DNA粗提取和鉴定实验.doc

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DNA的粗提取与鉴定实验
一、实验原理
①DNA主要存在于细胞核
②DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
③DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
⑷DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
二、实验材料和用具
鸡血细胞液（5~10ml）；体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；蒸馏水；质量浓度为0．１g/ml的柠檬酸纳溶液；质量的浓度分别为2mol/L和0．015mol/L的氯化纳溶液（新教材不要求0、015的浓度了，都是用的2mol/L）；二苯胺试剂；铁架台；镊子；水浴锅；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（1000ml，一个，50ml、100 ml 、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。
三、课前准备鸡血细胞液

取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。
四、方法步骤
①提取鸡血细胞的细胞核物质
将制备好的鸡血细胞液5 mL～10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有1-2层纱布的漏斗将血细胞液过滤至1000mL。取其滤液。

②溶解细胞核内的DNA
将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L的溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态 。

③析出含DNA的粘稠物
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 mol／L）
经验值：需加约570mL蒸馏水，且分多次加入。
将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。

④滤取含DNA的粘稠物
用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上，滤液丢弃。

⑤将DNA的粘稠物再溶解
取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒不停地搅拌，约3分钟，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。
⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液
取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。
⑦提取含杂质较少的DNA
在上述滤过的溶液中，加入等体积的、冷却的、体积分数为 95％的酒精溶液 （使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的白色丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。

⑧ DNA的鉴定
取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015 mol／L的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。

五、讨论
①两次使用蒸馏水

第一次：细胞吸水胀破 第一步
第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步

②三次过滤
第一次： DNA存在于滤液里 第一步
第二次： DNA被留在纱布上 第四步
第三次： DNA存在于滤液里 第六步
过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层
③两次析出
第一次：用0.14 mol／L 的NaCI溶液含杂质多 第三步
第二次：用冷却的95％的酒精 第七步

④六次搅拌：第一、二、三、五、七、八步
其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA

为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质

在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。

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