课程论文--PsSERKcDNA全长的克隆.doc

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青 岛 农 业 大 学

本 科 生 课 程 论 文

题 目: PsSERK1cDNA全长的克隆
姓 名: 胡鹏
学 院： 生命科学学院
专 业： 生物科学专业
班 级： 生物科学2009级2班
学 号： 20092839
指导教师: 张玉喜
完成时间： 2012-9—21

2012 年 9 月 21 日

课 程 论 文 任 务 书

学生姓名 胡鹏 指导教师 张玉喜
论文题目 牡丹PsSERK1cDNA全长的克隆
论文内容(需明确列出研究的问题） 通过实验确定牡丹cDNA的位置，进行提取并进行基因克隆,进一步研究该基因

三、 资料、数据、技术水平等方面的要求：根据需要查阅大量与基因克隆有关的文献，特别是关于cDNA方面的参考文献，了解大量与基因克隆相关的知识和信息,并且通过图书馆数据库了解到基因克隆技术的相关性国内外最新信息。

发出任务书日期 2012-9-18 完成论文日期 2012-9—21
教研室意见（签字）

院(部）院长意见(签字）

牡丹体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶PsSERK1cDNA全长的克隆
生物科学专业2009级2班 胡鹏
指导教师 张玉喜

摘要:体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶通过对牡丹花中具有典型的胞外结合域、跨膜结构域和胞内激酶域结构， 能独立完成信号的接收、跨膜转化及向胞内传递，参与植物发育、激素感应和病理反应等， 在植物生命活动中起多种作用。利用RACE扩增了牡丹PsSERK1cDNA全长cDNA，对于深入理解其分子功能具有重要的理论意义和实践价值。
关键词：基因克隆; 序列结构； 氨基酸序列

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr。）是芍药科、芍药属的落叶灌木, 是我国特有的木本名贵花卉.牡丹花大色艳、雍容华贵、富丽端庄、芳香浓郁， 而且品种繁多， 素有“国色天香”、“花中之王"[1］的美称， 长期以来被人们当做富贵吉祥、繁荣兴旺的象征.中国牡丹从野生引入观赏栽培， 已有1650年左右的历史。牡丹有很高的观赏价值和经济价值, 不仅能给人带来享受, 而且根皮可以入药， 有清热、凉血、活血等功能， 常作镇痛、镇静良药[2]。另外， 花蕊可以提炼香精［3］。目前牡丹作为我国重要的出口创汇花卉其需求量日益增大.另外, 为供应不同节日（如春节、元旦）的观赏需要, 大量的牡丹用于反季节催花特别是春节催花， 全国每年用于冬季催花的牡丹超过200万株, 年创产值2亿元以上[4]。
牡丹花期短, 且花期相对集中， 只在每年4～5月间开花, 远远不能满足人们观赏的需要［5］。牡丹花凋谢后, 枝条基本停止伸长生长, 芽逐渐形成， 芽的外面出现“芽鳞”, 这种“芽鳞"是一种保护性结构， 用以度过低温、干旱的冬季.11月下旬牡丹基本停止生长进入深休眠［7］。温度对芽的休眠具有质的作用， 牡丹进入自然休眠期后需要一定的低温期才能解除休眠［8], 研究认为低温5~8 ℃打破休眠最为有效。牡丹的催花技术可使牡丹在春节期间盛开, 并且利用冬季的自然低温, 延长牡丹花期， 大大提高了牡丹的经济价值和社会效益， 春节反季节催花已成为一种时尚潮流.其过程可以分为催花植株的选择和栽植、解除休眠、合理调控温度、湿度、光照以及肥水管理等环节, 其中解除休眠是牡丹催花启动的关键［6]。但由于不能正确掌握牡丹的生态习性、开花生物学特性及催花过程中的生理生化变化规律， 特别是对牡丹花芽内休眠解除机理的认识不足, 往往不能彻底打破花芽内休眠, 致使花蕾发育不良, 造成开花不正常、有花无叶、花小叶小、花期短甚至催花失败[4］, 花农损失惨重, 严重制约了牡丹产业的发展。因此, 深入理解牡丹内休眠调控机理, 对于其春节催花具有重要指导意义。个人收集整理,勿做商业用途本文为互联网收集,请勿用作商业用途
植物中存在一类与动物受体蛋白激酶（receptor protein kinase， RPK）结构类似的激酶, 称为类受体蛋白激酶(receptor-1ike protein kinase, RLK).自1990年Walker和Zhang[66］用PCR方法从玉米中克隆出第1个RLK基因以来， 10多年时间里已从多种植物中分离了大量RLK 基因, 仅在拟南芥基因组中就已鉴定出超过400种可能的RLK基因。根据胞外结构， 这些基因编码的蛋白分为不同的类型, 其中, 富亮氨酸重复类受体蛋白激（leucine—rich repeat receptor—like protein kinase， LRR—RLK)是其中最大的一类.LRR—RLK 具有典型的胞外结合域、跨膜结构域和胞内激酶域结构, 能独立完成信号的接收、跨膜转化及向胞内传递， 参与植物发育、激素感应和病理反应等, 在植物生命活动中起多种作用[67-69].近年来, 对SERK 基因的结构、功能、表达和信号转导等进行了较为深入的研究。
1997年， Schmidt等［70］在胡萝卜（Daucus carota）下胚轴胚性细胞培养物中分离出的一段cDNA 克隆也编码一种LRR-RLK, 因为它首先在体胚发生过程的胚性单细胞中表达, 所以命名为体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶 (somatic embryogenesis receptor—like kinase， SERK)基因。此后，相继又在多种植物中克隆和表达了SERK 。随后又在拟南芥（Arabidopsis thaliana）［71]、玉米（Zea may)［72］、苜蓿（Medicago truncatula)［73］。目前， 已发现拟南芥基因组有5 个AtSERK （ AtSERK1 、AtSERK2 、AtSERK3 、AtSERK4 和AtSERK5）， 其中, AtSERK2~5 是在细菌人工染色体文库(bacteria artificial chromosomes, BACs)上找到的4 段序列, 由于它具有AtSERK1的结构特征， 也命名为AtSERK[71]。玉米基因组至少有3 个SERK 成员， 即ZmSERK1、ZmSERK2和ZmSERK3， 其中， ZmSERK1、ZmSERK2 是用胡萝卜和拟南芥SERK 的简并引物（degenerate primers）进行基因组和cDNA 筛选过程中发现的， ZmSERK3 则是在上述两者表达分析过程中获得的一段cDNA 克隆[ 72 ］。MtSERK1 是在苜蓿高胚性种系（highly embryogenic seed line） 2HA培养了2周的培养物中克隆出的， 目前苜蓿中只克隆出MtSERK1［73］。至今, 美国国立生物技术信息中心（NCBI）已接受40多个有关SERK 基因的序列注册(http：//www。ncbi。nlm。nih。gov/）。所有这些基因组成了一个SERK 基因家族。文档为个人收集整理,来源于网络文档为个人收集整理，来源于网络
到目前为止, 科学家们已经从向日葵(Helianthus annuus )[74] 、鸭茅（Dactylis glomerata）[75]、可可（Theobroma cacao)[76］、蜜柑（Citrusunshiu）[77]、草地早熟禾（Poa pratensis)[78]等植物中分离到不同的SERK 基因。SERK 基因广泛地存在于双子叶植物、单子叶植物及裸体植物中， 组成一个新基因家族.研究PsSERK1的分子功能, 对于揭示芽内休眠机理， 人为调控花期， 保证反季节催花的成功， 具有重要的理论意义和实践价值。

1 材料与方法
1。1牡丹花芽总RNA的提取及检测
1。1。1 总RNA提取
(1）RNA 提取所用的塑料、玻璃器皿处理和试剂配制均按《分子克隆实验指南》（第三版）进行去除RNase处理.
（2)称取2 g 牡丹花芽在液氮中研磨至粉末状， 期间不断缓慢倒入液氮防止材料解冻。
(3）待液氮刚刚挥发完全时, 迅速将材料转移至盛有15 ml 65 ℃预热的CTAB提取液（含2％的b-巯基乙醇）的大离心管中, 涡旋震荡30—60 S, 使材料均匀分散在提取液中， 65 ℃温浴30 min， 期间晃动3-4次。
（4)每管加入15 ml氯仿：异戊醇(24:1）， 涡旋混匀, 室温, 10000 rpm，离心15min.
（5）取上清， 转移到另一新的无RNase的离心管中, 加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1）， 再抽提一次。
（6）取上清, 转移到另一新的无RNase的离心管中, 加入等体积的4 M LiCl, 使其终浓度为2 M, 4 ℃过夜.
（7)4 ℃， 10000 rpm， 离心30 min。
（8)弃上清， 沉淀用分别用1 ml 70％乙醇和1ml无水乙醇清洗一次。
（9）加入500 ml SSTE溶解沉淀， 并将其转移至一无RNase的1。5 ml的离心管中, 加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）， 4℃， 12000 rpm， 离心10 min.
（10）取上清， 转移至一新的无RNase的1.5 ml离心管中, 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）再抽提一次。
（11）取上清， 转移至一新的无RNase的1。5 ml离心管中， 加入1/10体积3M NaAc（pH5。2）和2倍体积的无水乙醇， -20 ℃放置2 h。
（12)4℃, 13000 rpm， 离心20 min， 弃上清, 沉淀用500 ml 70％乙醇和500 ml无水乙醇分别清洗一次， 干燥后， 加入400 ml RNase-free ddH2O溶解沉淀.
（13)定量：取1 ml RNA稀释10倍, 用蛋白核酸定量测定仪(Spectrophotometer ND—1000型）测定RNA的纯度及浓度。
定性：取1 ml（约5 mg)稀释后的RNA， 加入1/4 V的5× RNA loading buffer, 在1。2%的甲醛变性胶上， 1×MOPS buffer, 电泳, 检测其完整性的.
1。1。2总的RNA检测
（1）1.2%凝胶制备:0.36 g琼脂糖加入0。6 ml 50×TAE, 加DEPC—和H20至总体积30 ml， 微波炉加热溶解冷却至65 ℃加入溴化乙锭（EtBr， 浓度1。0 mg／ml）灌胶。
（2）加样：总的RNA取出部分稀释10倍， 1体积Loading Buffer 加4体积稀释后总RNA样品混匀， 加样。
（3）电泳:1×TAE,5-7V／cm，电泳30 min。
（4）观察拍照:紫外灯下观察RNA带型。
1.2 去除基因组DNA
（1）每400ml RNA溶液中加入
RNase Inhibiter 3 ml
Dnase I 5 ml
10Rnase –free Dnase Buffer 50 ml
DEPC—H2O 42 ml
37 ℃， 水浴30 min。
（2)加入等体积的水饱和酚， 4 ℃， 12000 rpm， 离心20 min。
(3)取上清, 加入等体积氯仿：异戊醇(24：1）, 抽提一次.
（4)取上清, 加入等体积氯仿:异戊醇（24:1), 再抽提一次.
(5）取上清, 加1/10体积的3 M NaAc(5。2)和2。5倍体积的无水乙醇， —20 ℃, 沉淀1 h。
（6）4 ℃, 13000 rpm, 离心20 min, 弃上清， 沉淀用500 ul 70％乙醇和500 ul无水乙醇分别清洗一次, 干燥后， 加入适量的Rnase-free ddH2O溶解沉淀。
(7）取约5ugRNA在1。2％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA是否去除干净.
1.3牡丹花芽RNA的反转录
（1）取休眠芽和解除休眠花芽mRNA各0.2g， 在两个0。5 ml灭菌的PCR管中分别加入以下成份：
mRNA 4 ml
cDNA Synthesis Primer 2 ml
总体积 6 ml
混匀, 轻甩离心管， 使溶液至底部.
（2）将离心管置于PCR仪内, 70 ℃， 孵育10 min.
（3）冰上冷却2 min， 轻微离心， 使溶液置于管底。
（4）向两管中分别加入下列成份：
5×M-MLV buffer 2 ml
dNTP Mix （2。5 mM) 4 ml
Rnase Inhibitor（40 U/ul） 4 ml
Reverse Transcriptase M-MLV (200 U/ml） 1 ml
加RNase—free H2O 至 20 ml
(5）轻微震荡混匀后短暂离心。
（6）置于42 ℃空气温箱中孵育60 min。（不要用水浴或PCR仪， 蒸发可能减少混合液的体积， 降低反应效率）。
（7）70 ℃保温15 min后， 将微量离心管置于冰上终止cDNA第一链合成并立即开始第二链的合成或PCR扩增.
1。4 RACE扩增全长PSERK1 cDNA
1。4。1 特异性引物的设计
按照SMART RACE cDNA synthesis Kit说明书中对PCR引物的要求(23-28nt， 50—70％GC, Tm≥65℃）, 根据黄鑫对PsSERK1的部分测序结果， 选择合适的位置, 设计特异性引物, 分别扩增5'和3’端的基因序列.
从5’端扩增特异性引物: 5’—CGAAGAAAACGCAGCCTTGTCAGC-3’
从3’端扩增特异性引物： 5’—CTGACAAGGCTGCGTTTTCTTCGGC—3’
1.4.2 RACE—Ready—cDNA的文库建立
(1） 将五个时期的RNA混匀， 总浓度389。886 ng/ml。
（2）加入2 ml 5×Firster—stand Buffer，然后再加入1 ml DTT和1 mldNTPMix（10 mM）， 共4 ml， 混匀。
（3）5’—RACE—Ready—cDNA：加入2。75 ml RNA和5'—CDS-PrimerA;
3’—RACE—Ready-cDNA：加入3.75 mlRNA和3’-CDS-PrimerA 。
（4）将上述溶液用移液器混匀.
(5）将混合液放入72 ℃水浴3 min, 然后再将其移入42 ℃水浴2 min。
（6）cDNA加入1 mlSMARTer。ⅡAoligo。
（7）将步骤1 4 ml分别加入Rnase Inhibitor 0。25ul和Renerse Transcriptase 1 ml。
（8）加入步骤7到步骤6中混匀到10 ml。快速离心收集。
(9）42℃水浴锅中90 min。
（10）然后将其转到70 ℃水浴锅中， 10 min。
(11)加100 ml Tricine—EDTA Buffer到步骤10中。
1.4.3 RACE—PCR扩增全长cDNA
（1）Master Mix的成分
PCRWater 34。5 ml
10×BDAdrantage2×PCR 5 ml
dNTPMiX（10 mM） 1 ml
50×BDAdvantage merasm 1 ml
总体积 34。5ml

（2)RACE反应体系：（50 ml体系)
RACE-Ready—cDNA 2。5 ml
UPM 2.5 ml
Gsp5’ 1 ml
Gsp3’ 1 ml
Master Mix 34.5 ml
总体积 50 ml
（3）RACE扩增反应条件：(温度梯度PCR, Touchdown PCR）

94℃
5min

5 cycles
94℃
30sec
70℃
30sec
72℃
3min

30cycles
94℃
1min
65℃
1min
72℃
1min

4℃
Forever
（4）1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1。4.4 目的片段的回收
将上述扩增产物经1。2%琼脂糖凝胶电泳, EB染色后在紫外灯下切下目的条带, 利用TaKaRa公司Agarose Gel DNA Purification试剂盒, 对目的片段进行胶回收。
1. 将切下的凝胶放入称好的小离心管中, 称重, 记录胶块的重量。
2. 每10 mg胶块加入30 μL结合液DR-I Buffer， 均匀混合后75 ℃加热融化胶块, 其间不断的振荡混合， 使胶块充分融化。
3. 向上述胶块融化液中加入DR—I Buffer量的1/2体积量的DR—II Buffer， 均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时, 应在此溶液再加入终浓度为20％的异丙醇.
4. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上.
5. 将上述操作3的溶液移至Spin Column中， 12000 rpm离心1 min, 弃滤液。
6. 将500 μL的Rinse A加入Spin Column中， 12000 rpm离心30 S， 弃滤液。
7. 将700 μL的Rinse B加入Spin Column中, 12000 rpm离心30 S, 弃滤液.
8. 重复操作步骤7。
9. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上， 在Spin Column膜的中央处加入25 μL的灭菌蒸馏水或Elution Buffer, 室温静置1 min。
10. 12000 rpm离心1 min洗脱DNA。
1.6。1.4.5 回收片段与载体的连接
在微量离心管中加入以下组分, 总体积为5 μl。
pMD18-T Vector 1 μl
纯化DNA溶液 2 μl
ddH2O 2 μl
加入5 μL的Solution I,16℃保温过夜。

2 结果与分析
2。1 总RNA提取

图1 提取牡丹总RNA
取1ulRNA样品进行1。2％的琼脂糖凝胶电泳分析, 结果表明, CTAB法提取的RNA28S， 18S， 5S的带型清晰， 两条带之间无明显弥散象, 28S：18S之间荧光强度比值接近2:1， 说明提取的RNA质量较好， 无降解现象.蛋白核酸定量测定仪（Spectrophotometer ND-1000型）测量A260 、A280 和A320的吸光度。结果表明， A260/A280比值为1。9962, 在1.8~2。0之间， 测得产率为871.7054 µg/ml。说明用此法提取的RNA样品产量高, 受多糖、多酚类、蛋白质物质污染程度小， 纯度高。但是少量基因组DNA残留， 在进行后续试验前去除基因组DNA.图 表明， DNA去除完全, 可以进入后续实验, 。

图2 DNase Ⅰ消化总RNA电泳图谱

表1 RNA样品的纯度和得率

序号No。
A230
A260
A280
A260/A280
A260/A230
产率Production（µg/g）
1
0。187
0。434
0。226
1.929
2.326
236
2
0.152
0。345
0。177
1.938
2。255
258
3
0.198
0.441
0.238
1.897
2。256
242
4
0。213
0。517
0.266
1。943
2.374
275
5
0。203
0.487
0.258
1.928
2。225
270

2。2 3’和5'RACE-PCR扩增目的片段
从分别以5'RACE—cDNA， 3’RACE-cDNA库为模板， 用目的基因特异引物, 与5’-RACE试剂盒下的引物配对, 扩增得到约900bp和2000bp左右片段。

图3 PsSERK1基因3’RACE—PCR产物
M:DL 2000 Maker；1：PsSERK1基因3’RACE产物

图4 PsSERK1基因5’RACE—PCR产物
M:DL 2000 Maker；1：PsSERK1基因5’RACE产物

2.3 RACE产物的克隆与鉴定

图5 PsSERK1基因3’RACE双酶切检测产物
M：DL 2000 Maker；1：PsSERK1基因3’RACE双酶切检测产物

图6 PsSERK1基因5’RACE双酶切检测产物
M：DL 2000 Maker；1：PsSERK1基因5’RACE双酶切检测产物

经过双酶切后，5’和3’RACE—PCR产物，链接到质粒上经过用BamH I和Hind III 消化,后，分别得到900bp和2000bp左右的目的片段，说明目的片段已经链接到质粒中，可以送到生物公司进行测序。
2。4 PsSERK1基因生物信息学分析、预测
将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.用WDNASIS软件对RACE产物测序结果和已知的序列进行拼接， 得到PsSERK1基因全长cDNA序列2864 bp。

图7PsSERK1全长序列及氨基酸序列
2。4.1PsSERK1基因全长cDNA序列结构分析与氨基酸序列分析
cDNA全长2864 bp， 5'非编码区（UTR）为714 bp， 3’UTR为313 bp, 开放阅读框（open reading frame， ORF）为1794bp， 编码598个氨基酸。用expasy中的工具ProtParam（http://cn。expasy.org/tools/protparam.html）分析, 得出蛋PsSERK1白分子式为C2929H4641N807O875S20， 其分子量计算值为65802。1 KD， 理论等电点pH为5。58；不稳定指数为41.50， 推测该蛋白不稳定；负电荷残基总数(As p+Gl u)：70；正电荷残基总数（Arg+Lys）:58；亲水性评估Grand average of hydropathicity (GRAVY)： -0。204, 表明其为亲水性蛋白。DNAMAN预测其二级结构包括α—螺旋53%、β—折叠30％、β—转角17％。分析氨基酸含量比例可以看出， 亮氨酸的含量最高为13.5％, 其次是甘氨酸占7。7%， 脯氨酸7。0%， 丝氨酸7.0%, 丙氨酸6。7%， 含量最低的是半胱氨酸， 仅占1。3%。
2。4.2PsSERK1蛋白跨膜结构域预测
http：//www.ch。embnet。org/software/TMPRED_form。html预测蛋白质的跨膜结构域。跨膜结构域预测（图17）该序列发现跨膜结构, 在200—250氨基酸处具有明显的跨膜结构所以是跨膜蛋白。跨膜蛋白主要作用是物质跨膜运输， 能量传递以及信号转导途径。

图8 PsSERK1跨膜结构域预测
2。4.4 预测PsSERK1蛋白的亚细胞定位
通过工具PSORT（http：//psort。nibb。ac.jp/form2。html）进行预测， 结果如下：: cytoplasmic（胞质）：34。8%；nuclear（胞核）：21.7。0 %；mitochondrial（线粒体）：17。4 ％;peroxisomal(过氧化物酶体）：4。3 %;vesicles of secretory system(分泌囊泡系统）：8。7 ％; endoplasmic reticulum（内质网):4。3 ％； Golgi(高尔基体）:4。3 %；定位结果表明, 该蛋白既存在于细胞核中有存在于细胞质中, 说明PsSERK1蛋白最可能在细胞质与细胞核中起到起作用。
2。4.5PsSERK1蛋白序列的同源性分析与构建进化树
首先, 利用http：//www。ncbi.nlm。nih。gov/BLAST的蛋白质数据库进行比较, 推测该氨基酸序列的功能之一, 表（2)所示。然后， 在NCBI 中BLAST 从而得到许多PsSERK1的同源蛋白， 然后将同源性较高的19个典型物种的蛋白序列下载为fasta 格式， 并把这些序列合并到一个文件中， 19个序列。然后输入ClustalX进行多序列比对, 得到aln 文件， 比对结果所示。然后找出将同源性比较高的序列用MEGA5构建进化树如图(10）所示. 表2 PsSERK1的同源蛋白相似度

被子
植物
物种
同源相似度
Vitis vinifera（葡萄）
95％
Citrus sinensis（甜橙）
94％
Rosa canina (黑蔷薇）
94％
Carica papaya(番木瓜）
93%
Glycine max（大豆）
93％
Populus trichocarpa(毛果杨)
92%
Solanum tuberosum （马铃薯 ）
92%
裸子植物
Selaginella moellendorffii（卷柏）
87％
Araucaria angustifolia（南洋杉）
89％

图11 PsSERK1系统进化关系的分析
注：序列包括番木瓜Carica papaya， 陆地棉Gossypium hissutum， 柑橘Citrus sinensis， 黑蔷薇Rosa canin， 番茄Solanum peruvianum， 葡萄Vitis vinifera, 毛果杨Populus trichocarpa, 烟草Nicotiana attenuata， 大麦Hordeum vulgare subsp.Vulgare， 粳稻Oryza sativa japonica group， 马尾松Pinus massoniana， 南洋杉Araucaria angustifolia ， 江南卷柏Selaginella moellendorffii, 地钱Marchantia polymorpha。
结果表明, PsSERK1的N端96个氨基酸到188个氨基酸序列处相对保守。之后, 用MEGA5的N-J 算法构建进化树（如图20）.进化树上的数值表示该分子进化树分枝的可信度。从系统进化进化树上可以看出, 葡萄Vitis vinifera, 木瓜Carica papay, 陆地棉Gossypium hissutum， 粳稻Oryza sativa japonica, 马尾松Pinus massoniana, 江南卷柏Selaginella moellendorffii, 与目标序列进化关系比较接近100%, 其中与目标序列同源性最高的物种是葡萄, 同源性达95%。地钱Marchantia polymorpha在进化树上构成独立一支, 在进化关系上离目的序列较远。

参考文献
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课程论文成绩评定表
学生姓名
胡鹏
专业班级
生物科学2009级2班
论文题目
牡丹PsSERK1cDNA全长的克隆
指导教师评语及意见：

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总评成绩（以百分记)：
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