基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响.pdf

浙江大学学报（农业与生命科学版）49（4）：566 577，2023Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.)http：/ 舟山 316022；2.浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江省海水增养殖重点实验室，浙江 舟山 316021）摘要 为研究大黄鱼（Larimichthys crocea）蛋白质在海水流化冰辅助保鲜期内的变化，采用串联质谱标签（tandem mass tag,TMT）技术定量标记新鲜（贮藏0 d）大黄鱼及不同海水流化冰贮藏时间（7、23 d）下大黄鱼的肌肉蛋白质，筛选出不同贮藏时间下的差异表达蛋白，并对差异蛋白进行基因本体（gene ontology,GO）、直系同源簇/真核生物直系同源簇（clusters of orthologous groups/clusters of eukaryotic orthologous groups,COG/KOG）与京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）分析。结果显示，在3个比较组（7 d vs 0 d、23 d vs 7 d和23 d vs 0 d）中鉴定到的差异蛋白总数分别为215、133、269个，其中表达上调的差异蛋白数分别为117、37、113个，表达下调的差异蛋白数分别为98、96、156个。同时，3个比较组的共有差异蛋白为44个。GO分析表明，差异蛋白主要参与细胞过程、生物调节、细胞和细胞内组分、结合功能和催化活性等方面；COG/KOG分析表明，差异蛋白的功能活性主要集中在细胞骨架、碳水化合物转运和代谢、信号转导机制以及翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白等方面；KEGG分析表明，差异蛋白共参与38条信号通路，且在贮藏后期（23 d），紧密连接和致病性大肠埃希菌感染2条信号通路中差异蛋白的参与数目最多，它们可能是造成大黄鱼新鲜度急剧下降的主要信号通路。44个共有差异蛋白与大黄鱼新鲜度指标进行的相关性分析表明，脆性X智力低下综合征相关蛋白2、肌醇-1-单磷酸酶、Rho GDP解离抑制剂1、锚蛋白-1和甲基四氢叶酸合酶结构域蛋白可以作为新鲜度指示蛋白。本研究为揭示大黄鱼在海水流化冰贮藏期内的品质变化机制、大黄鱼新鲜度评价和保鲜工艺改进提供了依据。关键词 流化冰；大黄鱼；串联质谱标签；差异蛋白；新鲜度指示蛋白中图分类号 S984.1 文献标志码 A引用格式 赵月涵,梅光明,张小军,等.基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响J.浙江大学学报(农业与生命科学版),2023,49(4):566-577.DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.10.211ZHAO Yuehan,MEI Guangming,ZHANG Xiaojun,et al.Tandem mass tag-based proteomics technology analyzing the effects of seawater slurry ice-assisted preservation on muscle proteins of Larimichthys croceaJ.Journal of Zhejiang University(Agriculture&Life Sciences),2023,49(4):566-577.Tandem mass tag-based proteomics technology analyzing the effects of seawater slurry ice-assisted preservation on muscle proteins of Larimichthys croceaZHAO Yuehan1,2,3,MEI Guangming2,3*,ZHANG Xiaojun2,3,XU Dan2,3,ZHENG Bin1,DENG Shanggui1 DOI：10.3785/j.issn.1008-9209.2022.10.211基金项目：国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项（2020YFD0900900）。通信作者（Corresponding author）：梅光明（https:/orcid.org/0000-0002-9267-8112），E-mail：第一作者（First author）：赵月涵（https:/orcid.org/0000-0002-1504-1070），E-mail：收稿日期（Received）：2022-10-21；接受日期（Accepted）：2023-01-10第 4 期赵月涵，等：基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响(1.College of Food Science and Pharmacy,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,Zhejiang,China;2.Zhejiang Marine Fisheries Research Institute,Zhoushan 316021,Zhejiang,China;3.Key Lab of Mariculture&Enhancement of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,Zhejiang,China)Abstract In order to study the changes in muscle proteins of Larimichthys crocea during the seawater slurry ice-assisted preservation period,tandem mass tag(TMT)-based proteomics technology was used to quantitatively analyze the muscle proteins of fresh(stored for 0 d)L.crocea and the samples preserved by seawater slurry ice for different storage times(7 and 23 d).The differential proteins under different storage times were screened out,and they were analyzed by gene ontology(GO),clusters of orthologous groups/clusters of eukaryotic orthologous groups(COG/KOG),and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG).The results showed that the total number of differential proteins identified in the three comparison groups(7 d vs 0 d,23 d vs 7 d,and 23 d vs 0 d)was 215,133 and 269,respectively.The number of up-regulated differential proteins was 117,37 and 113,respectively,and the number of down-regulated differential proteins was 98,96 and 156,respectively.At the same time,a total of 44 common differential proteins were identified in the three comparison groups.GO analysis showed that the differential proteins were mainly involved in cellular process,biological regulation,cell and intracellular components,binding function,and catalytic activity.COG/KOG analysis showed that the functional activities of differential proteins were mainly concentrated in cytoskeleton,carbohydrate transport and metabolism,signal transduction mechanisms and posttranslational modification,protein turnover,and chaperones.KEGG analysis showed that 38 signaling pathways were involved and the number of differential proteins involved in the two signaling pathways of tight junction and pathogenic Escherichia coli infection was the highest at the late storage(23 d),which might be the main metabolic pathways causing the sharp decline in the freshness of L.crocea.The correlation analysis between 44 common differential proteins with the freshness indexes of L.crocea showed that five freshness indicator proteins were screened out,including fragile X mental retardation syndrome-related protein 2,inositol-1-monophosphatase,Rho GDP-dissociation inhibitor 1,ankyrin-1,and methyltetrahydrofolate synthase domain-containing protein.This study provides a basis for revealing the quality change mechanism,the freshness evaluation,and the preservation process improvement of L.crocea during the storage period with seawater slurry ice.Key words slurry ice;Larimichthys crocea;tandem mass tag;differential protein;freshness indicator protein大黄鱼（Larimichthys crocea）属石首科黄鱼属，富含蛋白质、矿质营养元素和脂肪酸等营养物质，其产量近年来稳居海水养殖鱼前列1-2。由于内源性酶和微生物的作用，大黄鱼极易腐败变质，保鲜期较短3。目前市售大黄鱼多采用冰鲜或低温冻藏方式来延长保鲜期。冰鲜通常因采用粒径较大的冰颗粒或冰块，极易造成鱼体破坏，且存在保鲜温度过高、保鲜期过短的缺点。低温冻藏又会造成盐析效应、蛋白质冷冻变性及细胞结构遭冰晶破坏等情况，导致解冻后的大黄鱼品质急剧下降4-5。因此，消费者普遍偏好食用冰鲜大黄鱼。流化冰为直径小于1 mm的微小冰晶与载液组成的固液两相匀浆状混合物，其载冷能力强、终温低且可控6-7；对水产品的机械损伤小；具有隔绝空气、抑制微生物繁殖及脂质氧化的作用8，能有效延长水产品货架期9。因此，流化冰是水产品加工保鲜中极具潜力的绿色新型冷媒。本课题组前期采用微粒冰与海水（质量比为7 3，温度为2.2）制备的海水流化冰体系进行大黄鱼保鲜研究，发现较普通碎冰方式可以将大黄鱼保鲜期延长710 d。目前主要采用感官评价和理化指标分析方法进行大黄鱼新鲜度检测，近年来也应用了近红外光谱等新型无损检测技术10-11。这些技术研究通常都是从水产品腐败的节点入手来表征大黄鱼等鱼类的新鲜程度，较少涉及贮藏期内鱼类蛋白质分子变化及保鲜机制等方面。为进一步探究鱼类新鲜度变化的机制，基于质谱和蛋白质组学的新鲜度研究技术逐渐得到发展。有研究采用蛋白质组学基于高通量质谱分析对生物体内的肽段/蛋白质组成进行鉴定，并结合生物信息学手段与特定的数据库进行比对，以期研究机体内蛋白质水平上发生的变化12-13。近年来，已有不少学者利用蛋白质组学研究大口黑鲈14、中华管鞭虾15、三文鱼16和金枪鱼17等水产品在贮藏期内的新鲜度及品质变化规律。串联质567第 49 卷浙 江 大 学 学 报（农业与生命科学版）谱标签（tandem mass tag,TMT）技术利用特异性化学标记实现对不同样本中的蛋白质同时进行定性和定量分析，具有高通量、高准确性和高分辨率等优点，在蛋白质组学研究中得到广泛应用18。目前大黄鱼在海水流化冰贮藏期内的蛋白质变化机制尚未见报道，本研究通过基于TMT的蛋白质组学分析技术筛选出大黄鱼在海水流化冰不同贮藏时间下的差异表达蛋白，通过基因本体（gene ontology,GO）分析、京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析、直系同源簇/真核生物直系同源簇（clusters of orthologous groups/clusters of eukaryotic orthologous groups,COG/KOG）功能分析以及差异蛋白与大黄鱼新鲜度指标间的相关性分析，预测在海水流化冰贮藏期内大黄鱼的新鲜度指示蛋白，旨在揭示大黄鱼的品质变化机制，为评价大黄鱼新鲜度提供新方法，同时为大黄鱼保鲜工艺改进提供新思路。1 材料与方法1.1 试验材料试验所用鲜活大黄鱼（体长3540 cm、体质量600700 g）于2021年9月在浙江省舟山市半岛水产养殖有限公司的养殖网箱内现场捕获，在充氧洁净海水的条件下快速运输至实验室。采用洁净冰水浸泡并处死鱼体，滤干表面水分后开展后续保鲜贮藏实验。1.2 主要设备与试剂SF03流态冰机（广州科勒尔制冷设备有限公司）；Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪（high-performance liquid chromatograph,HPLC）（美国Agilent公司）；EASY-nLC 1200 液相色谱系统、Q Exactive Plus 质谱仪、Multiskan FC 酶标仪（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；164-5050电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；TMT10plexTM标记试剂盒、甲酸（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；碘乙酰胺（iodo-acetamide,IAA）、尿酸（uric acid,UA）缓冲液、C18 EmporeTM固相萃取圆盘、三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid,TFA）、四乙基溴化铵（tetraethyl ammonium bromide,TEAB）、二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）、氨水、碳酸氢铵（NH4HCO3）、甲酸铵（HCOONH4）（美国 Sigma 公司）；C18固相萃取柱（美国Waters公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）定量试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司）；蛋白裂解缓冲液（上海信裕生物科技有限公司）；SDS、三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethyl aminomethane,Tris）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）生工生物工程（上海）股份有限公司；超微量Ca2+-ATP酶（Ca2+-ATPase）测试盒（南京建成生物工程研究所）。1.3 方法1.3.1 保鲜贮藏采用盐度为30的洁净海水制备海水流化冰体系，含微粒冰70%，冰粒粒径为0.30.6 mm，温度为2.2。将新鲜大黄鱼置于装有海水流化冰的泡沫箱内，使流化冰完全浸没鱼体，加盖密封后置于4 冷库贮藏，持续23 d，每天及时补充流化冰以保持体系中的含冰量。1.3.2 样品前处理分别在试验开始后的第 0（新鲜）天、第 7 天、第23天取样，用于新鲜度指标测定和蛋白质组学分析，每个样品均设置3组平行试验。取大黄鱼背部肌肉组织样品，经搅碎混匀后装入聚乙烯密封袋，于18 条件下保存，用于新鲜度指标分析。另外取0.2 g大黄鱼背部肌肉组织样品，置于2 mL冻存管中，迅速放入液氮速冻3 h，随后转移至65 条件下保存，用于蛋白质组学分析。1.3.3 新鲜度指标测定pH值参照朱海滨等19的方法进行测定，总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）含量参照 食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定（GB 5009.2282016）20中的凯氏定氮法进行测定，硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substance,TBARS）含量参照 食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定（GB 5009.1812016）21中的分光光度法进行测定。鱼类鲜度指数K值参照 鱼类鲜度指标K值的测定 高效液相色谱法（SC/T 30482014）22中的高效液相色谱法进行测定。Ca2+-ATP酶含量按照商品化Ca2+-ATP酶测试盒方法进行测定，配制磷剂、标准磷应用液、粉剂，并依次加入样品，混匀后于室温下静置10 min，在568第 4 期赵月涵，等：基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响660 nm波长下测定吸光度值。肌肉持水力（water holding capacity,WHC）测定参照胡曼子等23的方法，称取 2 g 鱼肉，置于带滤纸筒的离心管内，在4、1 000 r/min下离心10 min，称量后测定肌肉持水力。1.3.4 蛋白质抽提及SDS-PAGE检测参照WINIEWSKI等24的方法，取研磨后的大黄鱼肌肉组织样品加至30倍体积的蛋白裂解缓冲液中，进行蛋白质提取，并采用BCA法进行蛋白质定量分析。各样品取蛋白质20 g，分别加入6倍体积的蛋白上样缓冲液，沸水浴 5 min，进行 12%SDS-PAGE检测（恒压250 V，40 min），用考马斯亮蓝进行染色。1.3.5 过滤辅助样品制备（filter-aided sample pre-paration,FASP）酶解及TMT标记取 200 g 蛋白质溶液，加入 5 倍体积的 TCA/丙酮m（TCA）m（丙酮）=1 9溶液，获得沉淀，用预冷过的丙酮溶液洗涤3次，干燥后加入30倍体积的蛋白裂解缓冲液，超声酶解12 h，加入DTT至溶液浓度为100 mmol/L，充分反应后继续加入IAA和UA至溶液终浓度为11 mmol/L，再加入0.5 mmol/L的TEAB溶液，离心15 min，收集滤液。各样品分别取100 g肽段，利用TMT10plexTM标记试剂盒进行肽段标记。1.3.6 液相色谱及质谱分析将各样品组标记后的肽段充分混合，利用HPLC系统进行分级。流动相A液为10 mmol/L HCOONH4、5%乙腈、pH 10.0，B 液为 10 mmol/L HCOONH4、85%乙腈、pH 10.0，在 214 nm 波长下测定吸光度值。采用EASY-nLC 1200液相色谱系统进行分离，流动相A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（含80%乙腈），分析柱为Acclaim PepMap RSLC（50 m15 cm，300 nL/min）。经色谱分离后用Q Exactive Plus质谱仪进行质谱分析，母离子扫描范围为3501 800 m/z，一级质谱分辨率为70 000，自动增益控制（automatic gain control,AGC）目标为3e6，一级 Maximum IT 为 50 ms，动态排除时间为60 s。1.3.7 生物信息学分析差异蛋白筛选条件为：差异倍数（fold change,FC）1.3或0.77且P0.05，其中FC1.3的差异蛋白为表达上调蛋白，FC0.77的差异蛋白为表达下调蛋白。通过DAVID数据库（http:/david.ncifcrf.gov/）进行差异蛋白的GO分析和KEGG通路富集分析。通过STRING数据库（http:/string-db.org/）和R语言进行差异蛋白的互作网络构建及聚类分析。利用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用独立样品t检验分析统计学差异，P0.05表示差异有统计学意义，P0.01表示差异有高度统计学意义，数据用平均值标准误表示。2 结果与分析2.1 蛋白质提取质量从提取的大黄鱼肌肉蛋白质SDS-PAGE检测结果（图1）可知，各样品中提取的蛋白质条带清晰，样品平行性较好，表明蛋白质的质量较好、浓度较高，提取效果理想，可用于后续蛋白质组学分析。2.2 蛋白质鉴定统计蛋白质酶解后的肽段质谱数据经蛋白质数据库搜索和图谱解析后，共检测到8 748条肽段、1 206个可定量蛋白质。不同序列覆盖度的蛋白质比例如图2A所示，从中可知，45.55%的蛋白质序列覆盖度超过10%。鉴定到的蛋白质所含肽段的数量分布情况如图2B所示，从中可知，94.45%的蛋白质含有20个以内（含20）肽段，74.96%的蛋白质至少含kDa250150100705040352520150 d7 d23 d123112233图1不同贮藏时间下大黄鱼肌肉蛋白质的SDS-PAGE检测结果Fig.1SDS-PAGE detection results of L.crocea muscle proteins under different storage times569第 49 卷浙 江 大 学 学 报（农业与生命科学版）有2个肽段。上述结果表明，鉴定到的蛋白质较为全面，可信度较高。2.3 差异蛋白筛选3个不同贮藏时间下大黄鱼肌肉组织样品中蛋白质表达的两两比较结果如表1所示。7 d vs 0 d、23 d vs 0 d、23 d vs 7 d比较组的差异蛋白总数分别为215、269、133个。结果表明，在海水流化冰贮藏期内，大黄鱼肌肉蛋白质发生了明显变化，且贮藏前7 d内大黄鱼肌肉蛋白质的变化程度可能高于后16 d。如表2所示，3个比较组中有44个差异蛋白为共有差异蛋白，可作为大黄鱼海水流化冰贮藏期内新鲜度变化相关的指示蛋白。0100200300400135226516511796196753923782345691013 1417 182020Number of proteinsNumber of peptides per protein4.11%3.22%4.10%11.51%22.61%54.45%Coverage of sequences/%503040102040502030010AB图2蛋白质序列覆盖度（A）和肽段数量分布（B）Fig.2Coverage of protein sequences(A)and distribution of the number of peptides(B)表1 大黄鱼在海水流化冰不同贮藏时间下的蛋白表达差异Table 1 Differences in protein expression under different storage times of seawater slurry ice of L.crocea比较组Comparison group7 d vs 0 d23 d vs 0 d23 d vs 7 d差异蛋白总数Total number of differential proteins215269133上调Up-regulation11711337下调Down-regulation9815696表2 各比较组中的共有差异蛋白Table 2 Common differential proteins in each comparison groupA0A0H4LDX8A0A6G0HED4A0A6G0HII2A0A6G0HIR4A0A6G0HKE8A0A6G0HLR4A0A6G0HMU0A0A6G0HNM9A0A6G0HPX4Rab5A重组蛋白 Rab5A recombinant proteins肌球蛋白重链 Myosin heavy chain突触足蛋白2 Synaptopodin-2脆性X智力低下综合征相关蛋白2Fragile X mental retardation syndrome-related protein 2肌醇-1-单磷酸酶 Inositol-1-monophosphatase肌球蛋白6 Myosin-6真核翻译起始因子3亚基AEukaryotic translation initiation factor 3 subunit A突触足蛋白2样蛋白 Synaptopodin 2-like protein蛋白质lin-7同源物 Protein lin-7 homolog1.4270.7310.3850.7150.7132.4740.6510.5551.6380.5200.7420.5690.7040.7000.6150.6740.6055.1550.7420.5430.2190.5030.4991.5210.4390.3368.444UniProt登录号UniProt accession No.蛋白质名称Protein name各比较组中差异蛋白的差异倍数Fold change of differential protein ineach comparison group7 d vs 0 d23 d vs 7 d23 d vs 0 d570第 4 期赵月涵，等：基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响2.4 生物信息学分析结果2.4.1 GO分析GO分析分为生物学过程、细胞组分和分子功能3大类。对所鉴定的蛋白质进行GO分析，结果如图 3 所示。从中可知，7 d vs 0 d、23 d vs 7 d、23 d vs 0 d 3个比较组的差异蛋白在生物学过程分类中，均主要参与细胞过程（各占16.22%、16.54%、16.61%）、生物调节（各占12.22%、14.01%、13.30%）、A0A6G0HSL7A0A6G0HUF4A0A6G0HUI7A0A6G0HUT9A0A6G0HWI1A0A6G0HYU6A0A6G0HZ37A0A6G0HZ55A0A6G0I3I9A0A6G0I445A0A6G0I6U9A0A6G0I6X1A0A6G0IAT7A0A6G0ICR0A0A6G0ID35A0A6G0IDI0A0A6G0IFV4A0A6G0IG58A0A6G0IGE5A0A6G0IHT3A0A6G0IKL8A0A6G0IKR9A0A6G0ILN6A0A6G0IM99A0A6G0IQG7A0A6G0IQH0A0A6G0IQL8A0A6G0J0G2A0A6G0J0H5A0A6G0J0J2A0A6G0J0U8A0A6G0J239A0A6G0J3C0A0A6G0J3U5A0A6G0JBI2半乳糖特异性凝集素nattectin Galactose-specific lectin nattectin肌球蛋白结合蛋白C Myosin-binding protein C角蛋白、型细胞骨架13 Keratin,type cytoskeletal 13Rho GDP解离抑制剂1 Rho GDP-dissociation inhibitor 1真核翻译起始因子3亚基GEukaryotic translation initiation factor 3 subunit G黑视蛋白A Melanopsin-A鞭毛内转运蛋白140样蛋白Intraflagellar transport protein 140-like proteinV-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因样蛋白FV-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene-like protein F肌增生素2 Myozenin-2溶质载体家族25成员53 Solute carrier family 25 member 53胶原蛋白-1（X）链 Collagen alpha-1(X)chainHBS1样蛋白 HBS1-like protein14-3-3蛋白/14-3-3 protein zeta/deltaM蛋白 M-protein2，4-二烯酰辅酶A还原酶 2,4-dienoyl-CoA reductase髓鞘相关糖蛋白1B236 Myelin-associated glycoprotein 1B236中性胆固醇酯水解酶1 Neutral cholesterol ester hydrolase 1GTP酶IMAP家族成员7 GTPase IMAP family member 7La相关蛋白1B La-related protein 1B四三肽重复蛋白39C Tetratricopeptide repeat protein 39C谷胱甘肽转移酶 Glutathione transferasePDZ和LIM结构域蛋白5 PDZ and LIM domain protein 5锚蛋白-1 Ankyrin-1蛋白酶体泛素受体ADRM1 Proteasomal ubiquitin receptor ADRM1肌球蛋白结合蛋白H Myosin-binding protein H膜联蛋白 Annexin肌动蛋白解聚因子 Actin-depolymerizing factorDNA结合蛋白RFX7调节因子DNA-binding protein RFX7 regulatory factor赖氨酸-转运RNA连接酶 Lysine-tRNA ligase-蛋白激酶3 Alpha-protein kinase 3甲基四氢叶酸合酶结构域蛋白Methyltetrahydrofolate synthase domain-containing protein肌钙蛋白T Troponin T40S核糖体蛋白S10 40S ribosomal protein S10角蛋白、型细胞骨架8 Keratin,type cytoskeletal 8角蛋白、型细胞骨架50 Keratin,type cytoskeletal 500.1930.3470.6930.7460.4940.2610.4151.8740.4880.3883.0390.4972.0584.6052.2021.7852.0830.3420.5151.5051.8420.2680.7400.4512.0851.4310.5621.3170.7270.6000.7680.5710.6650.3820.4131.4060.6980.7140.6300.3960.7670.4392.0040.5910.4080.2420.5320.6580.5470.6921.5840.7340.1420.5321.8810.7290.4640.7440.2930.6931.4380.5260.4250.6840.5950.6940.7660.7530.2570.2420.2710.2420.4950.4700.1950.2000.1823.7550.2880.1580.7350.2641.3542.5211.5252.8281.5300.0480.2742.8301.3420.1240.5510.1321.4452.0580.2960.5600.4970.3570.5330.4370.5010.0980.100表2（续）Continuation of Table 2UniProt登录号UniProt accession No.蛋白质名称Protein name各比较组中差异蛋白的差异倍数Fold change of differential protein ineach comparison group7 d vs 0 d23 d vs 7 d23 d vs 0 d571第 49 卷浙 江 大 学 学 报（农业与生命科学版）进化过程（各占11.22%、10.51%、10.55%）和多细胞有机体过程（各占10.89%、10.70%、10.64%）；在细胞组分分类中，均主要分布在细胞（各占41.15%、40.61%、40.08%）、细胞内（各占40.63%、39.30%、39.47%）和富含蛋白质复合物（各占18.23%、20.09%、20.45%）中；在分子功能分类中，均主要参与结合（各占48.44%、46.88%、50.15%）和催化活性（各占28.52%、23.75%和23.21%）。结果表明，海水流化冰贮藏期内大黄鱼肌肉蛋白质主要在细胞过程、生物调节、细胞及细胞内组分、结合功能及催化活性等方面发生了变化。2.4.2 COG/KOG功能分析如图4所示，海水流化冰不同贮藏时间下的大黄鱼肌肉差异蛋白共参与23种COG/KOG功能，按功能主要分为信息存储和处理、细胞过程和信号及代谢等25。7 d vs 0 d、23 d vs 7 d和23 d vs 0 d 3个比较组的差异蛋白功能均主要集中在细胞骨架（各占18.78%、16.07%、20.00%），碳水化合物转运和代谢（各占15.47%、8.04%、11.74%），信号转导机制（各占13.26%、13.39%、11.74%），翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白（各占9.39%、11.61%、11.30%），其他（各占8.29%、9.82%、6.52%）和翻译、核糖体结构和生物合成（各占4.97%、9.82%、7.83%）。此外，由图4可知，同贮藏前期（7 d）相比，贮藏后期（23 d）差异蛋白参与的功能中新增了细胞周期控制、细胞分裂和染色体分区以及复制、重组和修复，但剔除了RNA加工和修饰、核结构以及核苷酸转运和代谢。2.4.3 KEGG富集分析KEGG作为已知分子间相互作用的信息网络，可以对某种基因或基因产物进行整体和系统性的研究分析。利用KEGG数据库分析在海水流化冰不同贮藏时间下大黄鱼的差异蛋白显著富集的通路发现，共涉及38条信号通路，其中，11条信号通路在3个比较组中均被显著富集（表3）。在7 d vs 0 d比较组中，差异蛋白参与最多的通路依次为糖酵解/糖异生、碳代谢、胰高血糖素信号通路、氨基酸的生物合成以及磷酸戊糖通路；在23 d vs 7 d比较组中，上述通路均未有差异蛋白参与，差异蛋白仅参与了致病性大肠埃希菌感染、紧密连接、胰岛素抗性以及淀粉和蔗糖代谢通路；23 d vs 0 d比较组中，参与致病性大肠埃希菌感染、紧密连接通路的差异蛋白数目也最多。上述结果表明，在海水流化冰贮藏后期（23 d），大黄鱼品质下降可能与致病性大肠埃希菌感染、紧密连接通路的