DB65_T 3741-2015 小麦矮腥黑穗病疫情监测规程(新疆维吾尔自治区).pdf

ICS 65.020 B 16 DB65 新疆维吾尔自治区地方标准DB 65fT 3741-2015 小麦矮腥黑穗病疫情监测规程Rules for the Epidemic Monitoring ofDwarfBunt ofWheat 2015-07-10发布2015-09一01实施新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布DB65/T 3741-2015 目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009 标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写的规定编制。本标准由新疆维吾尔自治区植物保护站提出。本标准由新疆维吾尔自治区农业厅归口。本标准起草单位:新疆维吾尔族自治区植物保护站，新疆出入境检验检疫局。本标准主要起草人:李晶、阿丽亚阿不拉、王俊、张煌、祖丽比亚吾布力、朱翔、张祥林。I DB65/T 3741-2015 小麦矮腥黑穗病疫情监测规程1 范围本标准规定了小麦矮腥黑穗病疫情监测的术语和定义、种植区疫情监测、取样、实验室检验、疫情处理、样品保存、结果记录与资料保存、复核。本标准适用于冬小麦种植区田间及相关运输工具、储藏和加工场所小麦矮腥黑穗病菌疫情的监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G8/T 18085植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 TCK ti Iletia controversa kuhn 小麦矮腥黑穗病菌的拉丁文名称为Tilletiacontroversa Kuhn，简称TCK。3.2 疫麦disease of wheat 携带小麦矮腥黑穗病菌的小麦或大麦。3.3 风险区riskzone 适直于小麦矮腥黑穗病菌定殖的沿边前沿区和其他冬小麦种植区以及疫麦运输、储藏、加工的区域。3.4 疫情监测epidemic monitoring 植物检疫执法机构在TCK风险地区按本规范规定的方法进行取样、调查、检疫的过程。4 冬小麦种植区疫情监测DB65/T 3741-2015 4.1 监测时间和地点4.1.1 监测时间和次数冬小麦乳熟至腊熟期调查3次。4.1.2 监测地点冬小麦种植区的TCK高、中、低发生风险区。4.2 监测点范围和数量4.2.1 监测点范围疫区及疫麦运输、储藏和加工场所邻近的冬小麦种植区。4.2.2 监测点数量4.2.2.1 高风险区监测点数量在新疆与哈萨克斯坦接壤的边境地区的冬小麦种植区，以县市行政区域为单位设立68个监测点。4.2.2.2 中风险区监测点数量在新疆与吉尔吉斯坦、塔吉克斯坦、巴基斯坦接壤的边境县市以及临近省区际县市的冬小麦分布区，以县市行政区域为单位设立46个监测点。4.2.2.3 低风险区监测点数量在南北疆其它冬小麦种植区，以县市行政区域为单位设立2个3个监测点。4.3 监测调查方法在监测调查区，采取对角线式或棋盘式调查方法。监测点面积在4hm2及以下时取5个8个调查样点，每个样点调查100株;监测点面积在4hm2以上时取15个20个调查样点，每个样点调查50株。小麦乳熟期与蜡熟期共调查3次。监测结果填入附录A的记录表。4.4 症状观察不同生长阶段的症状表现如下:a)分冀末期至拔节期:株高不及健株1/31/2，分冀多(2个8个)，矮缩丛生状:b)拔节期:叶色黄绿(褪色)，或有黄色的条斑症状:c)孕穗至抽穗期:叶色发青，比健株的叶色稍深，但不发绿:抽穗期开始时正常抽穗，但不开花:d)灌浆期:开始小穗内充满黑粉，菌瘦逐渐长大，并将颖壳涨开;下雨天或早晨露水大时，菌瘦肿大外露，田间有腥臭气味。5 取样5.1 田间取牛羊2 D865/T 3741-2015 田间发现可疑症状，采集菌瘦携回实验室进一步检验，同时采集可疑植株根际半径10cm陌围、深度15cm内的土壤携回实验室检验。5.2 仓储粮及其副产品取样在冬小麦仓储粮及麦款和下脚料副产品堆，分上、中、下3层，按5点取样。根据冬小麦仓储粮及其副产品麦款或下脚料的数量确定取样份数。500kg及以下取样3份;501kg5000kg取样4份5001kg30000kg取样5份30000kg以上取样10份。每份样为1kg。其中0.5kg送检，另O.5kg作为备份保存90d。实验室检验每份样品中随机抽取100g样品用于检测。6 实验室检验6.1 对菌攘的检验采用冬抱子检测法进行检验。见附录B。6.2 对土壤的检验采用冬袍子检测法进行检验。见附录B。6.3 Q-PCR检测见附录C的规定。7 疫情处理7.1 田间疫情处理冬小麦生长期在田间发现可疑小麦矮腥黑穗病发病植株，应立即作好标记，并扩大调查范围(半径5 km)作进一步调查核实。确诊后，立即采取封锁铲除措施，报告上级植物检疫机构。并连续跟踪调查3年5年。7.2 仓储区疫麦处理经检疫，对仓储粮中发现的疫麦，监督货主采用环氧乙:皖、二氧化碳混合熏蒸剂进行熏蒸处理。用药量为50g二氧化碳与环氧乙:院150g/m3熏蒸48h。7.3 加工区疫麦处理在加工麦款和下脚料副产品中发现TCK病菌，监督货主按7.2疫麦处理措施进行灭菌处理。8样品保存保存样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出TCK的样品，常温保存2年3年，保持较好的活性，以备复核。样品保存期满后，应经灭菌后方可处理。9 结果记录与资料保存3 D865/T 3741-2015 记录应包括:样品来源、种类、时间，检测的时间、地点、方法和结果，应有检测人员、审核人员的签字。生物学测定应有症状照片、病原形态照片，聚合酶链式反应(PCR)检测应有电泳结果照片。上述资料应归档并妥善保存。10 复核由新疆维吾尔自治区植保站指定单位和人员对检测结果进行复核，主要考核实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。4 A.1 TCK疫情监测记录表见表A.1。监测点:作物种类监测点样点数调查株数2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 DB65/T 3741-2015 附录A(规范性附录)TCK疫情监测记录表表A.1 TCK疫情监测记录表监测人乳熟期发病株数发病率调查株数时间:一一一一年一一月一B单位(盖章);腊熟期备注发病株数发病率注:监测点面积在4hm2及以下时取5个8个调查样点，每个样点调查100株1监测点面积在4hm2以上时取15个20个调查样点，每个样点调查50株。5 DB65/T 3741-2015 附录B(规范性附录小麦矮腥黑穗病冬于包子检测方法B.1 仪器设备主要仪器设备:真菌抱子捕捉仪、生物显微镜、荧光显微镜、超净工作台、振荡器、台式离心机、光照培养箱、高压灭菌器、微量可调移液器、样品筛(直径10cm.-.-20 cm，孔径分别为200阳、50阳、15m各两个。B.2 化学药品B.2.1 常用化学药品次氯酸锅、吐温20、煎糖、琼脂粉、乙酸钢、拧橡酸、磷酸氢二纳、甲醇、乙醇、乙酸饵、甘油、链霉素、青霉素、无荧光的镜头袖。B.2.2 席尔氏浮载液席尔氏浮载液的配制步骤方法如下:a)第一步，配制麦克凡氏缓冲液CpH8.0)1)称取9.6 g无水拧橡酸溶于250mL纯水中，加甲醇250此，制成A溶液;2)称取14.2g无水磷酸氢二铀榕于250mL纯水中，制成B溶液;3)取A溶液5.5 mL、B溶液194.5 mL进行混合，制成麦克凡氏缓冲液CpH8.0)。b)第二步，称取3g无水乙酸饵溶于150mL麦克凡氏缓冲液中，再加入甘泊60mL，乙醇90mL 混匀。B.3 洗涤迫筛取50g样品倒入250mL三角烧瓶中，加入100mL纯水(含O.1%的吐温20)，振荡30min。分别用孔径200阳、50阳、15阳的尼龙筛网过滤。用清水(含O.凹的吐温20)冲洗收集在15m网筛内的残余物，连同洗涤液一起以1000r/min速度离心3min。视沉淀物量的多少，在沉淀物中加入250L500L席尔浮载液，定容至1mL，分5个玻片涂片后镜检。在显微镜下观察并统计冬抱子数量。B.4 冬子包子形态鉴定B.4.1 冬抱子形态特征描述成熟冬抱子为球形或近球形，黄褐色至暗褐色，直径为16川.-.-25阳，表面有多角状网纹，偶见脑纹状，网脊高1.5m3阳，网目直径3m5m;胶质鞠明显，其厚度等于或略高于网脊，通常为1.5m-5阳，有时胶质鞠不明显。冬抱子堆中有少量不孕细胞，无色光滑，10m18m(平均值为13.7时，6 DB65/T 3741-2015 偶有胶质黯包围。冬抱子萌发时产生有分枝的无隔先菌丝担子)，其顶端轮生大量线形初生担子包子，为8个66卡。B.4.2 冬于包子网脊高度测量TCK冬抱子网脊高度和逻辑斯蒂指数见表B.1。表A.2 TCK冬袍子网脊高度和逻辑斯蒂指数阿脊高度(m)逻辑斯蒂指数网脊高度(m)逻辑斯蒂指数0.05 O.000 1.00 0.717 O.10 O.000 1.05 0.819 O.15 0.000 1.10 0.890 0.20 0.000 1.15 O.935 0.25 0.000 1.20 O.963 O.30 0.001 1.25 0.979 0.35 0.001 1.30 0.988 0.40 0.002 1.35 0.993 0.45 0.004 1.40 0.996 0.50 0.008 1.45 0.998 0.55 0.013 1.50 0.999 0.60 0.024 1.55 0.999 0.65 0.042 1.60 1.000 O.70 O.072 1.65 1.000 O.75 O.122 1.70 1.000 0.80 O.199 1.75 1.000 O.85 0.307 1.80 1.000 0.90 0.442 1.85 1.000 0.95 0.586 1.90 1.000 在配备摄像机和监视屏的显微镜下用100倍观察载玻片进行观察。发现抱子时，将显微镜调整到1000倍，通过油镜观察冬抱子。不测量破碎的抱子。将抱子置于视野中心，将其图象放大至全屏。也可直接输入计算机记录。将显微镜焦距调整到子包子的周边部分以便使子包子的内壁表现为清晰的黑线。由黑线的中心测量到最清晰的刺状网脊顶端，该值为冬抱子网脊高度值。每个子包子测量4次，所选择的测量点应相当于指南针上的4个方向。B.4.3 冬抱子的计数将50g疫麦样品倒入250mL的三角瓶中，加入100mL无菌水进行离心洗涤30min，稀释成冬抱子悬浮液。在40倍或10倍下用血球计数板观察、计数，计算出50g疫麦的抱子总量。B.4.4计数方法B.4.4.1 中国冬拍子计数法7 D865/T 3741-2015 取制备的样品悬浮液10l抱子涂片，分5个玻片涂片后镜检，每张玻片中需观察20个视野，共100个视野，求每个视野中的平均抱子数、CN)，再求出每个视野的面积CSv)，盖玻片面积(Sc),按照公式B.1算出50g种子内的抱子数(C)。C=N x旦旦xS三.(B.1)10 Sv 式中:C一一泡子数:N-一每个视野中的平均抱子数:Sc一一盖玻片面积:Sv一一每个视野的面积。B.4.4.2 美国农业部农业研究所(ARS)制定的样晶冬袍子计数法采用此方法必须先确定样品悬浮液的液滴数(肘，精确测定。样品悬浮液至少要6滴，否则重新制备以满足这个要求。在第一块载玻片上加入1滴悬浮液，在第二块载玻片上加入2滴悬浮液，并分别加盖盖玻片以确保全部分开。再在另外三块载玻片上各加3滴悬浮液，或者直至悬浮液全部用毕。载玻片上的残留应是薄薄的一层，以便易于观察。用显微镜在100 x400 x下观察玻片。明显破损的抱子(即残存不足75%的子包子)，不计算在内。对第一块载玻片上1个液滴中的抱子进行计数(Cl)，该样品内的子包子数(Tl)按公式B.2进行计算。T1=C1 X D.(B.2)式中:T1一一样品内的抱子数:Cl一一第一块载玻片液滴中的抱子数;D一一样品悬浮液的液滴数。当T1大于70时，T1为该样品的甩子总数。当T1不大于70时，应计算第二块载破片上2个液滴中的抱子数，并加上第一块载玻片上的抱子数(Cl+C2)，计算出样品内的抱子数(T2)，计算方式见公式B.3o8 式中:T2一一样品内的抱子数;T2=1Cl+C2)XD.(B.3)3 Cl一一第一块载玻片液滴中的抱子数:C2一一第二块载玻片液滴中的袍子数;D一一样品悬浮液的液滴数。DB65/T 3741-2015 当T2大于50时，T2(四舍五入成整数记录为该样品的自子总数。当T2不大于50时，应计算第三块载玻片上的拍子数，然后把3块载玻片上的子包子数加在一起为Cs，该样品内的甩子数按以下公式B.4进行计算，得出结果T3记录为该样品的子包子总数。T3=旦旦旦.(B.4)6 式中:T3一一样品内的抱子数:C3一-3块载玻片上甩子数的合计数:D一一样品悬浮液的液滴数。B.5 自发荧光显微检验法发现菌瘦时，可采用自发荧光显微检验法，检验方法见GB!T18085。日6冬于包子萌发试验当冬甩子白发荧光率为31%79%，加之形态又不能确定时，应进行冬子包子萌发试验。将袍子首先用0.25%次氯酸铀消毒3min，再制成悬浑液接种子3%的水琼脂培养基(含5x10-580万单位青霉素和100万单位的链霉素)上(10 x10视野下40个60个甩子)，分别置于50C:!:lOC和190C土lOC，有连续光照或12h黑暗条件下培养。小麦矮腥黑穗病成熟冬子包子在50C条件下21d后开始萌发，190C下不能萌发;若50C和190C均可萌发，则不是小麦矮腥黑穗病。9 OB65/T 3741-2015 C.1 Q-PCR试剂及配制方法C.1.1 A液附录c(规范性附录Q-PCR检测方法0.2 M磷酸二氢铀水榕液，取NaH2P04 H2 0 27.6 g，力日蒸馆水溶解，定容至1000mL C.1.2 B液0.2 M磷酸氢二铀水溶液，取NaP04.7H2 0 53.6 g，也可用Na2日P04 12H2 0 71.6 g或NaP04.2H2 0 35.6 g，加蒸惰水洛解，定容至1000mL。C.1.3 磷酸盐缓冲液(PBS)A液14mL,加B液36mL I昆匀，pH 7.20 C.1.4 冬于包子裂解液3M NaOH，取NaOH6.0 g溶于450mL水中，加水定容至500mL。C.1.5 DNA释放剂含有2%CTAB,100 mM Tris-HCl,20 1TIJ1 EDTA,1.41TIJ1 NaCl,pH 8.0。使用前加入终浓度0.5%(v/v)的-琉基乙醇。C.1.6 DNA提取液Tris饱和盼、氯仿、异戊醇按25:24:1比例混合。C.1.7 TE缓冲液0.1 M Tris-HCl(pH 7.4)20 mL加入0.5M EDTA(pH 8.0)40 此，用超纯水定容至200mL,40C保存。C.1.8 ONA洗涤液75%乙醇溶液，-20oC预冷。1.9 SYBR Q-PCR反应混合液(SYBRGreen Real time PCR Master mix)含dNTPs、Mg2热启动DNA聚合酶、PCR缓冲液、SYBRGreen 1染料，使用按市售产品要求进行。C.2 样品DNA制备C.2.1 麦粒、麦款或下脚料中冬袍子DNA提取10 D865/T 3741-2015 C.2.1.1 目测有无菌摆如有菌瘦直接拣出，取菌瘦1/4粒捣碎加入灭菌的1.5 mL离心管，力日适量淀粉酶处理，离心去掉上清液。加入灭菌的1.5 mL离心管，每管加入600L冬抱子裂解液，65C水浴30min;取出离心管，1M HCl中和，8000 g离心1min;收集沉淀，用无菌水冲洗至pH值为78oC.2.1.2 未发现菌攘的样晶过网目为40目、80目、200目的分样套筛;收集200目样品备用。取过筛样品0.5g，按C.2.1.1 处理。C.2.1.3 冬于包子DNA提取将沉淀(冬于包子小心转置于载玻片上，取另一载玻片与其滑动摩擦碾压破碎冬抱子外壁，每隔一段时间在显微镜下检查冬抱子至绝大多数抱子外壁破碎;加入100LDNA提取液于玻片上，将液体吸起转移到一支新离心管中，再用40011 L DNA提取液分次清洗玻片，转移清洗液子上述离心管中。65C水浴1ho将离心管11000g离心10min，吸取上清液加入微滤柱中，10000 g离心1min，弃滤过液;向离心微滤柱中加入预冷的DNA洗涤液750此，10000 g离心1min，弃滤过液;重复1次。将微滤柱10000g离心1min,除去残余乙醇;向微滤柱中加入50LTE缓冲液，10000 g离心1 min洗脱DNA，收集洗脱液，即为PCR检测的待测模板DNAoC.2.2 小麦植株组织中菌丝体DNA提取取待检小麦植物组织样品1.0 g剪碎于灭菌预冻的研钵中加液氮充分研磨，加10mL PBS液混匀，4 C 8000g离心15min;取沉淀转入1.5 Ml离心管中。离心管中加入400LDNA释放剂，650C 水浴保温1h，其间每隔10min剧烈振荡泪匀l次;加入等体积的DNA提取液，10000g离心20min。取上层水相至微滤柱中(如有机相与水相间界面不清晰，可用DNA提取液再抽提1次)，10000 g离心1 min，弃滤液:向微滤柱中加入预冷的DNA清洗液7501，10000 g离心1min，弃滤液，重复清洗1次。将微滤柱10000g离心1min，除去残余乙醇;向微滤柱中加入50LTE缓冲液，10000 g离心1min，收集滤液，即为PCR检测的待测模板DNAoC.2.3 阳性对照和阴性对照DNA制备制备样品DNA时，同时使用相应材料和方法制备阳性对照DNA和阴性对照DNA。C.2.4 模板DNA的保存提取的模板DNA最好在24h内使用;在40C条件下保存应不超过1用，在-200C冻存不超过30d，避免反复冻融。C.3 检测方法C.3.1 特异性引物对用无菌超纯水配制25MTCK特异引物对TCK-U和TCK-L母液，引物序列为CQUTCKf-5-AGTGCTGAGGCCGAAAAGGT-3,CQUTCKr一5-TTCTGGGCTCCA CGA CGTAT-3。所扩增的TCK特异性片段大小为200bpo C.3.2 反应体系11 DB65/T 3741-2015 PCR反应体积为25L，其中包括1XPCR荧光染料主混合反应液(含dNTPs、Mg2热启动DNA聚合酶、缓冲液、dNTPS、SYBRGreen 1染料),0.4mo1/L引物对、CQUTCKf/CQUTCKr.。同时设定阳性对照和阴性对照。加样完成后，3000 g瞬时离I。C.3.3 扩增程序Q一PCR仪扩增程序为95.C4 min;94.C 15 s,61.C 30s,72.C 30 s，共40个循环，在每个循环的延伸阶段72.C时采集荧光10s;72.C,7min。不同Q-PCR仪扩增程序参数可能稍有变化。3.4熔解曲线分析烙解曲线的程序为95.C，1 min;55.C,1 min;从55.C开始每升高0.5.C保持10s，连续升高80次，到95.C止。12