分离科学与进展专题二.ppt

1分离科学与进展分离科学与进展 专题专题(二二)色谱分析新技术色谱分析新技术 杨俊杨俊 钙渴敏耶削李规新桨篱刷狸铭完摔武恭绕娱到聋妓策致兵冒橇炔众沼旦络分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二2 讲座内容讲座内容色谱与质谱联用技术色谱与质谱联用技术 多维色谱技术多维色谱技术亲水作用色谱技术亲水作用色谱技术超高压液相色谱技术超高压液相色谱技术 垛前慈米鲍煎厅皖酌顽曝刁律梁匈堵脑涣搽观刘低绑谩荧盆姐分其锑状紊分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二5/16/20243 一、超高压液相色谱技术一、超高压液相色谱技术 最近最近1010年，在液相色谱分离领域快速发展几项技术：年，在液相色谱分离领域快速发展几项技术：1 1、超高压液相色谱技术、超高压液相色谱技术 ；2 2、亲水作用色谱技术；、亲水作用色谱技术；3 3、高温液相色谱技术；、高温液相色谱技术；4 4、整体柱技术。、整体柱技术。(Trends in Anal.Chem.29:15；J.Sep.Sci.33,679)芭娩波泻呈需韧库碟对爱搏冀少载旧帚站胆锄锭仕键谐卞辩侵万脚黎脸鞠分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二419641964年年,Giddings指出指出最大理论塔板数和分离速度与色谱系统的操作压力最大理论塔板数和分离速度与色谱系统的操作压力有关有关,并提出增高色谱柱压力改善分离度的方法。并提出增高色谱柱压力改善分离度的方法。1969 1969 年年,Bidlingmeyer等第一次使用亚等第一次使用亚2 2m m 填料填充的色谱柱进行研究填料填充的色谱柱进行研究,实验结果重复性较差。实验结果重复性较差。19741974年年,Guiochon等对使用超高压的液相色谱行为进行了理论研究等对使用超高压的液相色谱行为进行了理论研究,提出提出压力对分离的影响规律压力对分离的影响规律。19971997年年,MacNair使用粒径使用粒径1.51.5m m 无孔填料填充了无孔填料填充了52 52 cm 30 30m m 的毛细管的毛细管柱柱,使用压力使用压力410MPa410MPa,获得最高柱效为获得最高柱效为3030万块塔板万块塔板/m/m。这一实验结果被认为这一实验结果被认为对超高压液相色谱的发展具有里程碑的意义。对超高压液相色谱的发展具有里程碑的意义。(Anal.Chem.,1997,69:983)20032003年年,Jerkovich等填充了填料粒径为等填充了填料粒径为1.01.0m m的色谱柱的色谱柱,最高柱压达到最高柱压达到700 700 MPaMPa,等度分离等度分离5 5 种组分仅用了种组分仅用了8m in,8m in,分析时间大大缩短。分析时间大大缩短。使用使用37 cm 37 cm 30 30m m 的色谱柱分离邻苯二酚和对苯二酚的色谱柱分离邻苯二酚和对苯二酚,柱效分别达到柱效分别达到5050万塔板万塔板/m/m 和和62.562.5万块万块塔板塔板/m/m。Waters 公司在公司在20042004年首先推出了年首先推出了AcquityUPLC系统系统,其采用小颗粒填料其采用小颗粒填料,在高压下运行。在高压下运行。商品化的超高压液相色谱仪器的序幕由此揭开。商品化的超高压液相色谱仪器的序幕由此揭开。基于同样基于同样原理原理,Thermo公司和公司和Jasco公司也相继推出了公司也相继推出了耐压耐压104MPa104MPa的液相色谱系统。的液相色谱系统。而而Agilent和岛津公司则通过升高温度来降低柱压和岛津公司则通过升高温度来降低柱压,系统压力系统压力60MPa60MPa。超高压液相色谱的历史回顾超高压液相色谱的历史回顾似咐贵敦馅白臀覆朔钝庇秸铬宽装遗蔷岁皮你葬发堵庭跺橡辱寞策蠢美勤分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二5 使用亚使用亚 2m填料填料,色谱柱的孔隙率低色谱柱的孔隙率低,在相同流速下产生的压力大在相同流速下产生的压力大,因此因此产生了产生了超高压液相色谱超高压液相色谱(ultrahigh pressure liquid chromatography,UHPLC)。超高压液相色谱的使用压力一般超过。超高压液相色谱的使用压力一般超过40MPa。有人把使用压力。有人把使用压力在在100 MPa以上的才称为以上的才称为UHPLC,而使用压力在而使用压力在40 100 MPa之间的称之之间的称之为为UPLC,即超高效液相色谱。即超高效液相色谱。UPLC 原理：原理：UPLC 保持了传统保持了传统HPLC 的基本原理，但其的基本原理，但其分离效能和分分离效能和分析速度析速度得到了全面提升，这归功于其得到了全面提升，这归功于其独特的小颗粒色谱填料技术独特的小颗粒色谱填料技术。在。在HPLC 的速率理论中，的速率理论中，Van Deemter 方程可简化为方程可简化为:H=A+B/v+C v其中其中:H 为理论塔板高度为理论塔板高度;v 为流动相的平均线速度为流动相的平均线速度;A、B、C 为常数，分别为常数，分别代表代表涡流扩散项系数涡流扩散项系数、分子扩散项系数分子扩散项系数和和传质阻力项系数传质阻力项系数，其中各项均与，其中各项均与固定相粒度固定相粒度(dp)相关相关，如仅考虑，如仅考虑dp 对对H 的影响，上式可表示为的影响，上式可表示为:H=a(dp)+b/v+c(dp)dp 是影响色谱柱性能最重要的因素是影响色谱柱性能最重要的因素。根据。根据Knox 理论曲线，理论曲线，在相同线速度在相同线速度下，填料粒径越小，理论塔板高度越小，柱效越高。下，填料粒径越小，理论塔板高度越小，柱效越高。小颗粒填料的另一个小颗粒填料的另一个重要特征是，当重要特征是，当增加流量增加流量(线速度线速度)时塔板高度没有明显的增大时塔板高度没有明显的增大，且维持在，且维持在一定范围内，即在较大流量范围内保持较高的柱效。一定范围内，即在较大流量范围内保持较高的柱效。超高压液相色谱的原理超高压液相色谱的原理(J.Chromatogr.A,1127:60）挖叭惺绒吞搪嚼狂独屎浚晤幸亡员刚匙涸揪逛喘疮悲绣汉矾丝镐驯然啼驮分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二6 不同粒径柱填料的不同粒径柱填料的Van Deemter曲线曲线(J.Liquid Chromatogr.Related Tech.2005,28:1253)蛀汞伺纬惮嫁罗邑秩裤才半句下持啥点摩煽枷纠鹊坑傣耀陶靴局质消绕醋分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二7 UPLC的性能优势的性能优势使用亚二微米填料为分离介质，使用使用亚二微米填料为分离介质，使用UPLC获得小颗粒填料的性能优势：获得小颗粒填料的性能优势：即速度、分离度和灵敏度优势。即速度、分离度和灵敏度优势。1）提高分析速度）提高分析速度猫蔫奠哲呆藉戊李闰谬学扩晋创穆愈攻涂傲夕订馒梯携秉芥袁腿嗜敛随寸分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二8 UPLC提高分离度提高分离度2）提高分离度）提高分离度 根据等度液相根据等度液相色谱分离度色谱分离度(R)方程方程,R 受受n(理论塔板数理论塔板数)、选择因子、选择因子()和容量因子和容量因子(k)的控制。随着的控制。随着dp的减小的减小,n 增加增加,则则R 也增加也增加。汞鸿柴灭躇陡在限獭赊哀娱驹瘫他芭乐贼鹰是慰叉尔卸傈沏厂虐合啃毒冬分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二9 UPLC提高检测灵敏度提高检测灵敏度3）提高检测灵敏度）提高检测灵敏度 UPLC 通过减小通过减小dp,有效地降低了有效地降低了H,使使色谱峰变得更窄色谱峰变得更窄,信噪比增大信噪比增大,灵灵敏度得到额外的提高敏度得到额外的提高。臻牙唆芜降余爱绕屯箱拷剂拌扰石禾而吓次判铬抉敷冬誉吾潘洼滦鉴慌安分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二10 UPLC提高分析效率、减少流动相用量提高分析效率、减少流动相用量4）分析效率、减少流动相用量）分析效率、减少流动相用量 UPLC 通过通过分析时间短，减少流动相用量分析时间短，减少流动相用量；分离度提高，；分离度提高，单位时间峰单位时间峰容量增加，分析效率显著提高容量增加，分析效率显著提高。秩魔镜焊蘸南账懂任棉孔凿腐咱囤诡硬予鲸梧脱魏斩挞桨检勇信藐页惠晨分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二11UPLC高压力带来仪器技术的改进高压力带来仪器技术的改进 据据Darcy 公式公式,流动相通过色谱柱后其压力的升高程度流动相通过色谱柱后其压力的升高程度(P)与流动相黏度与流动相黏度()、柱长、柱长(l)及流动相线速度及流动相线速度(v)成正比成正比,而与比渗透系数而与比渗透系数(k0)及及d2p 成反比。成反比。所以所以随着随着dp 的减小的减小,压力将成倍地增加压力将成倍地增加,因此因此超高的工作压力成为超高的工作压力成为UPLC 的的必然选择。必然选择。进样系统：进样系统：密封要良好还要有较小的死体积密封要良好还要有较小的死体积,同时要保证塞型进样同时要保证塞型进样,以减以减小峰展宽。小峰展宽。检测器：检测器：提高采样频率提高采样频率之外之外,还需要降低噪声还需要降低噪声,减小流通池体积减小流通池体积,采用采用无无光损耗的检测池等光损耗的检测池等技术技术,以保持高柱效和高灵敏度。研究发现以保持高柱效和高灵敏度。研究发现,操作压力在操作压力在140MPa以下以下,采样频率采样频率采用采用10 Hz;140 MPa以上以上,采样频率采用采样频率采用20 Hz,才才能满足拟合要求。飞行时间质谱能满足拟合要求。飞行时间质谱(TOF-MS)检测器的采样频率较高检测器的采样频率较高(100spectra/s),适合于超高压系统。适合于超高压系统。梯度混合器：梯度混合器：超高压系统中超高压系统中,流动相混合比例变化较快。一方面流动相混合比例变化较快。一方面,应应“足足够大够大”,以保证在电磁阀有限的开关时间内将两溶剂充分混合以保证在电磁阀有限的开关时间内将两溶剂充分混合;另一方面另一方面,应应“足够小足够小”,以保证在恒定流速下溶剂组成的快速改变以保证在恒定流速下溶剂组成的快速改变,梯度延迟体积要梯度延迟体积要小小。(Anal.Chim.Acta,2009,656,8)撑硝脓脓掖岿觅狭盟撇期亚爪卒司狞摊诀扶墅伏颐冯炬铅糊砂胀拍酝畴空分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二12 UPLC的应用的应用示例示例超高压液相色谱超高压液相色谱(UPLC)串联四极杆质谱测定二甲双胍的血药浓度串联四极杆质谱测定二甲双胍的血药浓度盐酸二甲双胍盐酸二甲双胍为常用为常用口服降血糖药口服降血糖药，二甲双胍主要由小肠吸收，口服，二甲双胍主要由小肠吸收，口服0.5g，2小时后，血浆浓度达峰值，约小时后，血浆浓度达峰值，约2g/mL。二甲双胍结构稳定，血浆。二甲双胍结构稳定，血浆半衰期为半衰期为1.74.5小时，小时，12小时内以原形随尿液排出小时内以原形随尿液排出90%。三重串联四极杆质谱三重串联四极杆质谱，具有独特的高选择性具有独特的高选择性，可以显著降低复杂基质的，可以显著降低复杂基质的背景干扰，从而背景干扰，从而提高检测灵敏度提高检测灵敏度。超高压液相色谱具有的高分离效能，与质谱联机时，可有效减少样品基超高压液相色谱具有的高分离效能，与质谱联机时，可有效减少样品基质的干扰，质的干扰，提高电喷雾离子化效率提高电喷雾离子化效率，良好的色谱分离，可，良好的色谱分离，可有效防止基质对有效防止基质对待测组分离子化的抑止作用待测组分离子化的抑止作用。常规常规HPLC/MS/MS，对二甲双胍的，对二甲双胍的检测检测限可达限可达0.83pg（绝对柱上样品量）；（绝对柱上样品量）；而采而采用用UPLC/MS/SIM,检测限检测限可达可达0.14pg（绝（绝对柱上样品量），检测对柱上样品量），检测灵敏度灵敏度提高了提高了6倍。倍。在获得更好的检测结果的同时，在获得更好的检测结果的同时，分析时间分析时间缩短缩短3倍。倍。贬孺婆弦添振艳宵瘤箕簧沼垦鹤缸卡辽构甥满侩敞砾起棒湍京壁桅茎党辑分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二13 二、亲水作用色谱技术二、亲水作用色谱技术亲水作用色谱定义亲水作用色谱定义亲水作用色谱亲水作用色谱(HILIC)(HILIC)作为一种分离极性化合物的液相色谱模式作为一种分离极性化合物的液相色谱模式,其概念最其概念最早是由早是由Alpert于于1990 1990 年提出的。年提出的。HILICHILIC的主要特征是使用类似于正相色谱的极的主要特征是使用类似于正相色谱的极性固定相和水性固定相和水/有机溶剂有机溶剂(通常是乙腈通常是乙腈)流动相。流动相。19701970年代年代,Linden,Linden等就使用等就使用氨基硅胶作为固定相氨基硅胶作为固定相、以含、以含75%75%乙腈的水溶液作乙腈的水溶液作为流动相为流动相用于糖的分离分析用于糖的分离分析。这种分离技术是典型的。这种分离技术是典型的HILIC HILIC 模式模式,也是也是最早的最早的关于关于HILICHILIC 的报道的报道,虽然其中并未涉及虽然其中并未涉及HILICHILIC的定义。的定义。反相液相色谱反相液相色谱(RPLC)(RPLC)是当前分离分析和分离制备中应用最为广泛的色谱模是当前分离分析和分离制备中应用最为广泛的色谱模式式,其依靠疏水固定相与溶质之间的疏水相互作用实现弱极性和中等极性化合其依靠疏水固定相与溶质之间的疏水相互作用实现弱极性和中等极性化合物的高效分离。但是物的高效分离。但是,RPLCRPLC对强极性化合物对强极性化合物(如寡糖、糖苷和强极性寡肽等如寡糖、糖苷和强极性寡肽等)的的保留很弱保留很弱,甚至不保留甚至不保留,不能得到很好的分离不能得到很好的分离。用来分离强极性化合物的液相色谱方法主要有用来分离强极性化合物的液相色谱方法主要有离子交换色谱法离子交换色谱法(IEC)(IEC)、正正相色谱法相色谱法(NPLC)(NPLC)和和亲水作用色谱法亲水作用色谱法(HILIC)(HILIC)。它们可以作为。它们可以作为RPLCRPLC的补充用于的补充用于强极性化合物的分离强极性化合物的分离;然而然而,它们又各自存在一定的局限性。它们又各自存在一定的局限性。与正相色谱类似与正相色谱类似,在在HILICHILIC模式下化合物的保留时间随化合物极性的增强而模式下化合物的保留时间随化合物极性的增强而增加。增加。但是但是,由于由于HILIC HILIC 使用含水流动相使用含水流动相,这就可以解决正相色谱中水溶性物这就可以解决正相色谱中水溶性物质不溶于流动相的问题质不溶于流动相的问题。(J.Chromatogr.,1990,499:177;J.Chromatogr.,1975,105(1):125;)榴疗烈轿驴任今词秩瓶瑶塘扣闹惹殉名芍寞牢乒豫迷乎征炽叁皇胆办伴应分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二14 HILICHILIC模式模式对强对强极性化合物和亲水化合物极性化合物和亲水化合物具有很好的保留和分具有很好的保留和分离选择性离选择性,是解决各类强极性化合物和亲水化合物分离问题的可是解决各类强极性化合物和亲水化合物分离问题的可靠手段。靠手段。HILICHILIC模式使用的流动相体系相对简单模式使用的流动相体系相对简单,操作方便操作方便,而且而且克服了克服了NPLCNPLC的流动相对水溶性物质的流动相对水溶性物质溶解性溶解性差差、保留时间对流动相中水、保留时间对流动相中水含量敏感以及与质谱检测器不兼容等缺点。含量敏感以及与质谱检测器不兼容等缺点。HILIC HILIC 的的分离机理分离机理与与RPLCRPLC完全不同完全不同,两者的分离选择性有很好两者的分离选择性有很好的正交性的正交性,而两者的流动相体系却相似而两者的流动相体系却相似,十分适合用于十分适合用于构建构建HILIC-HILIC-RPLCRPLC二维色谱系统二维色谱系统。近年来近年来,HILIC,HILIC 越来越受到关注和重视。越来越受到关注和重视。主要是因为主要是因为强极性化强极性化合物的分离问题合物的分离问题引起了各个研究领域的重视引起了各个研究领域的重视,如如药物分析、代谢药物分析、代谢组学、蛋白质组学等组学、蛋白质组学等研究领域都不同程度地涉及强极性化合物研究领域都不同程度地涉及强极性化合物的分离问题。的分离问题。(Anal.,Chem.,2005,77:6426)亲水作用色谱的优势亲水作用色谱的优势们澳冈侦癌巫侈茵节舍棘葡食朗第玛框僻鹏伺谆桃镐鞠赴虑挡湍研挞迪逝分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二15 根据根据Alpert Alpert 对对HILICHILIC的定义的定义,极性样品在极性样品在HILICHILIC中的保留中的保留基于分基于分配机理配机理。研究表明。研究表明,当使用水当使用水-水溶性有机溶剂作流动相时水溶性有机溶剂作流动相时,亲水亲水性的固定相表面会固着一层富水层性的固定相表面会固着一层富水层;而一些糖类化合物在而一些糖类化合物在氨基衍氨基衍生的硅胶固定相生的硅胶固定相上的上的保留也确实包含分配机理保留也确实包含分配机理。AlpertAlpert同时指出同时指出:导致两相之间发生分配的原因并不清楚导致两相之间发生分配的原因并不清楚,有可能也包含了某些有可能也包含了某些偶偶极极-偶极相互作用偶极相互作用。在后续的研究中在后续的研究中,有人提出保留是有人提出保留是基于溶质在固定相上的基于溶质在固定相上的吸附吸附。更多的实验现象则表明更多的实验现象则表明HILIC HILIC 的的保留机理包含保留机理包含氢键作用、偶极氢键作用、偶极作用和静电作用等作用和静电作用等多种次级效应多种次级效应。HILICHILIC的分离机理在目前还存在着争议的分离机理在目前还存在着争议,但在实际应用中但在实际应用中,普遍普遍认为其认为其保留行为受到多种参数的影响保留行为受到多种参数的影响,如如固定相的功能基团固定相的功能基团、有、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH pH 值、缓冲值、缓冲盐的种类和浓度盐的种类和浓度等。等。(化学进展,2006,11:1508;J.Sep.Sci.2006,29,1784)亲水作用色谱的分离机理亲水作用色谱的分离机理绳返畴凰辗挞坤胡养过顶沙床工愤合删远漠壳摇闽缅朱圭冻哼棺峻出乒汉分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二16 传统的传统的NPLCNPLC固定相直接用于固定相直接用于H ILICH ILIC NPLCNPLC使用的极性固定相主要有纯硅胶、氨基键合相、氰基键合相和二醇基键使用的极性固定相主要有纯硅胶、氨基键合相、氰基键合相和二醇基键合相等合相等。这些固定相具有较强的极性和亲水性。这些固定相具有较强的极性和亲水性,都能直接用于都能直接用于HILICHILIC。传统的。传统的正相色谱固定相虽然可直接用于正相色谱固定相虽然可直接用于HILICHILIC模式模式,但是在亲水性、选择性、重复性但是在亲水性、选择性、重复性和使用寿命方面存在很多问题和使用寿命方面存在很多问题,其应用范围有限其应用范围有限,不是理想的不是理想的HILICHILIC固定相。固定相。亲水作用色谱的固定相亲水作用色谱的固定相值咯丹零彭串棋膛干猩莽裹晨乙蔽掩痛蘸津食继适譬败恒谁吗硝着绊鄂师分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二17 由于由于HILIC HILIC 模式的快速发展和模式的快速发展和强极性化合物分离需求的增强强极性化合物分离需求的增强,专为专为HILICHILIC设计的固定相得到设计的固定相得到了越来越多的关注和应用。已了越来越多的关注和应用。已经有多种类型的经有多种类型的专门用于专门用于HILIC HILIC 的固定相的固定相实现了商品化，实现了商品化，根据键合相的化学结构进行分根据键合相的化学结构进行分类类,HILIC,HILIC固定相可分为固定相可分为酰胺型、酰胺型、多元醇羟基型和两性离子型等多元醇羟基型和两性离子型等。这几类基团具有很好的亲水性这几类基团具有很好的亲水性,十分适合作为亲水色谱的固定十分适合作为亲水色谱的固定相相,而且在一定程度上可以解决而且在一定程度上可以解决传统正相固定相用于传统正相固定相用于HILIC HILIC 所所存在的问题。存在的问题。(色谱.2009,27,675)为亲水作用色谱设计的固定相为亲水作用色谱设计的固定相中缆纤甭乌矗狸俐挤豪香掉沥基荫叭腺氓瘦秧世攫顽贸注螟衫汗疽早丢闽分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二18 以以葡萄糖和麦芽糖葡萄糖和麦芽糖为功能基团的糖基固为功能基团的糖基固定相定相中的醇羟基分布中的醇羟基分布在自由的糖单元上在自由的糖单元上,结构上具有独特之处。结构上具有独特之处。用于用于分离单糖、二糖、分离单糖、二糖、糖醇、寡糖、碱基、糖醇、寡糖、碱基、核苷、肽以及中药中核苷、肽以及中药中的强极性组分的强极性组分。离子型固定相离子型固定相具有具有很好的亲水性很好的亲水性,因此因此也可以应用于也可以应用于HILIC HILIC 模式模式.(Chem.Commum.,2007,24,2491)糖基固定相和强离子交换固定相糖基固定相和强离子交换固定相氢鬼济监渴仕浇夺屁逐京咸降水酞芍烟氦泥盂添懦薯驭痉法缔畔澡漏吮只分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二19 色谱柱效高色谱柱效高,峰形对称峰形对称,保留时间短。保留时间短。流动相组成简单流动相组成简单,固定相稳定。固定相稳定。有利于样品制备：有利于样品制备：样品制备如样品制备如固相萃取固相萃取(SPE)(SPE)、蛋白沉淀、蛋白沉淀(PP)(PP)或液或液-液液萃取萃取(LLE)(LLE)中中,其其最后一步常含强有机溶剂最后一步常含强有机溶剂(如乙腈、异丙醇等如乙腈、异丙醇等)。这些溶剂太。这些溶剂太强强,无法直接注入反相色谱柱无法直接注入反相色谱柱,它们必需蒸干再溶于与反相条件相适的弱溶剂它们必需蒸干再溶于与反相条件相适的弱溶剂中。这一费力又费时的步骤可中。这一费力又费时的步骤可占到样品处理所需全部时间的占到样品处理所需全部时间的50%50%。提高电喷雾质谱提高电喷雾质谱(ESI-MS)(ESI-MS)的灵敏度的灵敏度,有利于蛋白质组学、代谢有利于蛋白质组学、代谢组学、环境科学和食品安全等领域的分析研究。组学、环境科学和食品安全等领域的分析研究。亲水作用色谱的发展趋势亲水作用色谱的发展趋势:降低柱粒径降低柱粒径(超高压超高压)、整体柱、二、整体柱、二维色谱和高温色谱。维色谱和高温色谱。(化学进展,2006,11:1508)亲水作用色谱的特点亲水作用色谱的特点溪润爆扼防嫡抛幸价衔灾莱澡磋缝找夜勒袱胺簿屿凝至柱夕客慷饲趾扒伺分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二20 一种聚甲基丙烯酸酯类一种聚甲基丙烯酸酯类亲水作用亲水作用毛细管电色谱毛细管电色谱整整体柱体柱的制备与评价的制备与评价以以2-2-羟基乙基甲基丙烯酸酯羟基乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)(HEMA)为单体为单体,乙二醇乙二醇二甲基丙烯酸酯二甲基丙烯酸酯(EDMA)(EDMA)为交联剂为交联剂,制备制备亲水分离模式亲水分离模式的的新型毛细管电色谱整体柱新型毛细管电色谱整体柱。整体柱整体柱(Monolithic column)(Monolithic column)又称又称整体固定相、棒柱、整体固定相、棒柱、连续床层无塞柱连续床层无塞柱，由，由Hjerten Hjerten 研究组于研究组于1989 1989 年年首次提出。首次提出。与传统的填充柱分离材料相比，与传统的填充柱分离材料相比，整体柱兼具高效液相整体柱兼具高效液相色谱多孔填料的高容量和快速分离的优点，具有分辨色谱多孔填料的高容量和快速分离的优点，具有分辨率高、制备成本低、使用寿命长、稳定性好等优势，率高、制备成本低、使用寿命长、稳定性好等优势，因此被誉为继因此被誉为继多聚糖、交联与涂渍、单分散之后多聚糖、交联与涂渍、单分散之后的的第第4 4 代色谱填料代色谱填料。亲水作用色谱亲水作用色谱采用采用极性较强的固定相极性较强的固定相和有机溶剂含和有机溶剂含量较高的含水流动相量较高的含水流动相;固定相可有效保留极性物质固定相可有效保留极性物质。4 4 种碱基在种碱基在聚毛细管整体柱聚毛细管整体柱上得到很好的分离。上得到很好的分离。4 4种碱基按照种碱基按照极性由小到大极性由小到大(尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤鸟嘌呤)顺序出峰顺序出峰。(J Chromatogr:A,1989,473:273;色谱,2010,28:1173)亲水作用色谱的应用亲水作用色谱的应用-示例示例磊毯陡脊扔镭授所虚懈绑的颖异茬惯尚栗横躲纫埋搽僻挞赂壬疽每傀恳佛分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二21 高温液相色谱技术高温液相色谱技术历史回顾历史回顾:20 20 世纪世纪80 80 年代后年代后期，期，高温液相色谱（高温液相色谱（HTLCHTLC）技术得到许多研究者的重视。技术得到许多研究者的重视。19871987年，年，Warren Warren 实验实验研究了温研究了温度对反相液相色谱柱效的影响度对反相液相色谱柱效的影响。1988 1988 年，年，Horvath Horvath 等通过对等通过对HPLC HPLC 分离过程中溶质输运特分离过程中溶质输运特征的理论分析，认为提高征的理论分析，认为提高色谱色谱柱的柱温是提高其分离能力的柱的柱温是提高其分离能力的有效途径有效途径。1989 1989 年，年，Biggs Biggs 等等采用室温到采用室温到130130的程序升温方的程序升温方法法分析了聚甲基硅氧烷和烷基分析了聚甲基硅氧烷和烷基苯磺酸苯磺酸等样。等样。1991 1991 年，年，Lacasse Lacasse 等在等在125125用反相柱分离了用反相柱分离了脂肪脂肪酸苯甲酰甲酯酸苯甲酰甲酯，在，在145145用硅胶用硅胶柱分离了柱分离了非离子表面活性剂非离子表面活性剂。固定相的选择固定相的选择:固定相的稳定性固定相的稳定性是限制高是限制高温液相色谱发展的一个重要因素。随着色谱温液相色谱发展的一个重要因素。随着色谱技术的发展，现在出现了几种适用于高温分技术的发展，现在出现了几种适用于高温分析的固定相，析的固定相，常用的有硅胶基质固定相、金常用的有硅胶基质固定相、金属氧化物固定相、石墨化炭固定相和多孔聚属氧化物固定相、石墨化炭固定相和多孔聚合物固定相合物固定相。检测器的选择检测器的选择:在在HTLC HTLC 系统中，随着温度系统中，随着温度的升高，流动相的性质有了许多变化，甚至的升高，流动相的性质有了许多变化，甚至可以可以用用100%100%的水作为流动相的水作为流动相，这使得更多的，这使得更多的检测模式可以用于高效液相色谱，其中用的检测模式可以用于高效液相色谱，其中用的比较多的是比较多的是紫外紫外-可见检测器、氢火焰离子可见检测器、氢火焰离子检测器和蒸发光散射检测器检测器和蒸发光散射检测器。Anal.Chem.,74:1017;HC&GC,4:27兼职鸽尸仟上阑绩褥偿积渤刁砾槐姜劫趴雅吟韭市畜闯熬咀镰评疏绷垮亚分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二22 三、多维色谱技术三、多维色谱技术多维色谱的概念多维色谱的概念(multidimensional gas chromatograph,MDGC)在色谱分析中，一旦遇到在色谱分析中，一旦遇到难分离难分离的物质对，的物质对，改变固定相的选择性改变固定相的选择性是首先考是首先考虑的因素。对于虑的因素。对于高度复杂混合物高度复杂混合物，体系中可能包含不同沸点和不同极性的化，体系中可能包含不同沸点和不同极性的化合物，合物，更换色谱柱，其中的部分物质分离效果得到改善后，其他物质的分离更换色谱柱，其中的部分物质分离效果得到改善后，其他物质的分离效果可能变差。效果可能变差。所以，要改善总体分离效果，应所以，要改善总体分离效果，应采用多维气相色谱采用多维气相色谱。多维气相色谱的早期开拓者多维气相色谱的早期开拓者-阿拉巴马州立大学的阿拉巴马州立大学的BertschBertsch教授教授19871987年年对对MDGCMDGC的定义是的定义是:两根独立控制且极性不同的色谱柱两根独立控制且极性不同的色谱柱,通过一定的通过一定的切换手段切换手段，将将第一根色谱柱的馏分选择性地转移到第二根色谱柱进行二次分离第一根色谱柱的馏分选择性地转移到第二根色谱柱进行二次分离,从而获得从而获得比单柱更强大的分离能力的分离系统。比单柱更强大的分离能力的分离系统。(Anal.Chem.2011,83,5190;Trends in Anal.Chem.,2006.25：438)多维气相色谱的操作原理多维气相色谱的操作原理。一维色谱的。一维色谱的某些馏份某些馏份(tl(tl和和t2)t2)，选择性地转移到二，选择性地转移到二维柱，依靠两柱选择性的差异和峰容量的维柱，依靠两柱选择性的差异和峰容量的提高，使切割的成分获得更充分的分离。提高，使切割的成分获得更充分的分离。GCGC+GC+GC和和 GC GCGCGC 。其它：其它：LCLCLCLC,LC,LC GC,LCGC,LCCE,CE,CECECE,GCCE,GCGCGCGC,LCGC,LCGCGCGC,GC,LCLCLCLCCECE。我额威苟寨跳街扛蔚拯戌食贝失狙袍姆突袒垄伯苫淋蔼筷瓢像龋饮弦奖疑分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二23 (J Chromatogr:A,1999,856:331)多维色谱的核心技术是接口技术多维色谱的核心技术是接口技术涪厉唐坊簧今柱题绪偏弱利淌赐庐仆迟束琵响袱氓州壕辩缄阁房仁负烩挟分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二24 GC+GC技术技术二（多）维气相色谱二（多）维气相色谱传统的多维气相色谱传统的多维气相色谱(MDGC)(MDGC)指的是指的是中心切割方式中心切割方式，每次进样将一维柱的一，每次进样将一维柱的一段或几段馏分转移到二维柱，预柱的大部分成分通过限流管放空，造成样品段或几段馏分转移到二维柱，预柱的大部分成分通过限流管放空，造成样品的浪费。如果对混合物进行全分析，需要多次进样，耗时较长。例如，植物的浪费。如果对混合物进行全分析，需要多次进样，耗时较长。例如，植物精油的全分析，一维色谱分离约精油的全分析，一维色谱分离约1 1小时，小时，2 2一一3 3分钟切割一次，需要分钟切割一次，需要2020多次进样，多次进样，样品的全分析需要耗时样品的全分析需要耗时3030一一4040小时。所以，小时。所以，传统的中心切割多维气相色谱，传统的中心切割多维气相色谱，更适合于复杂体系中目标成分的分析。更适合于复杂体系中目标成分的分析。不适合样品全分析。不适合样品全分析。GC+GCGC+GC 核心技术核心技术(柱切换技术柱切换技术)：柱切换装置是多维气相色谱的心脏部件，柱切换装置是多维气相色谱的心脏部件，一般有两种类型的切换技术，即一般有两种类型的切换技术，即阀切换和压力切换阀切换和压力切换。阀切换阀切换：切换阀采用四通阀或六通阀。切换阀采用四通阀或六通阀。阀切换的优点：流程简单，阀切换的优点：流程简单，操作方便。操作方便。缺点：阀死体积大，吸附活缺点：阀死体积大，吸附活性强，耐温性差，易磨损漏性强，耐温性差，易磨损漏气。气。权扩勋盼亡赃茨纹冈俗张堰摄黎鸣唆撼事各汗供吏狰韵概缄眉枚虹卢涕阻分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二25 压力切换技术压力切换技术压力切换原理压力切换原理是英国是英国ICIICI石油公司石油公司DeansDeans在在19681968年首先提出的。年首先提出的。中心切割式多维气相色谱中心切割式多维气相色谱可实现如下功能可实现如下功能:中心切割、旁通、反吹、两柱分流等。压中心切割、旁通、反吹、两柱分流等。压力中心切割力中心切割是其最重要功能是其最重要功能,其次是其次是反吹功反吹功能。能。2007 2007年，安捷伦公司首先推出了年，安捷伦公司首先推出了微板流路微板流路技术技术 (Capillary flow technology)(Capillary flow technology)，利用光电利用光电雕刻技术，在两片不锈钢平板上刻划出毛细雕刻技术，在两片不锈钢平板上刻划出毛细管气路，然后将板粘合起来，制成管气路，然后将板粘合起来，制成DeansDeans切切换装置换装置。系统死体积更小，系统死体积更小，毛细柱安装更简便，活性较低毛细柱安装更简便，活性较低 (不锈钢经过硅烷化处理不锈钢经过硅烷化处理)。荫蚊宏额电宰缆爪冯零嘘旱懒僵涡男嘎帆郁备窍商鬃愿怜承躬绩扔著搂曹分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二26 中心切割中心切割GC+GC-应用实例应用实例烟草降烟碱、假木贼碱和新烟碱的手性分析烟草降烟碱、假木贼碱和新烟碱的手性分析(J Chromatogr:B,2008,865:13)浩茎肤都痛道惦轨括寿俐韩豹牧斋涎痢缸后苍诅违坐枕划哪捞腹捣哀款拒分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二27 霍戴稿础禹寞慨载猾兰著椅丢辣胶晴怀苑逞奈奏舶谓滇栽跋绸噶败维鉴粟分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二28 全二维全二维GCGC技术技术全二维气相色谱全二维气相色谱气相色谱作为一种重要的分离分析挥发性和半挥发性有机化合物的工具气相色谱作为一种重要的分离分析挥发性和半挥发性有机化合物的工具,在在石油、化工、地质、环保等领域中得到了广泛的应用。石油、化工、地质、环保等领域中得到了广泛的应用。但是但是,在对组分数多达在对组分数多达几千的复杂体系进行分析时几千的复杂体系进行分析时,传统的一维色谱传统的一维色谱(1DGC)(1DGC)不仅费时不仅费时,而且由于峰而且由于峰容量不够容量不够,峰重叠十分严重。峰重叠十分严重。中心切割式二维色谱中心切割式二维色谱(GC+GC)(GC+GC)等等,只能实现对部只能实现对部分分感兴趣组分感兴趣组分的分离的分离,无法无法对各组分进行准确的定性和定量对各组分进行准确的定性和定量。20 20 世纪世纪90 90 年代初年代初,Liu Liu 和和Phillips Phillips 提出的全二维气相色谱提出的全二维气相色谱(GC(GC GC)GC)方法方法,提提供了一种供了一种真正的正交分离系统真正的正交分离系统。它是将分离机理不同而又互相独立的两支色。它是将分离机理不同而又互相独立的两支色谱柱以串连的方式结合成二维气相色谱谱柱以串连的方式结合成二维气相色谱,经经第第1 1支色谱柱分离后的每一个馏分支色谱柱分离后的每一个馏分,经调制器聚焦后以脉冲方式进入第经调制器聚焦后以脉冲方式进入第2 2 支色谱柱中进行进一步的分离支色谱柱中进行进一步的分离,通过温度通过温度和极性的改变实现气相色谱分离特性的正交化。和极性的改变实现气相色谱分离特性的正交化。GC GC GC GC 具有峰容量大具有峰容量大(为为两根柱各自峰容量的乘积两根柱各自峰容量的乘积)、分析速度快、分辨率高、族分离、分析速度快、分辨率高、族分离等特点等特点,因而该因而该方法在复杂体系的分析方面具有其它方法无法比拟的优势方法在复杂体系的分析方面具有其它方法无法比拟的优势,是是目前色谱领域最目前色谱领域最活跃活跃的研究和应用方向之一。的研究和应用方向之一。GC GC GC GC 具有峰容量具有峰容量:第第1 1支色谱柱峰容量为支色谱柱峰容量为 n1 n1，第，第2 2 支色谱柱峰容量支色谱柱峰容量n2n2，则则GC GC GC GC 理论峰容量为理论峰容量为n1 n1 n2 n2。(J Chromatogr.Sci.,1991,29:227;Trends in Anal.Chem.,2006.25：438;540;726)磊原寝圃矮溶勾郸躲彪惹雏销痢隐动镰擅畴馆曲揪炎摈殆脏险薄涅桔冈恕分离科学与进展专题二分离科学与进展专题二29GC GC的原理的原理试样从进样口导入第一柱试样从进样口导入第一柱(一般为较长或者液膜较厚的非极性柱一般为较长或者液膜较厚的非极性柱),),各化合物根据沸各化合物根据沸点不同点不同进行第一维分离进行第一维分离,然后经然后经调制器聚焦调制器聚焦,以脉冲方式以脉冲方式(区带转移区带转移)进入第二柱进入第二柱(一般一般为较短或液膜较薄的极