植物花药和花粉培养.ppt

第七章 植物花药和花粉培养第一节 植物花药和花粉培养的概念和应用一、花药和花粉培养的概念花药：植物花的雄性器官，包括二倍性的花药：植物花的雄性器官，包括二倍性的组织和单倍性的雄性性细胞。组织和单倍性的雄性性细胞。花粉：由花粉母细胞经过减数分裂形花粉：由花粉母细胞经过减数分裂形成的单倍体的生殖细胞。成的单倍体的生殖细胞。药壁和药隔组织（2n）花粉粒（n）花粉粒的形成：花粉母细胞花粉母细胞（小孢子母细胞）（小孢子母细胞）减数减数分裂分裂4 4个小孢子个小孢子（四分体时期）（四分体时期）进入进入单核期单核期1 1个小孢子个小孢子有丝有丝分裂分裂花花粉粉粒粒花粉管细胞核花粉管细胞核生殖细胞核生殖细胞核营养细胞营养细胞双双核核期期生殖细胞生殖细胞精子精子指指在合成培养基上，改变花粉的正常发育在合成培养基上，改变花粉的正常发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株进行分裂、分化、最终发育成完整植株。花药和花粉培养该发育途径被称为该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径花粉孢子体发育途径”或或“雄核发育雄核发育”。花粉和花药培养的异同点：共同点p培养目的相同：培养目的相同：均获得单倍体植株均获得单倍体植株p花药培养属于器官培养；而花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养属于细胞培养。p花粉培养没有药壁组织干扰；花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产雄核发育的全过程；单倍体产量高，但技术更复杂。量高，但技术更复杂。不同点缩短缩短育种周期：常规育种需育种周期：常规育种需4-64-6年获得纯系，而小孢子年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。培养仅需一年。供体植株小供体植株小孢子（孢子（n n）花培花培花粉植株（花粉植株（n n）雄核发育雄核发育自然加倍自然加倍人工加倍人工加倍纯合纯合植株（植株（2n2n）一年内获得纯系一年内获得纯系二、花药和花粉培养的应用（一）作物育种（一）作物育种ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb2.提高了目标基因型的选择效率AaBbAAbb1/16单倍体方法单倍体方法3.诱变育种中的作用植株植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。可可探索亲本染色体组的构成探索亲本染色体组的构成。分析分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。染色体。（二）物种进化研究 （三）遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。（四）构建连锁图谱 双单倍体群体双单倍体群体是永久性群体，能有效地用于是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建。遗传图谱的构建。（五）用于遗传转化 能直接表达外源基因，不受显隐性影响。能直接表达外源基因，不受显隐性影响。第二节 花粉小孢子发育途径一、活体小孢子发育途径花粉发育时期对诱导雄核发育极其重要花粉发育时期对诱导雄核发育极其重要。花粉母细胞（花粉母细胞（PMCPMC）减数分裂形成四分体，释放）减数分裂形成四分体，释放4 4个小孢子。小孢子第一次分裂为不均等分裂形成营养个小孢子。小孢子第一次分裂为不均等分裂形成营养核和生殖核；第二次有丝分裂仅限于生殖核，形成两核和生殖核；第二次有丝分裂仅限于生殖核，形成两个精子。个精子。花粉孢子体发育途径（雄核发育）胚性能力的获得胚性能力的获得细胞分裂的诱导细胞分裂的诱导胚状体的形成胚状体的形成二、离体小孢子发育途径（一）雄核发育途径最适宜诱导的时期是第一次有丝分裂或之前。最适宜诱导的时期是第一次有丝分裂或之前。1.A1.A途径途径-小孢子小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和形成营养细胞和生殖细胞生殖细胞（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成多细胞花粉（或多核由营养细胞重复分裂形成多细胞花粉（或多核花粉）；生殖细胞以游离核的形式存在一个周花粉）；生殖细胞以游离核的形式存在一个周期后退化，或分裂一至数次存在于多核花粉的期后退化，或分裂一至数次存在于多核花粉的一侧，有的甚至到球形胚形成时仍存在。一侧，有的甚至到球形胚形成时仍存在。（2）A-G途径 生殖细胞进行多次分裂形成胚状体，营养细胞生殖细胞进行多次分裂形成胚状体，营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。（3）A-VG途径（E途径）花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂，形成花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂，形成两类细胞群，各群的子细胞都类似其母细胞。两类细胞群，各群的子细胞都类似其母细胞。（4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成非单倍营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成非单倍体植株。在获得的花粉植株群体中，有二倍体、体植株。在获得的花粉植株群体中，有二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体等非单倍体植株。三倍体、四倍体、非整倍体等非单倍体植株。2.B途径 小孢子小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个近的两个细胞（或游离核）。细胞（或游离核）。然后由这两然后由这两细胞细胞（或游离核）（或游离核）继续继续分裂形成分裂形成单一类细胞组成的多单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。细胞花粉或多核花粉。小孢子正常发育途径与离体培养条件下胚胎发育途径（二）雄核发育启动机理1.1.雄核发育雄核发育与与P P花粉的形成花粉的形成胚性花粉粒特点：胚性花粉粒特点：p核核位于花粉粒位于花粉粒中心；中心；p醋酸醋酸洋红压片观察，花粉粒着色较洋红压片观察，花粉粒着色较浅；浅；p有有液泡和液泡和2 2个清晰着色的核个清晰着色的核。P-P-花粉或花粉或E-E-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（花粉（S-S-花粉）或不染色花粉（花粉）或不染色花粉（NS-NS-花粉）。花粉）。2.雄核发育与饥饿处理对花粉进行短期的饥饿处理，再供给发育所对花粉进行短期的饥饿处理，再供给发育所需营养，对花粉胚胎发生是非常重要的。需营养，对花粉胚胎发生是非常重要的。饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。其机制可能是使本来停止在启动雄核发育。其机制可能是使本来停止在G G1 1期的营养核重新启动，开始期的营养核重新启动，开始DNADNA的复制和的复制和进一步发育。进一步发育。三、花粉植株形态发生方式花粉植株的形态发生途径：（一）胚状体发育途径一）胚状体发育途径 （直接发育途径）（直接发育途径）小孢子经历合子胚发生的各个阶段，最后小孢子经历合子胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。子叶展开，形成花粉植株。（二）愈伤组织发育（二）愈伤组织发育途径（间接发育途径）途径（间接发育途径）小孢子分裂数次形成愈伤组织，愈伤组织小孢子分裂数次形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。现变异且倍性复杂。三、花粉植株形态发生方式体细胞胚体细胞胚：植物组织培养过程中，某些体细胞：植物组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚（具胚根、在形态上转变为与合子发育成的胚（具胚根、胚芽、胚轴等结构）非常相似的结构，称作体胚芽、胚轴等结构）非常相似的结构，称作体细胞胚或胚状体。细胞胚或胚状体。花粉胚：植物组织培养过程中，某些单倍体性花粉胚：植物组织培养过程中，某些单倍体性细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，称作花粉胚或胚状体。似的结构，称作花粉胚或胚状体。胚状体发育途径胚状体发育途径烟烟草草花花药药培培养养部分花药通过胚状体途径形成小植株部分花药通过胚状体途径形成小植株胚状体发育途径胚状体发育途径芸苔属小孢子培养芸苔属小孢子培养球形胚球形胚 鱼雷形胚鱼雷形胚心形胚心形胚 辣椒小孢子胚胎形成过程（球形胚阶段后）辣椒小孢子胚胎形成过程（球形胚阶段后）a，b：球形胚，胚的表面粘连在花粉粒外壁上；c，d：心形胚；e，f：鱼雷形胚愈伤组织发育途径愈伤组织发育途径水稻花药培养水稻花药培养接种在平板上的水稻花药接种在平板上的水稻花药部分花药产生愈伤组织部分花药产生愈伤组织愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株愈伤组织分化形成再生植株第三节 花药和花粉培养方法一、花药培养1.取材 镜检镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。花蕾。2.消毒 7070酒精擦洗花蕾表面，或酒精擦洗花蕾表面，或7070酒精浸泡酒精浸泡30-60s30-60s后在后在1 1次氯酸钠溶液中浸泡次氯酸钠溶液中浸泡10-20min10-20min或在或在0.10.1的氯化汞溶液中消毒的氯化汞溶液中消毒3-10min3-10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗3-53-5次次。3.培养 固体固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（壁表面，形成突出物（2-32-3周）；后转入分化培周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。养基培养，形成小植株。二、花粉培养(一)花粉的分离与纯化 1 1.自然自然散落法散落法(漂浮培养散落小孢子收集法漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。粉自动散落后，收集培养。2 2.挤压挤压法法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。培养。3.3.机械机械游离游离 （1 1）磁搅拌法）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；粉游离出来；（2 2）超速旋切法）超速旋切法 通过通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。广）。4.4.小孢子小孢子纯化纯化 对对上述方法获得的小孢子混合物进行分级上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子过筛、梯度离心处理纯化小孢子梯度离心梯度离心前前（小孢子形态、活力不一致）小孢子形态、活力不一致）30%30%蔗糖梯度离心后蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）（获得均一的小孢子群体）(二)花粉培养方式 1 1.平板培养平板培养 花粉花粉置琼脂固化培养基上培养。置琼脂固化培养基上培养。2 2.液体液体培养培养 花粉花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。利通气。3 3.双层双层培养培养 花粉花粉置固体置固体-液体双层培养基上培养。培养液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。后，在表面加入少量液体培养基。4.4.看护培养看护培养利用利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。促进花粉小孢子发育。5 5.微室培养微室培养 利用利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。花粉培养。6 6.条件条件培养基培养培养基培养 利用利用培养过花药的液体培养基或含失活花药培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等房条件培养等。看护培养图解看护培养图解三、移栽驯化四、白化苗现象（一）白化苗产生的原因及机理1.1.白化白化苗产生的原因：苗产生的原因：内内因因：供供体体植植株株基基因因型型（如如籼籼稻稻比比粳粳稻稻白白苗苗率率高）、花粉发育时期。高）、花粉发育时期。外外因因：预预处处理理、培培养养基基成成分分、激激素素水水平平与与种种类类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。2.2.白化苗产生白化苗产生的机理的机理 核核基基因因起起关关键键作作用用，导导致致质质体体DNADNA缺缺失失，产产生白苗。生白苗。另外另外，无性无性系变异也可能是原因之一系变异也可能是原因之一。（二）白化苗的控制通过对花粉发育时期、预处理、培养基成通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。分等因素进行调控。五、影响雄核发育和花粉花药培养的因素（一）基因型（一）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种中的不同基因型对的因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。小孢子离体诱导反应差异较大。如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。糯稻。芸苔属植物芸苔属植物Brassica napus不同基因型的小孢子产胚率比较不同基因型的小孢子产胚率比较基因型基因型胚状体数量胚状体数量/106小孢子小孢子成苗率（成苗率（%）Topas 10,000-200,0001-20Westar1000-10,000 0.1-1Delta100-10,0000.01-1Bounty10-1000.001-0.01（二）供体植株生长条件和生理状态（二）供体植株生长条件和生理状态1 1.植株植株生长条件生长条件 光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）宜生长条件（如温室中）较好，但较好，但物种间存在物种间存在差异。差异。2 2.植株植株生长时期生长时期 一般是开花始期优于开花末期。一般是开花始期优于开花末期。3 3.P P花粉的频率花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高提高P P花粉的数量花粉的数量 。（三）花粉发育时期（三）花粉发育时期小孢子发育时期对诱导小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要雄核发育非常重要。一般而言，单核期一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为对诱导反应最敏感，为最佳培养期最佳培养期。形成双核后，在合形成双核后，在合适的条件，主要由营养适的条件，主要由营养细胞分裂产生胚状体。细胞分裂产生胚状体。处于不同发育时期的烟草小孢子处于不同发育时期的烟草小孢子四分体四分体:醋酸洋红染色醋酸洋红染色单核期单核期双核期双核期四分体四分体:Alexanders 染色染色成熟花粉粒成熟花粉粒单核晚期单核晚期液泡液泡第一次有丝分裂后期第一次有丝分裂后期双核早期双核早期双核中期双核中期生殖核生殖核生殖核生殖核营养核营养核不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期发育时期物种物种减数分裂期减数分裂期草莓、番茄草莓、番茄四分孢子期四分孢子期葡萄葡萄单核早中期单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期单核早期至晚期烟草烟草单核早期至双核期单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期四分孢子期至双核期玉米玉米花粉发育时期的确定花粉发育时期的确定处于不同发育阶段的烟草花芽处于不同发育阶段的烟草花芽 p对不同发育阶段的花药进对不同发育阶段的花药进行培养行培养测试测试p确定最佳小孢子发育时期确定最佳小孢子发育时期的的形态特征形态特征p注意形态特征会因品种、注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变发育状态、环境条件的变化而发生变化化而发生变化（四）预处理（四）预处理预处理预处理是小孢子培养成功的前提是小孢子培养成功的前提条件。条件。预处理预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加的预处理能使绿苗产量大量增加。预处理预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。预处理方法：1 1.高高低温低温处理处理低温低温预处理：指在接种之前将材料用预处理：指在接种之前将材料用00以上低以上低温处理一段时间后再接种温处理一段时间后再接种。应用应用较多。处理温度一般在较多。处理温度一般在1-141-14，时间从，时间从几小时至几十天几小时至几十天不等；不同不等；不同作物所用的预处理作物所用的预处理温度及时间差异温度及时间差异较大；不同的较大；不同的处理温度需要不处理温度需要不同的时间。同的时间。例子例子:小麦穗子培养前小麦穗子培养前44预处理几天，花药培预处理几天，花药培养效率显著提高。养效率显著提高。十字花科未经低温预处理的花蕾，每花十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为药产胚数为4.394.39个，个，6-96-9处理处理1 1天，产胚数天，产胚数提高到提高到61.461.4个，预处理个，预处理4 4天后，胚状体产量天后，胚状体产量降为降为10.4710.47个。个。高温处理（热击处理）：指花药接种后，高温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下（先在较高温度下（30-3530-35）培养数天，然）培养数天，然后再移至正常温度下继续后再移至正常温度下继续培养。培养。如如烟草，烟草，3232高温；小麦，高温；小麦，3333高温预高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力。能力。2.2.化学物质处理化学物质处理包括包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理行处理。甘露醇甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子孢子去分化。去分化。3 3.其它其它包括包括 射线、离心、磁场等射线、离心、磁场等1.1.基本培养基基本培养基主要主要为为N6N6和和MSMS培养基。在此基础上发展出培养基。在此基础上发展出一些其它的培养基一些其它的培养基。如如H H培养基（适于烟草）、培养基（适于烟草）、C17C17培养基（适培养基（适于小麦）、马铃署于小麦）、马铃署-培养基（适于马铃署培养基（适于马铃署）。）。（五）培养基（五）培养基2.2.碳源碳源包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。果糖、海藻糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认为单子叶植物比双子叶植所差异。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖为最好的碳源。而麦类作物中，麦芽糖为最好的碳源。3 3.激素激素4 4.氨基酸氨基酸5 5.活性碳活性碳6.pH6.pH（六）培养条件 1 1.温度温度 物种间有差异物种间有差异2 2.光照光照 3 3.植植板密度板密度植植板密度与花培效率有很大的相关性板密度与花培效率有很大的相关性。5103到到2104个个/ml密度均能有效培养。密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。（七）花药壁因素（七）花药壁因素 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。有毒物质影响小雄核的发育。第四节 单倍体植株的二倍化花粉植株的特点：花粉植株的特点：单倍体植株；植株弱小；高度不育。单倍体植株；植株弱小；高度不育。一、倍性鉴定一、倍性鉴定1.1.染色体直接计数法染色体直接计数法通常取根尖、茎尖通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。直接计数染色体数目。2.间接间接鉴定鉴定（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要主要测定叶片单个细胞中测定叶片单个细胞中DNA的含量确定的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）细胞形态学鉴定法）细胞形态学鉴定法叶片叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。度的相关性。（3）植株形态学鉴定法）植株形态学鉴定法单倍体单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。花粉粒小，不结实。（4）高）高/低温胁迫低温胁迫50，10h为高温胁迫临界点；为高温胁迫临界点；0，5h为低温胁迫临界点，进行此方法鉴定的倍性为低温胁迫临界点，进行此方法鉴定的倍性符合度为符合度为90%和和80%。（5）杂交鉴定杂交鉴定法法 自交自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（6）分子标记鉴定分子标记鉴定包括包括生化标记（如同工酶标记）和分子标生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如记（如RFLP、RAPD、AFLP等等）二、染色体加倍（一）茎段培养（一）茎段培养将将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。植株。（二）化学试剂诱变（二）化学试剂诱变1.秋水仙素秋水仙素诱导诱导（1）浸泡法）浸泡法无菌无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。再转移至新鲜培养基中培养。（2）生长锥处理）生长锥处理 秋水仙素秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。（3）培养基处理）培养基处理 将将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。2.2.除草剂诱导除草剂诱导Oryzalin、trifluralin、APM等。等。使用浓度比秋水仙素低使用浓度比秋水仙素低100100倍左右，且倍左右，且毒性极小；引起其他变异的概率比秋水毒性极小；引起其他变异的概率比秋水仙素小。仙素小。花花药药和和花花粉粉培培养养基基本本流流程程预处理花药（物理或生理逆境）预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上胚状体转移至固化培养基上”萌发萌发”形成小植株。形成小植株。选择合适的供体植株（选择合适的供体植株（F1）倍性鉴定或染色体加倍倍性鉴定或染色体加倍