imageJ测脊髓损伤体积.doc

(word完整版)imageJ测脊髓损伤体积
Image J 测脊髓损伤的体积
组织：脊髓
长度:10mm
切片厚度：100um
准备工作：
1 损伤后30min，断头处死，共处死6只大鼠用于实验.然后取出损伤区域的脊柱，10mm，置于4%多聚甲醛中过夜.
2 待固定完全后，取出脊髓，放入30%蔗糖缓冲液中进行脱水.
3 待脱水完全后，用滤纸吸干组织表面液体，置于冰冻切片机内，速冻，备用.
4 用冰冻切片机行连续切片,由损伤前端开始切，切片厚度为100um，依次黏贴在载玻片上，每张载玻片贴4片，顺序为从左到右依次排列。并做好起始标记。同时载玻片亦按顺序放置在玻片盒中,备用。
5 待所有切片切完后，用olympus显微镜拍照，选取40×的照片，并依次编号，备用。
6 镜台测微尺图像拍摄:将镜台测微尺置于载物台上，然后用olympus显微镜，在同一焦距下，分别用4倍，10倍,40倍物镜拍摄,并分别进行编号,备用。
ImageJ软件测量损伤体积（LV)的操作方法：
1 安装ImageJ软件（已经安装该软件的直接进入第二步）
ImageJ软件下载，（版本1.42）直接双击下载后的程序即可安装，软件运行最少需要64M内存，可以在Windows、Linux、Mac OS等操作系统上运行。
2 损伤体积（LV）测量的具体流程
2。1获取图片
将olympus显微镜中拍摄的组织照片和测微尺的照片拷贝到个人电脑，建立文件夹并命名“脊髓损伤体积测定”，然后对其进行LV测量。在测LV之前，我们需要对标尺进行校正。
2.2标尺设定
运行ImageJ软件，导入标尺图片，点击工具栏选择 straight lines(直线工具)，用鼠标左键在标尺上画一段直线(这样就能确定我们所画的直线的长度），点击菜单栏中的Analyze→set scale（分析→设置标尺），自动弹出“set scale(设置标尺）”窗口,设定“known distance”选项为“”（刚才所画的已知长度）,设定“unite of lenth”选项为“um”（已知长度的单位值），在global选项中打钩.表示所用的图像都由像素转变为μm。标尺设定好以后，点击右上角的“”，关闭标尺图片.

这步的目的就是设置标尺，将像素值转变为实际的几何测量值（μm）.

2.3半自动法测量LV
2。3.1 点击菜单栏上面的file → open ，找到为“脊髓损伤体积测定”的文件夹，按文件夹中图像的编号顺序,依次打开含有脊髓组织的jepg格式的图像，共100层；
2.3。2 点击菜单栏上的image→stacks→image to stack. ,在中填入1，表示将第一张图片转为图像栈。软件自动将100幅图像转换成图像栈,即在一个窗口里以多线程(多个独立的程序片段，其中一张图片就可以看成一个独立的程序片段）的形式层叠100幅图像，并行处理。所以将图像形成图像栈是为了image J可以同时运行多张图片。
2。3。3 点击image→adjust→window/level（窗宽/窗位）。这步的目的是调节图像栈的窗宽和窗位（其中设置窗宽为300Hu，窗位为40Hu)，得到最佳的图像分割效果.所谓窗位就是图像显示过程中代表图像由暗到亮之间的中心位置.
2.3.4 点击image→type→8-bit，这步目的是将图像转化灰度图像
2.3。5点击此窗口中菜单栏,file→save as→jpeg，自动弹出窗口，输入图像栈保存名称为“原始栈图像"，备用；
2。3.6点击菜单栏Process→Enhance Contrast→OK，这步是增强图片的对比度；
2.3。7 Process→Smooth对栈进行平滑处理.
2.3。8 点击单击菜单栏Image→Adjust→Threshold(阈值)。这一步目的就是将灰度图像转变为高对比度的黑白图像.弹出Threshold窗口，选择下方中的下拉菜单中的D&W（“黑和白”用于将灰度图像转变为黑白图像)选项。点击set，对阈值进行设定（一般最小值为100，最大值为230）

2。3．9 单击apply后，再单击菜单栏上面的process→binary→outline，这一步是为了得到图像的边缘轮廓.对此图像进行保存,命名为边缘图像。
2.3.10 打开原来保存过的“原始栈图像”。
2.3。11 单击process→image calculator（图像计算器）。弹出了image calculator 窗口，在Image1栏选择“原始栈图像”，Image 2栏选择“边缘图像”，Operation栏选择Subtract，点击OK，自动弹出result of 原始栈图像（原始栈图像减去边边缘轮廓的图像栈，本文称之为“减图像”);

2。3。11 得到减图后， 使用 工具，画出自己感兴趣的区域.例如：

2.3。12 获取栈的第一幅CT图像的ROI后，点击菜单栏Analyze→Tools→ROI Manager…,在弹出的ROIManager窗口中点击Add,软件自动添加第一幅图像的ROI数据;
2。3.13重新点击image→stacks→image to stacks，自动弹出“stacks”窗口，，在填2，表示将第二张图片改为图像栈。然后利用freehand selections创建第二幅图像的ROI，并在ROI Manager窗口中点击Add，添加第二I数据,之后依次对栈图像做以上处理，直到添加完N幅图像的ROI数据，点击ROI Manager窗口中的Measure按钮，软件自动弹出Result窗口显示所有感兴趣区域的面积
计算结果，单击File→Save As可自动存为Excel格式文件,利用Exc算各层面ROI面积和层厚（100um）的乘积,再累加各项乘积，得到脊髓组织的总体积。