世界针灸论文译文-短期穴位磁疗干预2型糖尿病肾病的作用及其分子机制探讨大学论文.doc

短期穴位磁疗干预2型糖尿病肾病的作用及其分子机制探讨周子瑜#1, 任丽伟#1，杨含艳1, 刘继章2, 褚克丹1, 翁建平2于志文1*1. 福建中医药大学生物医药研发中心,福州 350122,中国;2. 中山大学第三附属医院内分泌科,广州510000,中国摘要目的：探讨穴位磁疗法是否能够延缓糖尿病肾病DKD的发展，并研究这一治疗作用的分子机制。方法:对28名2型糖尿病(T2D)患者在脾俞（BL 20）、足三里(ST 36)、肾俞(BL 23)和胰俞等穴位进行为期4周的脉冲磁疗干预，以病人尿微量白蛋白排出量、血浆丙二醛含量和脂多糖水平作为评价疗效的指标。结果：磁疗干预后,病人尿微量白蛋白排出量较干预前明显下降(27.213.51和8.510.95,P 0.001)，血浆丙二醛明显降低(MDA,16.461.17 vs 12.401.86,P 0.05)和脂多糖水平明显下降(LPS,37.413.84 vs 21.633.61,P 0.05)，而其它代谢相关指标没有明显变化；磁疗法干预能够升高IB炎症信号抑制蛋白含量(0.691.17 vs 1.300.29, P 0.01)，并相应地降低炎症激活蛋白NF-Bp65(0.980.42 vs 0.430.28, P 0.05)和NF-Bp50(1.190.40 vs 0.760.30, P 0.05)的含量，磁疗法干预还能够抑制氧化酶Nox4(1.320.40 vs 0.370.23, P 6.5.1.3纳入标准符合上述糖尿病诊断标准者；愿意接受临床疗效观察且病人知情同意者。1.4排除标准不符合上述诊断标准及纳入标准者；排除1型糖尿病和由于其它急性感染、外伤、手术或明显应激情况引起的符合上述诊断标准的患者及妊娠期、哺乳期女性；治疗期间改变原服用药物及服用抗氧化剂患者，及曾接受其他相关治疗有可能影响本研究疗效观察者；未能按规定试验方案配合治疗，自行退出、无法随访、资料不全或其他原因无法观察疗效者。2.磁疗仪器采用可用于人体的PEMF治疗仪(YX-200磁疗仪，专利号No.CN200610036313.8,佛山玉玄宫,中国)磁疗仪主要包括PEMF发射器，漆包线构成的线圈软磁导磁材料，线圈和导磁材料置于绝缘外壳中组成治疗头（图1）。发射器发射独立、单个、方形脉冲波，频率为1HZ，波持续时间为25ms2ms。3.取穴及操作方法取脾俞（BL 20）、足三里(ST 36)、肾俞(BL 23)和胰俞等穴位16，将磁疗头放于相应穴位上，以1.2T 120mT的磁场强度，每个穴位10分钟，每日两次，持续治疗4周。在磁疗干预期间，患者继续保持原有药物治疗。Table 2. TheMedication of T2D patients (n=28)Patient No.Medication(Dosage)1Metformin(1g/day) and Glimepiride(2mg/day)2Metformin(0.75g/day),Acarbose(50mg/day) and Pioglitazone Hydrochloride(25mg/day)3Gliclazide(80mg/day) and Pioglitazone Hydrochloride(15mg/day)4Insulin(23U/day) andGliclazide(100mg/day)5Insulin(20U/day)6Insulin(33U/day)7Insulin(21U/day) andMetformin(1g/day)8Metformin(0.75g/day) andGliclazide(100mg/day)9Metformin(1g/day) and Gliclazide(80mg/day)10Insulin(19U/day)11Insulin(29U/day) andAcarbose(100mg/day)12Insulin(51U/day)13Glimepiride(2mg/day) and Pioglitazone Hydrochloride(25mg/day)14Insulin(23U/day)15Insulin(13U/day)16Insulin(32U/day)17Insulin(2U/day)18Insulin(20U/day) and Acarbose(50mg/day)19Acarbose(100mg/day)20Insulin(35U/day)21Insulin(19U/day) and Glimepiride(3mg/day)22Insulin(31U/day)23Insulin(29U/day)24Insulin(35U/day)25Insulin(18U/day)26Insulin(28U/day)27Insulin(37U/day)28Glimepiride(2mg/day) and Metformin(1.25 g/day)4.指标检测采用病例自身前后对照法评估穴位磁疗干预的治疗作用。4.1 疗效指标检测尿微量白蛋白（U-mAlb）分析收集夜尿于同一清洁容器中，用Quik Read U-mAlb酶联免疫(ELISA)试剂盒（Orion DiagnosticaOy, Espoo, 芬兰）依照说明书分析U-mAlb含量。大于20mg/L 视为不正常。代谢评估按报道方法采集病人磁疗干预前后空腹血液31。血糖(FBG)、胰岛素(INS)、C肽(C-P)、甘油三酯(TG),总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)等在临床检验室分析检测。4.2 机制指标检测通过丙二醛（MDA）含量检测，观察机体的氧化应激水平；通过蛋白免疫印迹技术（Westen Blot）检测相应的炎症信号蛋白，如IB、NF-B p65和NF-B p50等，氧化酶Nox4及Nrf2抗氧化系统信号蛋白等。丙二醛（MDA）测定用MDA试剂盒(南京建成公司，南京，中国)测定血浆MDA含量，操作遵循说明书进行。LPS 分析用LPS ELISA试剂盒(CUSABIO，武汉，中国)测定血浆LPS含量，操作遵循说明书进行。淋巴细胞分离和蛋白免疫印迹分析采用血淋巴细胞提取试剂盒(上海科华生物工程，上海，中国)通过密度离心分离提取淋巴细胞。依据报道方法进行淋巴细胞蛋白制样和蛋白免疫印迹分析32。抗体NF-B p65，NF-Bp50,Nox4,Nrf2和GAPDH购自Santa Cruz (上海,中国)。抗体IB, SOD1和SOD2购自Proteintech (广州,中国)。抗体HO-1,NQO-1,Bax和Bcl-2购自Cell Signaling (广州,中国)。抗体caspase-3,caspase-8购自Sangon Biotech (上海,中国)。5. 统计方法所有数据都表示为平均值标准误差(SEM)。采用paired-sample T Test或方差分析, p 0.05被认为具有统计学意义。结果1、 穴位磁疗能有效降低T2D病人尿白蛋白排出，但不改变病人血糖水平。如图2所示磁疗干预前病人U-mAlb含量为27.213.51 mg/L,而经过四周的磁疗干预后的U-mAlb大幅减少到8.500.95 mg/L(约减少70%,n = 28,p 0.001)。为了评估磁疗是否能改变肾脏功能,我们检测了血液中肌酐含量并计算肌酐清除率这一肾功能指标,发现并没有改变。为了确定病人的代谢功能是否改变以及它与磁疗延缓DKD的相关性,我们检测了患者的代谢功能指标。如表2所示病人在磁疗干预后FBG和血脂包括TG,TC均未改变，仅血LDL-C含量下降。Table 3. Effects of Acumagnetotherapy on blood glucose and lipid levels (n=28)Magnetic therapyBeforeAftert-valuep-valueBG (mmol/L)7.980.468.100.550.74NSINS (mU/L)14.982.1316.752.251.13NSCP (ng/mL)2.040.152.100.180.93NSTC (mmol/L)5.810.265.650.250.80NSTG (mmol/L)1.860.201.780.180.87NSHDL-C (mmol/L)1.430.071.440.080.90NSLDL-C (mmol/L)4.020.262.930.133.58*2、 穴位磁疗调节T2D病人血淋巴细胞中氧化还原平衡，并抑制ROS合成酶表达。我们测量病人血浆MDA水平以反映其氧化还原状态。观察到磁疗干预后患者血浆MDA水平降低(约减少30%,前:16.461.17 vs后:12.401.86,n = 6,p 0.05,图3)。增加ROS产生或清除能力能够影响氧化还原平衡。为进一步探索磁疗抗氧化作用的潜在机制,我们提取患者血淋巴细胞，用蛋白免疫印迹法检测ROS合成酶Nox4和Nrf2抗氧化系统蛋白表达情况。我们观察到在磁疗干预后Nox4蛋白含量明显降低(前:1.320.16 vs后:0.380.09,n = 6,p 0.05,图3 b)，而Nrf2抗氧化系统（包括NQO-1，HO-1）并未同时改变(图3 c和D)。3 、穴位磁疗减少T2D病人血LPS水平，抑制血液淋巴细胞中炎症信号。关于磁疗是否能够影响炎症系统，我们检测了血浆LPS水平这一炎症指标，并观察到磁疗干预能够降低炎症水平(约减少45%,前:37.413.84 vs后:21.633.61,n = 6, p 0.05,图4)。为检测磁疗对炎症的潜在信号机制,我们检测了NF-B抑制蛋白IB的含量,发现在淋巴细胞中磁疗明显增加其蛋白含量表达（前:0.690.14 vs后:1.300.12,n = 6,p 0.01,图4 b和C)。此外,NF-B的两个亚结构, NF-B p65和NF-Bp50，在磁疗干预后含量减少 (图4 b和C)。4 、穴位磁疗抑制T2D病人血淋巴细胞凋亡蛋白信号表达。氧化应激和炎症可以引起细胞损伤和凋亡,这密切参与DKD病程的发展。外源性和内源性凋亡刺激均可激活凋亡蛋白caspase-8和3的表达。为了评估细胞凋亡过程能否被磁疗干预改变,我们检测了caspase-3和caspase-8的蛋白水平，并发现磁疗干预后蛋白表达减少(图5 A和B)。而与此相应的，促凋亡蛋白Bax被显著抑制约50%(前:0.240.02 vs后:1.300.01,p 0.05,图5 A和B)，然而抗凋亡蛋白Bcl-2含量并未改变。讨论中医对早期DKD辩证认为脾肾亏虚，瘀阻肾络是该病病机关键，治则当以健脾益肾为基本大法。本研究所选肾俞、脾俞、胰俞均为脏腑经气输注于腰背部的背俞穴，是内脏器官生理、病理状态在体表机能的感应点。肾俞具有滋阴补肾、培补元气作用；脾俞、足三里健脾益气；胰俞是治疗糖尿病的特定奇穴。诸穴合用，具有健脾益肾、益气养阴之功效，为早期DKD的主要治疗穴位16, 17。本研究主要发现在脾俞、足三里、肾俞、胰俞等穴位进行为期四周的PEMF磁疗干预能够显著降低T2D病人U-mAlb排泄，同时显著减少患者血浆MDA和LPS水平。因此，从磁疗方法角度深化了对针灸穴位治疗DKD机理的认识。由于良好的代谢控制有利于预防和延缓包括DKD在内的糖尿病并发症进程3, 33，而短期磁疗不影响代谢控制，说明磁疗干预延缓DKD发展的有利作用可能独立于对机体代谢控制，而与它的抗氧化和抗炎功效有关。想直接获得磁疗对DKD的作用的信号机制,最好的办法是进行肾活检。然而这个理想的实验方法由于对患者肾组织存在一定的侵入损伤性，不易被患者接受。因此,我们退而求其次选择提取患者血淋巴细胞这一简单可行的方法来研究磁疗的分子信号基础。我们在血淋巴细胞的结果表明磁疗干预调节氧化还原平衡主要通过抑制ROS产生而非加强抗氧化系统能力，因为ROS合成酶Nox4蛋白表达明显降低，而与此同时Nrf2抗氧化系统没有明显激活。在过去的报道中已表明了Nox4参与DKD进展的重要性6, 10。Nox4作为主要的ROS合成酶能够导致初期DKD的一些病理性病变6。更重要的是,目前已在体内和体外实验中证明使用Nox4抑制剂或进行Nox4基因沉默能够阻止DKD的发展9, 10。我们的结果显示磁疗在淋巴细胞对Nox4蛋白的抑制效果明显，这提出一种可能性,即在患者的肾组织中，磁疗干预可能存在类似的分子机制通过抑制肾组织氧化应激以对机体有利。当然在肾组织中的这种情况仍需要进行进一步的研究。由于氧化应激与炎症激活导致的肾细胞凋亡和蛋白尿等功能变异密切相关11, 28，所以我们非常有兴趣观察磁疗对细胞炎症信号和凋亡过程的改变。我们观察到PEMF治疗后病人淋巴细胞中炎症和凋亡信号蛋白均受抑制(图3和4)，与此同时, 患者血浆LPS水平显著减少(约45%)29, 34。血中LPS是炎症激活的一个重要媒介，它通过与位于细胞表面的Toll样受体结合激发炎症过程,那么减少血液LPS水平可衰减炎症反应，进一步改善肾损害。而我们的数据表明,磁疗干预可以保护T2D患者抵抗氧化应激和炎症引起的损伤和细胞凋亡。目前,很难进一步说明PEMF如何影响氧化还原平衡和炎症过程，由于磁疗对信号通路的整体机制还尚未清楚21。几项研究表明磁疗能够调节细胞脂质双分子层和离子通道极性21, 35。膜极性变更后能影响位于膜脂质载体上蛋白和作为第二信使调节离子通量的信号蛋白的交互作用，进而调节信号转导21, 35。当然磁疗调控的膜极性和离子极性与我们研究中的分子和信号改变是否有因果联系，仍需要进一步的研究探索。作为一种非侵入性和相对安全的替代方法,磁疗法在临床上已经被用于治疗多种疾病, FDA已证明其能够治疗抑郁症36。我们的数据显示它与穴位结合能够显著减少糖尿病患者U-mAlb排泄以预防DKD进程，这提高了其临床应用价值。此外,由于氧化应激和炎症都是糖尿病并发症发展的病因学因素,磁疗可能在其他糖尿病并发症上有更广泛的治疗意义。 总之,目前我们研究表明,短期穴位磁疗能够减少T2D患者尿白蛋白排出,机理可能通过降低LPS水平下调炎症信号以抵抗氧化应激，这为其在预防DKD的临床应用上提出依据。感谢该工作部分由于志文教授的中国自然科学基金支持 (编号：81270886)。我们感谢李盺和陈礼仪帮助提取淋巴细胞。利益冲突作者宣称关于出版没有利益冲突。