蛋白质结构分析.ppt

典低峻批燕伤涯悲辊鸯档疹挪芝袱繁釜柜豺额琉洲祖稻劫敦侄悯暇毡蔽晚蛋白质结构分析蛋白质结构分析第二章第二章 蛋白质结构分析蛋白质结构分析舟建股曼砸拖绥搬苍续峪哺聋带钝米易骂名居翼钝决绕体乎胃校譬珊加屑蛋白质结构分析蛋白质结构分析第一节第一节 蛋白质样品的准备蛋白质样品的准备 进行结构分析的蛋白质样品，一般要求纯度进行结构分析的蛋白质样品，一般要求纯度进行结构分析的蛋白质样品，一般要求纯度进行结构分析的蛋白质样品，一般要求纯度9595。这样的样品，通。这样的样品，通。这样的样品，通。这样的样品，通常是用色谱和电泳精制过的。常是用色谱和电泳精制过的。常是用色谱和电泳精制过的。常是用色谱和电泳精制过的。一、一、一、一、SDSPAGESDSPAGE纯化的样品纯化的样品纯化的样品纯化的样品 从从从从SDS-PAGESDS-PAGE上分离的蛋白质必需经过特殊处理，使上分离的蛋白质必需经过特殊处理，使上分离的蛋白质必需经过特殊处理，使上分离的蛋白质必需经过特殊处理，使SDSSDS浓度低于浓度低于浓度低于浓度低于0.00050.0005，否则，否则，否则，否则SDSSDS会影响到胰蛋白酶的酶解，也会大大降低会影响到胰蛋白酶的酶解，也会大大降低会影响到胰蛋白酶的酶解，也会大大降低会影响到胰蛋白酶的酶解，也会大大降低HPLCHPLC分肽分肽分肽分肽时的分辨率。有报道指出，在时的分辨率。有报道指出，在时的分辨率。有报道指出，在时的分辨率。有报道指出，在2mol2molL L尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白质时，如果质时，如果质时，如果质时，如果SDSSDS浓度浓度浓度浓度0.050.05，则完全阻止了胰蛋白酶和内肽酶，则完全阻止了胰蛋白酶和内肽酶，则完全阻止了胰蛋白酶和内肽酶，则完全阻止了胰蛋白酶和内肽酶Lys-CLys-C的的的的作用。作用。作用。作用。虽然有报道用虽然有报道用虽然有报道用虽然有报道用HPLCHPLC或用盐酸胍沉淀除去或用盐酸胍沉淀除去或用盐酸胍沉淀除去或用盐酸胍沉淀除去SDSSDS，但不易掌握，尤其是共，但不易掌握，尤其是共，但不易掌握，尤其是共，但不易掌握，尤其是共价结合到蛋白质分子上的价结合到蛋白质分子上的价结合到蛋白质分子上的价结合到蛋白质分子上的SDSSDS分子更难除去。分子更难除去。分子更难除去。分子更难除去。在在在在SDS-PAGESDS-PAGE后，采用电印迹后，采用电印迹后，采用电印迹后，采用电印迹(blotting)(blotting)到到到到PVDFPVDF膜上，也是常用的方膜上，也是常用的方膜上，也是常用的方膜上，也是常用的方法，因为法，因为法，因为法，因为PVDFPVDF膜结合蛋白质能力的专一性远远超过其结合盐、氨基酸和膜结合蛋白质能力的专一性远远超过其结合盐、氨基酸和膜结合蛋白质能力的专一性远远超过其结合盐、氨基酸和膜结合蛋白质能力的专一性远远超过其结合盐、氨基酸和去垢剂，因此，蛋白质能和这些去垢剂，因此，蛋白质能和这些去垢剂，因此，蛋白质能和这些去垢剂，因此，蛋白质能和这些“污染物污染物污染物污染物”分开。经过这样处理后，能用分开。经过这样处理后，能用分开。经过这样处理后，能用分开。经过这样处理后，能用于于于于BrCNBrCN化学裂解或酶解。化学裂解或酶解。化学裂解或酶解。化学裂解或酶解。舶色怀釜泛钵仙佑句干阶匈紊号僵箍膀浅晃囱虐涛风宫俯载济胀饯掘枕惟蛋白质结构分析蛋白质结构分析二、二、二、二、HPLCHPLC纯化的样品纯化的样品纯化的样品纯化的样品 如果样品是用反相如果样品是用反相如果样品是用反相如果样品是用反相HPLCHPLC纯化的，因为流动相是挥发性溶剂，它们在纯化的，因为流动相是挥发性溶剂，它们在纯化的，因为流动相是挥发性溶剂，它们在纯化的，因为流动相是挥发性溶剂，它们在真空离心干燥或冻干样品时除去；如果蛋白质是用离子交换真空离心干燥或冻干样品时除去；如果蛋白质是用离子交换真空离心干燥或冻干样品时除去；如果蛋白质是用离子交换真空离心干燥或冻干样品时除去；如果蛋白质是用离子交换HPLCHPLC或疏水或疏水或疏水或疏水HPLCHPLC或凝胶过滤或凝胶过滤或凝胶过滤或凝胶过滤HPLCHPLC精制的，则样品要进行脱盐。精制的，则样品要进行脱盐。精制的，则样品要进行脱盐。精制的，则样品要进行脱盐。脱盐或稀蛋白溶液的浓缩可用脱盐或稀蛋白溶液的浓缩可用脱盐或稀蛋白溶液的浓缩可用脱盐或稀蛋白溶液的浓缩可用0.10.1三氟乙酸三氟乙酸三氟乙酸三氟乙酸(TFA)(TFA)乙腈乙腈乙腈乙腈(ACN)(ACN)系统系统系统系统的短柱反相的短柱反相的短柱反相的短柱反相HPLCHPLC；也可采用一次性的；也可采用一次性的；也可采用一次性的；也可采用一次性的Sek-PakSek-Pak，因为蛋白质是水溶性，因为蛋白质是水溶性，因为蛋白质是水溶性，因为蛋白质是水溶性的，所以先用能与水互溶的甲醇或乙腈的，所以先用能与水互溶的甲醇或乙腈的，所以先用能与水互溶的甲醇或乙腈的，所以先用能与水互溶的甲醇或乙腈(2ml)(2ml)润之，再用润之，再用润之，再用润之，再用5ml5ml纯水洗纯水洗纯水洗纯水洗涤；然后样品液体通过涤；然后样品液体通过涤；然后样品液体通过涤；然后样品液体通过Sep-PakSep-Pak柱时，蛋白质保留在柱上，小分子的盐柱时，蛋白质保留在柱上，小分子的盐柱时，蛋白质保留在柱上，小分子的盐柱时，蛋白质保留在柱上，小分子的盐类流过柱体，用水溶液充分洗涤后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白质。类流过柱体，用水溶液充分洗涤后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白质。类流过柱体，用水溶液充分洗涤后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白质。类流过柱体，用水溶液充分洗涤后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白质。小的超滤装置对浓缩蛋白质也是有效的。此外，有机溶剂或小的超滤装置对浓缩蛋白质也是有效的。此外，有机溶剂或小的超滤装置对浓缩蛋白质也是有效的。此外，有机溶剂或小的超滤装置对浓缩蛋白质也是有效的。此外，有机溶剂或TCATCA沉淀沉淀沉淀沉淀也可以考虑。也可以考虑。也可以考虑。也可以考虑。三、蛋白质样品中的二硫键和巯基三、蛋白质样品中的二硫键和巯基三、蛋白质样品中的二硫键和巯基三、蛋白质样品中的二硫键和巯基(一一一一SH)SH)当蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也除得比较当蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也除得比较当蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也除得比较当蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也除得比较“干净干净干净干净”，在进行，在进行，在进行，在进行酶解前，还要转变半胱氨酸残基成其他的稳定的衍生物。因为半胱氨酸酶解前，还要转变半胱氨酸残基成其他的稳定的衍生物。因为半胱氨酸酶解前，还要转变半胱氨酸残基成其他的稳定的衍生物。因为半胱氨酸酶解前，还要转变半胱氨酸残基成其他的稳定的衍生物。因为半胱氨酸的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键，的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键，的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键，的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键，因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。常用有碘代乙酸烷化，因为这个反应是快速和专一的；同时这类试剂常用有碘代乙酸烷化，因为这个反应是快速和专一的；同时这类试剂常用有碘代乙酸烷化，因为这个反应是快速和专一的；同时这类试剂常用有碘代乙酸烷化，因为这个反应是快速和专一的；同时这类试剂保存在暗处是很稳定的。而且，这类试剂的矫作物保存在暗处是很稳定的。而且，这类试剂的矫作物保存在暗处是很稳定的。而且，这类试剂的矫作物保存在暗处是很稳定的。而且，这类试剂的矫作物(artifact)(artifact)容易得到放容易得到放容易得到放容易得到放射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了其在水溶液中的射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了其在水溶液中的射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了其在水溶液中的射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了其在水溶液中的溶解度。胱氨酸也可在还原后再修饰。溶解度。胱氨酸也可在还原后再修饰。溶解度。胱氨酸也可在还原后再修饰。溶解度。胱氨酸也可在还原后再修饰。锰瑰党趁廷净夯谚陛疼淤服攘茶正销疮堆迫翻年寅业尚卤蹬为阵悍店纯羚蛋白质结构分析蛋白质结构分析1 1还原和羧甲基化还原和羧甲基化还原和羧甲基化还原和羧甲基化 将将将将1 1 20mg 20mg蛋白质溶解在含蛋白质溶解在含蛋白质溶解在含蛋白质溶解在含6mol/L6mol/L盐酸胍的盐酸胍的盐酸胍的盐酸胍的0.1mol/LTris-0.1mol/LTris-1mmol/LEDTA1mmol/LEDTA的缓冲液中，的缓冲液中，的缓冲液中，的缓冲液中，pH8.3pH8.3，加，加，加，加DTTDTT至至至至2mmol/L2mmol/L或再多一些或再多一些或再多一些或再多一些(过量于存在于蛋白质中的二硫键过量于存在于蛋白质中的二硫键过量于存在于蛋白质中的二硫键过量于存在于蛋白质中的二硫键)，通氮气，然后迅速封闭，通氮气，然后迅速封闭，通氮气，然后迅速封闭，通氮气，然后迅速封闭，3737反应反应反应反应1h1h，再加入，再加入，再加入，再加入50mmol/L50mmol/L的碘代乙酸的碘代乙酸的碘代乙酸的碘代乙酸(已用已用已用已用NaOHNaOH中和中和中和中和)，其量为，其量为，其量为，其量为1.11.1倍倍倍倍(分分分分子比子比子比子比)过量于溶液中的巯基数过量于溶液中的巯基数过量于溶液中的巯基数过量于溶液中的巯基数(蛋白质中的一蛋白质中的一蛋白质中的一蛋白质中的一SHSH和和和和DTTDTT中的一中的一中的一中的一SHSH总和总和总和总和),),典典典典型为型为型为型为4.54.55mmol/L5mmol/L，再次充氮气，于暗处，再次充氮气，于暗处，再次充氮气，于暗处，再次充氮气，于暗处3737保温保温保温保温1h1h。加。加。加。加22巯基乙巯基乙巯基乙巯基乙醇至最后浓度醇至最后浓度醇至最后浓度醇至最后浓度1 1(V/V)(V/V)结束反应，然后对结束反应，然后对结束反应，然后对结束反应，然后对50mmol/LNH50mmol/LNH4 4HC0HC03 3，含，含，含，含0.010.01硫二甘醇硫二甘醇硫二甘醇硫二甘醇(thiodiglyc01)(thiodiglyc01)充分透析，冻干。充分透析，冻干。充分透析，冻干。充分透析，冻干。注意：碘代乙酸必须是无色的，如果有碘存在，呈淡黄色，会引起巯注意：碘代乙酸必须是无色的，如果有碘存在，呈淡黄色，会引起巯注意：碘代乙酸必须是无色的，如果有碘存在，呈淡黄色，会引起巯注意：碘代乙酸必须是无色的，如果有碘存在，呈淡黄色，会引起巯基迅速氧化，阻碍了烷化反应，而且可能有副反应，使色氨酸修饰。基迅速氧化，阻碍了烷化反应，而且可能有副反应，使色氨酸修饰。基迅速氧化，阻碍了烷化反应，而且可能有副反应，使色氨酸修饰。基迅速氧化，阻碍了烷化反应，而且可能有副反应，使色氨酸修饰。碘代乙酰胺碘代乙酰胺碘代乙酰胺碘代乙酰胺(iodoacetamide)(iodoacetamide)也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸残基的也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸残基的也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸残基的也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸残基的烷化。这常用于避免牛胱氨酸被导入负电荷，而用中性的碘代乙酰胺。烷化。这常用于避免牛胱氨酸被导入负电荷，而用中性的碘代乙酰胺。烷化。这常用于避免牛胱氨酸被导入负电荷，而用中性的碘代乙酰胺。烷化。这常用于避免牛胱氨酸被导入负电荷，而用中性的碘代乙酰胺。另一种情况是变性剂不用盐酸胍，而用另一种情况是变性剂不用盐酸胍，而用另一种情况是变性剂不用盐酸胍，而用另一种情况是变性剂不用盐酸胍，而用SDSSDS，这时如果用碘代乙酸，反，这时如果用碘代乙酸，反，这时如果用碘代乙酸，反，这时如果用碘代乙酸，反应往往进行得很慢，而且不完全，这是因为碘代乙酸的负电荷和蛋白应往往进行得很慢，而且不完全，这是因为碘代乙酸的负电荷和蛋白应往往进行得很慢，而且不完全，这是因为碘代乙酸的负电荷和蛋白应往往进行得很慢，而且不完全，这是因为碘代乙酸的负电荷和蛋白质质质质SDSSDS胶束胶束胶束胶束(微团微团微团微团)上的负电荷相互排斥。上的负电荷相互排斥。上的负电荷相互排斥。上的负电荷相互排斥。2 2还原和吡啶乙烯化还原和吡啶乙烯化还原和吡啶乙烯化还原和吡啶乙烯化 用用用用44乙烯吡啶乙烯吡啶乙烯吡啶乙烯吡啶(4-vinylpyridine)(4-vinylpyridine)处理同上，通氮气保温过夜。处理同上，通氮气保温过夜。处理同上，通氮气保温过夜。处理同上，通氮气保温过夜。辨馋裔候肉员依愧樊贩遁败垣腋捣倾口了死貉靴舟麻恰壤岁纫云躺卒选湍蛋白质结构分析蛋白质结构分析第二节第二节 蛋白质的化学裂解蛋白质的化学裂解 裂解于甲硫氨酸裂解于甲硫氨酸(Met)溴化氰溴化氰(BrCN)是首选的化学试剂，专一裂解在甲硫氨酸的羧是首选的化学试剂，专一裂解在甲硫氨酸的羧基端，对多数蛋白质裂解效率为基端，对多数蛋白质裂解效率为90以上。以上。BrCN在酸性条件下，在酸性条件下，裂解在甲硫氨酸的裂解在甲硫氨酸的C端肽键上，将甲硫氨酸转化成高丝氨酸端肽键上，将甲硫氨酸转化成高丝氨酸()(homoserine)和高丝氨酸内酯和高丝氨酸内酯(I)(homoserinelactone)的混合物，的混合物，它们之间也能相互转化，如图它们之间也能相互转化，如图2.1所示。所示。闯瞎欲金余拉逝樊酿伸彭瞅摔透叫祟钾墓卓催梆御措屠厚过盔鸭傣岂供哪蛋白质结构分析蛋白质结构分析 对对Met-Thr、Met-Ser键，则常常是低产率的，可能是键，则常常是低产率的，可能是羟基产生下羟基产生下面的一系列反应面的一系列反应(和和)，最后形成高丝氨酸残基，最后形成高丝氨酸残基(V)，而未裂解此肽，而未裂解此肽键，如图键，如图2.2所示。所示。Met-Cys键也不易裂解。键也不易裂解。溉东蠢港伦椽畏的讨昏哑发够菇磺俺将褪惨慨忠詹钻担寸吃编宇弓语初讥蛋白质结构分析蛋白质结构分析 典型的反应常常在典型的反应常常在20、70甲酸甲酸(V/V)中进行中进行24h，副反应是部分副反应是部分Asp-Pro键会断裂，一些酰胺基团会部分丢键会断裂，一些酰胺基团会部分丢失，部分失，部分Asn-Gly会产生重排或环化，有时会产生重排或环化，有时Trp会氧化。会氧化。操作：蛋白质先用操作：蛋白质先用5巯基乙醇在巯基乙醇在pH 8.0室温下处理室温下处理24h，加色胺，加色胺(tryptamine)或色氨酸或色氨酸(以每分子甲硫氨酸加以每分子甲硫氨酸加5分子色胺或色氨酸计算分子色胺或色氨酸计算)以防止色氨酸氧化。以防止色氨酸氧化。蛋白质以蛋白质以15mg/ml浓度溶解在浓度溶解在70甲酸中，加入甲酸中，加入50倍倍过量，小体积的过量，小体积的BrCN/70甲酸，通氮并置于暗处，室温甲酸，通氮并置于暗处，室温放置放置1624h，结束后加，结束后加15倍体积的水，冻干，重复加水倍体积的水，冻干，重复加水冻干。冻干。净盂掖妙袭阀宇颅票振贺称邪畅烁畅抓幌萄玉砂焕乱露差挛所情沸锈雌涤蛋白质结构分析蛋白质结构分析自效遇侗望镶援析计姿恒聊蔚订瞎瘤揭衷诌铝抬谷诞葵掇棚常椿凳歼围客蛋白质结构分析蛋白质结构分析第三节第三节 蛋白水解酶酶解蛋白水解酶酶解一、一、常用蛋白水解酶常用蛋白水解酶(1)胰蛋白酶胰蛋白酶(trypsin)专一作用在专一作用在Arg和和Lys(碱性氨基酸碱性氨基酸)的羧基端，但对的羧基端，但对Arg-Pro和和Lys-Pro键没作用。键没作用。我们常将胰蛋白酶配成我们常将胰蛋白酶配成1mg/ml，贮存在，贮存在1mmol/LHCl中，中，-20保存数月，而未观察到酶的活性损失。如果样品溶解度差，可适量加入尿保存数月，而未观察到酶的活性损失。如果样品溶解度差，可适量加入尿素增加溶解度，因为胰蛋白酶在素增加溶解度，因为胰蛋白酶在2mol/L尿素中，仍具有充分的活性。尿素中，仍具有充分的活性。(2)胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶(-chymotrypsin)专一作用在芳香族氨基酸的羧基端。专一作用在芳香族氨基酸的羧基端。(3)内肽酶内肽酶Lys-C(endoproteinase Lys-c)专一作用在专一作用在Lys的羧基端。的羧基端。(4)V8蛋白酶蛋白酶(staphylococcal protease)专一作用在专一作用在Asp和和Glu(酸性氨基酸酸性氨基酸)的羧基端。的羧基端。pH 8.0的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液时，作用在时，作用在Glu-X和和Asp-X；pH 4.0的乙酸缓冲液时，仅作用于的乙酸缓冲液时，仅作用于Glu-x键。键。鹏九反哲辙铣拢观巡宅藤锌肋烙娟擒碎痈晓销迢铀滚歇羔炎岛矽玻紫掀化蛋白质结构分析蛋白质结构分析(5)梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶(clostripain)专一作用在专一作用在Arg的羧基端。的羧基端。(6)凝血酶凝血酶(thrombin)专一裂解在专一裂解在Arg-Gly键上，在纤维蛋白原工作中，很大程键上，在纤维蛋白原工作中，很大程度上还依赖于邻近氨基酸序列。近来还常用作融合蛋白的裂度上还依赖于邻近氨基酸序列。近来还常用作融合蛋白的裂解点。解点。(7)其他其他 还有专一性较广的胃蛋白酶还有专一性较广的胃蛋白酶(pepsin)、枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶(papain)、嗜热菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)等。等。应该指出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均从胰脏制备，常常不应该指出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均从胰脏制备，常常不易完全分开，而是你中有我，我中有你，专一性不佳，易造易完全分开，而是你中有我，我中有你，专一性不佳，易造成混乱。应采购成混乱。应采购TPCK胰蛋白酶胰蛋白酶(抑制了胰凝乳蛋白酶活抑制了胰凝乳蛋白酶活性性)和和TLCK胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶(抑制了胰蛋白抑制了胰蛋白-酶活性，才能保酶活性，才能保证酶的专一性。证酶的专一性。伯尼洱佯例漓堂承丫竭帧那谤疯肮犊慑开凯值隐动寅光滞宋糙抚瑟舜惜询蛋白质结构分析蛋白质结构分析二、二、二、二、酶解操作条件酶解操作条件酶解操作条件酶解操作条件 将将将将3030ll(100(100 g)g)蛋白质，蛋白质，蛋白质，蛋白质，100mmol/L 100mmol/L NHNH4 4HCOHCO3 3，pH 8.5pH 8.5，5mmol/L DTT5mmol/L DTT，5050作用作用作用作用15min15min，在冷至室温后，加，在冷至室温后，加，在冷至室温后，加，在冷至室温后，加5 5l 1l 100mmol/L00mmol/L碘代乙碘代乙碘代乙碘代乙酸，室温酸，室温酸，室温酸，室温15min15min，加，加，加，加6060ll水，最后加酶水，最后加酶水，最后加酶水，最后加酶5 5ll 蛋白样品蛋白样品蛋白样品蛋白样品:酶酶酶酶=25:1(=25:1(质量比质量比质量比质量比)，3737保温保温保温保温20-24h20-24h，冻干样品或直接注射样品冻干样品或直接注射样品冻干样品或直接注射样品冻干样品或直接注射样品(用稀用稀用稀用稀TFATFA酸化至约酸化至约酸化至约酸化至约pH 2.5)pH 2.5)到反相到反相到反相到反相HPLCHPLC柱中分析。柱中分析。柱中分析。柱中分析。砌屋泥急樊峡漫捌兜吩教哆个给稍钵肤醛参纳瘤爵又靖次蓑涕态桐临媚泡蛋白质结构分析蛋白质结构分析三、三、讨讨 论论(1)蛋白质的量和浓度蛋白质的量和浓度 酶解不能正常进行的主要原因之一是蛋白质的量不足。精确定量蛋白酶解不能正常进行的主要原因之一是蛋白质的量不足。精确定量蛋白质是必需的，一般用氨基酸分析来定量微量的蛋白质。质是必需的，一般用氨基酸分析来定量微量的蛋白质。蛋白质浓度通常要求蛋白质浓度通常要求500g/ml，最少不得低于，最少不得低于100g/ml，否则酶，否则酶的消化难以进行，体积在的消化难以进行，体积在50100l。(2)缓冲液、盐和去垢剂缓冲液、盐和去垢剂 酶作用可以被缓冲液中的各种因子所抑制或完全阻止。在标准的酶作用可以被缓冲液中的各种因子所抑制或完全阻止。在标准的2mol/L尿素，尿素，0.1mol/L NH4HCO3系统中，系统中，SDS含量为含量为0.0005时，就会影响酶的消化。时，就会影响酶的消化。0.005SDS会减少许多酶解肽段的产量。类会减少许多酶解肽段的产量。类似的，染料考马斯兰和两性电介质也会阻止酶的消化。高浓度的盐似的，染料考马斯兰和两性电介质也会阻止酶的消化。高浓度的盐(1mol/L NaCl)也会影响蛋白水解酶的活性；也会影响蛋白水解酶的活性；2mol/L以上浓度的尿素以上浓度的尿素会影响羧甲基化和蛋白酶的消化。会影响羧甲基化和蛋白酶的消化。(3)羧甲基化羧甲基化 Stone等报道，转铁蛋白用酶解时，羧甲基化的转铁蛋白酶解很好，等报道，转铁蛋白用酶解时，羧甲基化的转铁蛋白酶解很好，而没有羧甲基化的转铁蛋白，酶解程度很差。而没有羧甲基化的转铁蛋白，酶解程度很差。楔饵作淬粳宣蚜纽滔性青孩啪陆骆离盯诫细厅军殆蟹菇欺媒夯钱携玲撵观蛋白质结构分析蛋白质结构分析(4)蛋白酶的量蛋白酶的量 酶和蛋白质的质量比为酶和蛋白质的质量比为1:25，如果分子质量大，如果分子质量大的蛋白质的蛋白质(6万万Da)，则比例要减低至，则比例要减低至1:50。胰蛋。胰蛋白酶要用序列级的商品。白酶要用序列级的商品。(5)原位酶解原位酶解 将将SDS-PAGE上的蛋白质样品从凝胶上解析下来上的蛋白质样品从凝胶上解析下来是很困难的，文献报道有很多方法，但实用性差。是很困难的，文献报道有很多方法，但实用性差。目前流行的方法是将蛋白质电印迹目前流行的方法是将蛋白质电印迹(blotting)至至PVDF类的膜上，直接进行序列分析类的膜上，直接进行序列分析或或直接在膜上进行酶解，后者称为原位分析直接在膜上进行酶解，后者称为原位分析(in situ)。獭享拌惶项焚凭富朝惋韩朋敛棕孝抡绦轨寥浑剑纳袋窍瞻让睬矩闽绢限书蛋白质结构分析蛋白质结构分析 原位酶解操作如下：膜片剪成原位酶解操作如下：膜片剪成lmm细条，放在细条，放在Eppendrof管中管中,加加1.2ml 0.5(m/V)PVP-40/0.1mol/L HAc，37保温保温30min，PVP-40的作用是阻止在酶解时蛋白酶吸附到硝酸纤维素膜上，除去的作用是阻止在酶解时蛋白酶吸附到硝酸纤维素膜上，除去PVP-40后，用水充分洗涤膜至少后，用水充分洗涤膜至少5次以洗净残留的次以洗净残留的PVP-40(因为因为PVP-40有很强的紫外吸收，在有很强的紫外吸收，在RP-HPLC中，中，PVP-40于于30一一40有机溶有机溶剂浓度时洗下来，它在剂浓度时洗下来，它在215220nm有很高的吸收，在有很高的吸收，在260289nm吸收很小吸收很小)，所以在，所以在HPLC前需完全除去。膜片再用酶解时的缓冲液漂前需完全除去。膜片再用酶解时的缓冲液漂洗，然后进行酶解，一般蛋白酶在洗，然后进行酶解，一般蛋白酶在100mmol/L NH4HCO3:CAN=95:5，pH8.2，37酶解过夜，对酶解过夜，对V8蛋白酶则在蛋白酶则在100mmol/L磷酸磷酸钠钠:ACN=95:5，pH 7.8，室温过夜。酶与底物之比为，室温过夜。酶与底物之比为1:10至至1:20(质质量比量比)；对亚微克级样品，酶与底物之比高达；对亚微克级样品，酶与底物之比高达2:1。酶解后。酶解后-20保存或保存或立刻用数微升立刻用数微升10TFA酸化，上样到酸化，上样到HPLC柱上分析。柱上分析。勃仇披昆酣釜肩栈舔彬匈郡乱即坛头辨好邻拴榔岗臀律且追竞吞胎竣蚀建蛋白质结构分析蛋白质结构分析(6)限制性酶解限制性酶解 限制性酶解有助于蛋白质测序时的序列演绎。最著名的例限制性酶解有助于蛋白质测序时的序列演绎。最著名的例子是核糖核酸酶子是核糖核酸酶(RNase)，它被枯草杆菌蛋白水解酶在，它被枯草杆菌蛋白水解酶在pH 8.0下作用，活性没有变化，但出现一个新的下作用，活性没有变化，但出现一个新的N端丝氨酸。用端丝氨酸。用AmberliteIRC-50离子交换柱，离子交换柱，0.2mol/L pH6.25的磷酸的磷酸钠缓冲液可分离到一个大片段钠缓冲液可分离到一个大片段(S蛋白蛋白)和一个小片段和一个小片段(S肽肽)。也可用三氯乙酸也可用三氯乙酸(TCA)沉淀法，沉淀部分是沉淀法，沉淀部分是S蛋白，上层蛋白，上层液部分是液部分是S肽。同法亦可用在糖原磷酸化酶等的研究中。肽。同法亦可用在糖原磷酸化酶等的研究中。冲底盔竭惕慈澈陷弃邪也救断近馋枝垮席灵冶怠耳式巴茧毖坡析俱吏敲入蛋白质结构分析蛋白质结构分析第四节第四节 蛋白质中存在着封闭的蛋白质中存在着封闭的N端端 有些蛋白质的有些蛋白质的N端是封闭的，尤其在腹水细胞中，端是封闭的，尤其在腹水细胞中，80的蛋白质的的蛋白质的N端是乙酰化的，因此用端是乙酰化的，因此用Edman法不能直接测定其序列，要用一系列的化法不能直接测定其序列，要用一系列的化学或酶处理。学或酶处理。如果在蛋白质如果在蛋白质/肽序列仪上测定不到序列，蛋白质的量肯定又是足够肽序列仪上测定不到序列，蛋白质的量肯定又是足够的，则可在仪器上进一步用含水的，则可在仪器上进一步用含水TFA(三氟乙酸三氟乙酸)处理样品，使蛋白质酸处理样品，使蛋白质酸水解成许多肽段后再测序，这时会有很多水解成许多肽段后再测序，这时会有很多PTH-氨基酸出现，以此反证此氨基酸出现，以此反证此蛋白质的蛋白质的N端是封闭着的，再用下述方法除去封闭着的端是封闭着的，再用下述方法除去封闭着的N端。端。首先，用温和的酸处理可以除去甲酰化的甲硫氨酸首先，用温和的酸处理可以除去甲酰化的甲硫氨酸(f-Met)，也可能，也可能引起丝氨酸、苏氨酸的乙酰化引起丝氨酸、苏氨酸的乙酰化N-O重排反应。如果酸处理后还是测不到重排反应。如果酸处理后还是测不到序列，则进一步用焦谷氨酸氨肽酶除去蛋白质序列，则进一步用焦谷氨酸氨肽酶除去蛋白质N端上的焦谷酰基；假设端上的焦谷酰基；假设这一方法仍不见效，再用较强的酸处理或其他酶处理。虽然有乙酰氨基这一方法仍不见效，再用较强的酸处理或其他酶处理。虽然有乙酰氨基酸释放酶酸释放酶(acylaminoacid-releasing enzyme，AARE)，但它不能作，但它不能作用长度在用长度在20个氨基酸残基以上的蛋白质或肽。因此，封闭的蛋白质首先个氨基酸残基以上的蛋白质或肽。因此，封闭的蛋白质首先裂解成小肽，再用裂解成小肽，再用AARE处理除去处理除去N端上的乙酰化氨基酸转变成端上的乙酰化氨基酸转变成n-1肽，肽，然后然后n-1肽的序列再用肽的序列再用Edman法测定。法测定。聚鹰睬艳寅亩仟贤峭瘦扩木缔加菜搬炬参吃劣晋锚援茁吊菇注净粗匀辰热蛋白质结构分析蛋白质结构分析一、除去蛋白质中封闭的一、除去蛋白质中封闭的N-乙酰丝氨酸和乙酰丝氨酸和N-乙酰苏氨酸乙酰苏氨酸 样品置于样品置于1.5ml的聚丙烯离心管中，加无水的聚丙烯离心管中，加无水TFA，密闭，密闭，40保温保温1h，然后打开管盖，让，然后打开管盖，让TFA挥发，干燥，再进行序列分析。挥发，干燥，再进行序列分析。二、除去二、除去N-甲酰甲硫氨酸甲酰甲硫氨酸 样品置于样品置于1.5ml聚丙烯离心管中，加聚丙烯离心管中，加30l l 0.6mol/L HCl，密闭，密闭，25水解水解24h，打开管盖，真空除去，打开管盖，真空除去HCl，然后进行序列分析。，然后进行序列分析。以上两种温和酸水解除去甲酰或乙酰氨基酸，这与时间、温度、酶浓以上两种温和酸水解除去甲酰或乙酰氨基酸，这与时间、温度、酶浓度有很大关系，过分的酸水解会引起蛋白质中肽键的断裂，如对酸不稳度有很大关系，过分的酸水解会引起蛋白质中肽键的断裂，如对酸不稳定的定的Asp-Pro键；相反，条件不够，则封闭的键；相反，条件不够，则封闭的N端基团水解不完全，导端基团水解不完全，导致测序的起始点不均一。致测序的起始点不均一。三、除去三、除去N端的焦谷氨酸残基端的焦谷氨酸残基(pyroglutamate)样品在序列仪上测不出样品在序列仪上测不出N端，则将载有样品的膜片转移至端，则将载有样品的膜片转移至1.5ml聚丙聚丙烯微量离心管中，用烯微量离心管中，用0.5PVP-40洗膜片洗膜片(见上节原位酶解部分见上节原位酶解部分)，再加，再加100 l焦谷氨酸氨肽酶焦谷氨酸氨肽酶(5 g于于50mmol/L磷酸钠磷酸钠pH7.0，含，含10mmol/L DTT)37酶解酶解510h，用水洗膜，干燥，放回序列仪分析。，用水洗膜，干燥，放回序列仪分析。夕泵萝逢齿膀鼻悟买使沂芒拄湘军顷棵顿恨班呛瘤锦欲照冷肆章疲雷烟阔蛋白质结构分析蛋白质结构分析五、选择性纯化五、选择性纯化五、选择性纯化五、选择性纯化NN端封闭的肽端封闭的肽端封闭的肽端封闭的肽 蛋白质用胃蛋白酶蛋白质用胃蛋白酶蛋白质用胃蛋白酶蛋白质用胃蛋白酶(pepsin)(pepsin)或嗜热菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶(thermolysin)(thermolysin)作用后作用后作用后作用后(但不能用胰蛋白酶但不能用胰蛋白酶但不能用胰蛋白酶但不能用胰蛋白酶!)!)，酸化到，酸化到，酸化到，酸化到pH2pH2，上强酸性阳离子交换柱，上强酸性阳离子交换柱，上强酸性阳离子交换柱，上强酸性阳离子交换柱(例例例例Dowex Dowex 50mmX2mm50mmX2mm，HH+型型型型)。所有含游离氨基或其他碱性基团的肽都结合至。所有含游离氨基或其他碱性基团的肽都结合至。所有含游离氨基或其他碱性基团的肽都结合至。所有含游离氨基或其他碱性基团的肽都结合至柱上，仅缺少碱性基团的肽通过柱泄出。如果柱上，仅缺少碱性基团的肽通过柱泄出。如果柱上，仅缺少碱性基团的肽通过柱泄出。如果柱上，仅缺少碱性基团的肽通过柱泄出。如果NN端是封闭着的端是封闭着的端是封闭着的端是封闭着的(没有游离没有游离没有游离没有游离的的的的NN端氨基端氨基端氨基端氨基)，同时因用专一性很广的酶作用，肽较小又不含组氨酸、赖，同时因用专一性很广的酶作用，肽较小又不含组氨酸、赖，同时因用专一性很广的酶作用，肽较小又不含组氨酸、赖，同时因用专一性很广的酶作用，肽较小又不含组氨酸、赖氨酸、精氨酸则可在排出液中发现氨酸、精氨酸则可在排出液中发现氨酸、精氨酸则可在排出液中发现氨酸、精氨酸则可在排出液中发现NN端封闭的肽。端封闭的肽。端封闭的肽。端封闭的肽。此技术的局限性是：大肽此技术的局限性是：大肽此技术的局限性是：大肽此技术的局限性是：大肽(甚至含有碱性基团甚至含有碱性基团甚至含有碱性基团甚至含有碱性基团)可能不结合到树脂上，可能不结合到树脂上，可能不结合到树脂上，可能不结合到树脂上，因为它们不渗入树脂孔径内；相反，一些疏水的肽，特别含有色氨酸残因为它们不渗入树脂孔径内；相反，一些疏水的肽，特别含有色氨酸残因为它们不渗入树脂孔径内；相反，一些疏水的肽，特别含有色氨酸残因为它们不渗入树脂孔径内；相反，一些疏水的肽，特别含有色氨酸残基，即是它们缺少游离的基，即是它们缺少游离的基，即是它们缺少游离的基，即是它们缺少游离的NN端氨基，也可能结合到柱上。此外，如果存端氨基，也可能结合到柱上。此外，如果存端氨基，也可能结合到柱上。此外，如果存端氨基，也可能结合到柱上。此外，如果存在碱性基团非常靠近在碱性基团非常靠近在碱性基团非常靠近在碱性基团非常靠近NN端，胃蛋白酶作用不能除去，则该技术也不见端，胃蛋白酶作用不能除去，则该技术也不见端，胃蛋白酶作用不能除去，则该技术也不见端，胃蛋白酶作用不能除去，则该技术也不见效。效。效。效。应该指出，应该指出，应该指出，应该指出，NN端为谷氨酸的肽在极端端为谷氨酸的肽在极端端为谷氨酸的肽在极端端为谷氨酸的肽在极端pHpH下会环化而转变成封闭，需加下会环化而转变成封闭，需加下会环化而转变成封闭，需加下会环化而转变成封闭，需加以小心。近年来，由于质谱以小心。近年来，由于质谱以小心。近年来，由于质谱以小心。近年来，由于质谱(MS)(MS)在生物样品检测中有了长足的发展，可在生物样品检测中有了长足的发展，可在生物样品检测中有了长足的发展，可在生物样品检测中有了长足的发展，可用用用用MSMS精确测定分子质量的方法来判断封闭的精确测定分子质量的方法来判断封闭的精确测定分子质量的方法来判断封闭的精确测定分子质量的方法来判断封闭的NN端为何种基团。端为何种基团。端为何种基团。端为何种基团。枕荫奔骏杯继瞧俐竖刊搞肆筷疽伞拢鲸订画金牟吼迢虽饿苇允付葱煤振坤蛋白质结构分析蛋白质结构分析第五节第五节 蛋白质中的蛋白质中的C端残基的测定端残基的测定一、羧肽酶法一、羧肽酶法 羧肽酶是最常用的方法，对一些小肽而言，羧肽酶是最常用的方法，对一些小肽而言，C端有时最容易测定的，端有时最容易测定的，如胰蛋白酶酶解肽段时总是以如胰蛋白酶酶解肽段时总是以Lys或或Arg为为C端；端；BrCN裂解的肽总是以裂解的肽总是以高丝氨酸高丝氨酸(homoserlne)为为C端；端；V8蛋白酶酶解的肽总以蛋白酶酶解的肽总以Glu或或Asp为为C端。虽然有非专一的情况，但毕竟出现的概率很少。端。虽然有非专一的情况，但毕竟出现的概率很少。羧肽酶酶解是从羧肽酶酶解是从C端开始，一个一个地从端开始，一个一个地从C端释放出氨基酸残基，这端释放出氨基酸残基，这是个动态的释放过程。有的氨基酸释放快些，有的氨基酸释放慢些。对是个动态的释放过程。有的氨基酸释放快些，有的氨基酸释放慢些。对小肽的小肽的C端序列测定问题不大，但对长肽的序列测定，由于对不同氨基端序列测定问题不大，但对长肽的序列测定，由于对不同氨基酸残基释放的速度不同，对后面一些氨基酸的序列判断，可能会出现错酸残基释放的速度不同，对后面一些氨基酸的序列判断，可能会出现错误。在这方面不如化学降解法。误。在这方面不如化学降解法。C端序列分析是在酶解的不同时间间隔，取出一定量的反应物停止反端序列分析是在酶解的不同时间间隔，取出一定量的反应物停止反应后，用氨基酸分析定量氨基酸来排列出其序列，近来用质谱法测定应后，用氨基酸分析定量氨基酸来排列出其序列，近来用质谱法测定C端序列。端序列。思匆咕桃日桑吗赏侈句壕钓银株搔赃蔚肚席嘛范牧斜魏尧痘免厦冻示靳诱蛋白质结构分析蛋白质结构分析(1)(1)羧肽酶羧肽酶羧肽酶羧肽酶A(CpA)A(CpA)此酶释放非极性氨基酸速度快，释放此酶释放非极性氨基酸速度快，释放此酶释放非极性氨基酸速度快，释放此酶释放非极性氨基酸速度快，释放HisHis、ThrThr、homoserinehomoserine也很快，释放也很快，释放也很快，释放也很快，释放AspAsp、SetSet、Met sulphoneMet sulphone则缓慢，释放则缓慢，释放则缓慢，释放则缓慢，释放LysLys也较慢，但在高也较慢，但在高也较慢，但在高也较慢，但在高pHpH下则速度加快下则速度加快下则速度加快下则速度加快点；酸性氨基酸的释放也较慢，对点；酸性氨基酸的释放也较慢，对点；酸性氨基酸的释放也较慢，对点；酸性氨基酸的释放也较慢，对ProPro和和和和ArgArg基本上不起作用。倒数第二个氨基基本上不起作用。倒数第二个氨基基本上不起作用。倒数第二个氨基基本上不起作用。倒数第二个氨基酸残基影响水解速度，但对这一现象作一归纳或解释是很困难的。酸残基影响水解速度，但对这一现象作一归纳或解释是很困难的。酸残基影响水解速度，但对这一现象作一归纳或解释是很困难的。酸残基影响水解速度，但对这一现象作一归纳或解释是很困难的。此外，如何保证此外，如何保证此外，如何保证此外，如何保证CpACpA不污染有内肽酶也是一个很重要的问题，