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(完整word)核孔的物质进出
核孔的物质进出

核通过一个有双层膜的外被与胞质分隔。内膜与核纤层接触,为核提供了一个表面的膜。外膜与胞质中的内质网连接。这双层膜在被称为核孔复合物（Nuclear pore comlex）的开口处接触.每个复合物的中心都是一个孔，为胞质和核之间提供一个亲水的通道。这就意味着核与胞质具有相同的离子环境。在一个动物细胞的核外被上有~3000个核孔复合物。

核与胞质间的运输以两个方向进行.由于所有的蛋白质都在胞质中合成，所以核内需要的蛋白质必须从胞质转运。因为所有的RNA 都在核内合成，所以胞质所有的RNA（mRNA、rRNA、tRNA 和其他的小RNAs）必须由核内运出.核孔负责物质的输入及输出。

组蛋白是染色质的主要成分,通过它可以了解核孔输入的体积。在分裂细胞中，在DNA 合成期间必须有足够的组蛋白输入到核内与二倍染色体结合。由于组蛋白大约占染色质蛋白质含量的一半,所以我们可以得出结论，每个核孔每分钟必须转运进大约200个染色质蛋白质分子。

对这一过程的不了解以及mRNA 的不稳定使计算mRNA 输出的分子数更加困难，但是每个细胞中的～250,000 个分子的mRNA 很可能需要每个核孔每分钟发生~1 次这样的事件。核内主要合成rRNA，它以组装成核糖体亚基的形式输出。在一个细胞周期中要使核糖体的数量增加一倍，在每个核孔每分钟转运出～5 个核糖体亚基（ 60S和40S)。

核糖体蛋白质首先必须被转运进入核内才能与rRNA结合。所以核糖体蛋白质在进入核内时以游离蛋白质的形式进入,而在输出时以装配好的核糖体亚基的形式输出。每个核糖体有~80 种蛋白质，它们的体积可能与染色质蛋白质的体积相近。

核孔是怎样使有不同大小、不同特点的物质以两个方向转运的呢？用显微镜观察时，发现核孔复合物有相同的形式.用去污剂可使核孔从核上释放出来，它是一个环状结构,包括由8 个轮辐（Spokes)组成的纤毛漏斗结构.8—重对称的基础包括中心结构，周围的辐射臂及内部的转运子.这样的核孔复合物在外部具有一个直径为~120nm 的环。这个环本身含有8个亚基。环外的8个辐射臂可能负责将核孔复合物锚定在核的外被；它们穿过膜。8 个内部的辐从环上伸出,将孔的直径缩小到～48nm.在这个区域以内是转运子，包含一个接近直径小于10nm的圆柱体的孔.

核孔提供了一个穿过核外被中外膜和内膜的通道。侧面以一个与核外被在一个平面的水平轴两折对称。存在外膜和内膜的连接环，包括伸入到胞质和核内的表面，后两者形成中心环(侧面只能看到8 个辐中的2 个)，辐相对于水平轴对称。中心的孔突出,有时在孔内可以看到转运的物质，但不能将这些现象与特定物质的转运等同起来.

核孔复合物的大小同总的分子量〉100×106相对应(与80S 核糖体4×106比较)。8重对称模型和2重对称模型可以辨认出最小重复的成分。这将支架结构分为16 个单元，即每个~6×106 道尔顿。每个单元都必定包含大量独立的蛋白质.中心孔径只是整个复合物的一小部分。

化合物自由穿过核孔的能力受它们大小的限制，为了方便将物质按大小分为三类：

·小于5000 道尔顿的分子注射到胞质后立刻在核内出现：我们可以下结论，核外被对于离子、核苷酸和其他小分子是自由通透的。

·5-50KD 蛋白质的扩散因其大小而异,这主要是由与核孔的随机接触、穿过的过程决定的。注射的蛋白质需要几个小时才能使胞质与核内的水平达到一致.我们可以下结论，小蛋白质通过被动扩散（Passive diffusion)进入核内(但它们也可以被主动运输）.核外被事实上提供了一个能使小于50kD 的物质进入的筛孔或分子筛（Molecular sieve ）。

·大于50kD 的蛋白质不通过被动运输进入核内；它们的转运需要主动运输(Activetransport)。

核孔中类似栅格的结构说明大蛋白质的主动运输和小蛋白质的被动运输是由不同的特点决定的.辐间的孔隙即在外环和内环之间的外周形成8个通道。这是一个刚性的结构。它们是圆形的，直径是~10nm。我们推测这为小蛋白质的被动扩散提供了一个分子筛。一个分子量为50kD 的球形蛋白质如果是完整的，直径就会为~5nm。扩散需要被转运的物质要比筛孔小.

如果通道允许自由的转运，则小于限制体积的物质浓度会在核内和胞质之间达到平衡(尽管，当物质的大小接近筛孔时，平衡会变慢).以这种方式进入核内的蛋白质会滞留在核内，如果它们参与核的一些功能就会积累在核内。例如，如果一个蛋白质整合到一个大的结构例如染色体中，就会使平衡发生改变,从而推动更多的蛋白质进入核内。

中心的孔径用来转运大的物质。通过中心孔的转运需要特定的信号。小的蛋白质也可能通过这种方式转运（也通过外周通道转运),大的蛋白质必须使用主动运输的方式来克服明显的大小限制。但是一个直径超过核孔直径的蛋白质或核糖核蛋白是怎样通过核孔的呢？

核孔转运的特点是通过被核蛋白包被的胶体金颗粒(Gold particle)来研究的。当这些颗粒被注射到胞质中时,它们在核孔处聚集，随后在核内出现。这说明核孔结构能够扩大使像包被的金颗粒(~20nm）这样大小的物质进入。相同的实验说明被核糖核蛋白包被的胶体金颗粒能通过核孔运到核外。

金颗粒的刚性排除了在转运过程中蛋白质改变为另一种直径小于孔径构型的可能性。我们得出结论,核孔具有“门（Gating）”机制，在物质转运过程中能够使内部扩大。转运物质的核孔直径可达20nm 的机制很可能与相机镜头光圈类似。很可能存在两个隔膜，一个与胞质环连接,另一个与核质环上连接，它们在物质通过核孔的过程中相继开启。特别大的物质例如核糖核蛋白颗粒，在转运过程中可能会改变构型使直径小于20nm的限制。核孔复合物为真正负责蛋白质结合及转运入核（或出核)的蛋白质提供了结构上的支架；这并不包括所有在结合及转运过程中涉及到的有活性的蛋白质.关于核孔复合物的一个主要的问题是它们是否都相同，或者是否它们相同的结构掩饰了不同的功能.我们想知道向核的输入及输出是由相同的核孔进行的还是存在不同的核孔。我们需要知道核孔与与其结合的辅助因子在行使功能的过程中都起了什么样的作用。

在胞质与核间的各个方向的转运都有多个通路。所有底物通过特定途径的转运都可以通过饱和一种底物的通路来抑制。至少存在两个不同途径来承担蛋白质的输入；每种类型的RNA都需要不同的系统输出.载体蛋白(Carrier protein)将携带底物通过核孔(载体蛋白必须穿过膜返回在下一个循环中行使功能)。每个载体蛋白质识别其底物的特定序列，也就规定了系统的专一性。

负责核输入最常见的模序被称为核定位序列（Nuclear localization signal，NLS)。在胞质蛋白质中存在这一序列对于蛋白质的核输入是必须的也是足够的.这一序列上的突变可以阻止蛋白质进入核。

在NLS 中没有明显的保守序列；可能这个区域的形状及碱性程度是重要的特点。许多NLS 序列的形式是一段短的、碱性氨基酸序列。经常存
在一个脯氨酸残基来隔断碱性残基上游的α螺旋。疏水残基很少.一些NLS 有两个部分，需要两个分离的短序列，就像在核质中发现的。竞争研究说明NLS 序列可以互换，说明它们都被同一个输入系统识别.

输入过程的开始需要依赖于底物蛋白质NLS 存在的转运系统。由于这个系统的复杂性，不可能在体外进行核孔输入分析,但是通过使用经过透化处理的细胞已经建立起一个有效的系统。当细胞被毛地黄皂苷（Digitonin）处理后，质膜会变为可通透的，但核外被还是完整的.标记的蛋白质可以以一种依赖胞质成分的过程输入到核内。

转运可以分为两步：停留、包括与孔结合和转运，包括穿过孔的过程。在不存在ATP的情况下,带有核输入信号的蛋白质能结合在孔上，但它们停留在胞质面。结合需要一个胞质片段。当存在ATP时，蛋白质可以转运过核孔。转运需要不同的胞质片段。这两个步骤都需要胞质片段更加证明核孔提供了转运的骨架，并不能完成底物转运的所有事件。驻留(Docking)反应依赖于结合底物和核孔的载体蛋白(载体蛋白的种类见图8.36)。一种类型的载体蛋白是含有输入子（Importin)α亚基和输入子β亚基的二聚体.α亚基结合含有NLS 序列的蛋白质。β亚基与核孔结合.其他输入系统使用以单亚基形式作用的载体蛋白质例如输入子β3。在这些情况下，一个单一的蛋白质结合底物和核孔。这些载体蛋白质同输入子β相关,但不需要像输入子α亚基这样的受体来结合底物，即它们能够直接结合底物.

通过核孔的转运可被麦胚凝集素(Wheat germ agglutin)，一种凝集素（糖蛋白质）抑制。核孔中与凝集素（Lectin）结合的蛋白质成分称为核孔转运蛋白（Nucleoporin)。它们定位在中心孔上或附近，似乎在核被膜的两侧都有存在。当去除核孔转运蛋白后，核孔的外观不会发生变化，但不能再转运大的物质。小于孔径的物质还能继续以扩散的形式通过核孔。将核孔转运蛋白再次加入，则核孔恢复了所有的活性。这说明核孔转运蛋白对于大直径物质的主动运输是必要的。一些核孔转运蛋白含有简单的肽链重复基序(GKFG、FG、FXFG)，很可能正是这些基序与输入子β载体蛋白质结合。

支持转运的胞质片段含有两种活性成分.一种是小的ATPase 称为Ran；另一种可能涉及到将Ran 定位在核孔上。Ran 是一种典型的G 蛋白质，既能以结合GTP 的形式存在又能以结合GDP 的形式存在。GTPase 活性产生Ran—GDP，之后需要交换因子将GDP 换为GTP 重新产生Ran—GTP。

核输入受Ran 状态的控制。核内和胞质中的条件不同，一般来说，Ran—GTP 存在于核内，但是Ran—GDP 存在于胞质中。Ran—GTP 的存在使输出复合物稳定，而Ran—GDP 的存在使输入复合物稳定.所以输出复合物在核内形成在胞质分解,而输入复合物则相反。对输入子αβ和含有NLS 序列的蛋白质复合物的反应已经研究的很清楚。在Ran-GDP 存在的条件下，这个三联体复合物很稳定,可以在胞质中形成。然而，Ran-GTP使输入子α与输入子β解离。这导致底物蛋白质在核内释放.

输入子—底物复合物是怎样穿过核孔的呢？核孔转运蛋白在中心孔中是分散的。我们不知道输入子—底物复合物是否连续的穿过核孔,也不知道是否存在一系列的驻留和释放事件，在这些事件中，输入子—底物复合物结合一个核孔转运蛋白、分离、重新结合，沿着核孔结合更远的核孔转运蛋白质，接着重复这一循环。核孔中的位置可以由Ran-GTP/Ran-GDP 梯度来定义，但这种转运似乎不需要ATP 水解，运动所需的能量来源也不清楚。

mRNA 的输出需要与输入类似的条件。酵母中核孔转运蛋白质的突变阻止RNA 的输出，但并不影响蛋白质的输入。这说明可能输入和输出的装置相同，但存在特殊的成分对特定的底物具有专一性。有证据表明输出装置存在着不同;分析非洲爪蟾属（Xenopus) 卵母细胞核内微注射RNA的输出,tRNA、其他的小RNA和mRNA似乎只能使自身的转运达到饱和.这说明至少存在着三种类型的输出RNA.

输出系统与输入系统存在着相同的成分。核输出的主要底物是核糖核蛋白—-核糖体、mRNPs、snRNPs 和tRNA-蛋白质复合物。在前三个例子中,复合物中的一种蛋白质成分可能负责输出(例如，对于snRNAs 就是帽-结合复合物(Cap—binding complex，CBC）).tRNA 直接被一种专一的输出蛋白质结合。

一些蛋白质在特定的环境中从核内输出;例如,cAMP 依赖型激酶（Cyclic AMP—dependent kinase，cAPK）的催化亚基在核内起作用。然而,当抑制亚基(PKI）被激活，就结合在催化亚基上，接着这个二聚体就从核内输出。RNAs 的结合与核内的输出需要一些蛋白质;HIV 中的Rev是一个例子,它可以使特定的RNAs 从核内输出.许多输出蛋白质都有相同类型的信号，这些信号对于蛋白质从核内转运到胞质是必要的也是足够的。它被称为核输出信号 (Nuclear export signal，NES），一般含有~10氨基酸.不同蛋白质NES 的唯一相同特点是具有保守的亮氨酸。NES 与输出子（Exportin)—1 结合，而后者的序列又与输入子β相关。输出子—1 对于U snRNAs、一些蛋白质和可能(一些）mRNAs的输出是必要的。它们结合NLS 基序;结合核孔转运蛋白质；也结合Ran-GTP.复合物在Ran-GTP 存在的条件下形成；GTP 水解变为GDP,同时复合物解体。所以Ran对输出的控制与对输入的控制相反：因为核内Ran-GTP水平较高，复合物在这里形成；它在胞质中变为Ran—GDP，所以复合物在这里解体。

一种蛋白质可能既有NLS 序列又有NES 序列,前者负责它的核输入,而后者负责它的输出.它们可能连续的发生作用，或它们的使用可以被调控，例如，通过结合其他不常见的或暴露相关序列的蛋白质来调控。

为了多次行使功能，输入子必须在将底物送入核内后回到胞质中。事实上，当一个输入子被释放到核内后，它就成为一个输出子的底物!输入子α具有这样的反应,在Ran-GTP 存在的条件下与一种称为CAS 的蛋白质结合。CAS与输入子β的作用方式相同只不过是方向相反。与输出子相似，当Ran—GTP 水解（发生在胞质)，它就与底物(输入子-α)分离。有些蛋白质在胞质与核间“穿梭(Shuttle）”，一些既能在胞质中又能在核内结合poly（A）+ RNA 的蛋白质具有这样的特点.在这样的蛋白质(M9）中负责转运的基序具有一个氨基酸单链，既能作为输入信号又能作为输出信号,所以负责向两个方向的移动.