DHanks液中。4。2。2 WBC的标记 将上述WBC用DHanks液调整到5106/ml，加入51Cr 20 ci/ml（终浓度），37孵育1h,用D-Hanks洗涤三次,用M199完全培养液再悬浮，备用。4。2.3 实验设计 正常组：VEC + 51Cr标记的MC；模型组：VEC + oxLDL+51Cr标记的MC；实验组：VEC + 药物（有效剂量）+ oxLDL+51Cr标记的MC4.2.4 实验步骤 将预先制备好的含2105/ml EC的M199完全培养液加入24孔板，每孔0。5ml培养成单层融合时，加入含一定浓度药物的M199液0。5ml继续孵育箱培养12h,完全洗去药物，加入含oxLDL的M199完全培养液0。5ml继续培养（终浓度50mg TG/L）12h,完全洗oxLDL(一般用D-Hanks液洗三次）加入51Cr标记的MC 5106/ml 0.5ml,孵育箱培养5min，去上清，每次用0.5ml DHanks液淋洗3次以去除未吸附的MC，加入1mol/L的NaOH 0。5ml溶解MC，用记数仪检测液体中的放射性，可求出VEC粘附MC的百分率。4.3 白细胞髓过氧化酶法4。3。1 原理 单核细胞及中性粒细胞内含有丰富的髓过氧化酶,将粘附在内皮细胞上的白细胞用HTAB(十二烷基三甲基溴化铵)溶解后，髓过氧化酶即可释放出来，然后加入H2O2及底物,经显色反应后，用酶标仪测OD值，即可求出粘附的白细胞量。4.3。2 标体制备 白细胞的分离及内皮细胞培养同前.4。3。3 测定步骤 将内皮细胞传入96孔板培养成单层融合细胞，根据实验目的进行预处理。然后加入100 l白细胞（5106个细胞/ml）,于37 5 CO2中孵育30min，用PBS洗三次以去除未粘附白细胞,加入50 l溶于PBS（pH6.0)中的0。5% HTAB，使白细胞溶解，再加入200 l 0.63mmol/L的二盐酸邻联茴香胺(含0。4 mmol/L H2O2，pH6。0）,37显色5min，于450nm波长测OD值。同一块板上制备标准曲线，白细胞量为(05)105个/孔，以OD值为横坐标，白细胞数为纵坐标作标准曲线。4。3.4注意事项a 含H2O2二盐酸邻联茴香胺应在实验前临时配制。b 显色时间不能过长，否则光吸收值差别不明显。9