基于UPLC_LTQ Orbitrap Velos MS的创伤性脑损伤代谢组学分析.pdf

：研究生园地基于 的创伤性脑损伤代谢组学分析周惠惠，程桂青，田璐，周愿，李洪春，（徐州医科大学医学技术学院，江苏徐州；徐州医科大学附属医院检验科，江苏徐州）摘要：目的 联合非靶向和靶向代谢组学技术检测创伤性脑损伤（，）差异代谢物，并评估其与病情严重程度及预后的关系。方法 选取徐州医科大学附属医院 年 月至 月就诊的 患者（组）和体检健康者（健康人对照组）各 例，应用超高效液相色谱线性离子阱 静电场轨道阱组合式高分辨质谱（）筛选并验证差异代谢物。记录 例 患者入院 内格拉斯哥昏迷评分（，）和伤后 个月格拉斯哥预后评分（，），结合差异代谢物评估疾病严重程度和预后。结果 验证的 个差异代谢物（谷氨酸、尿酸、肌酐和乳酸）存在显著分离趋势，组谷氨酸和乳酸水平显著高于健康人对照组，尿酸和肌酐水平显著低于健康人对照组；随着伤情加重，患者谷氨酸和乳酸水平逐渐升高，尿酸和肌酐水平逐渐降低；影响预后不良的 种代谢物组 曲线下面积（）为，敏感性为，特异性为（）。结论谷氨酸、乳酸、尿酸和肌酐与 患者病情密切相关，四者联合或可用于预测 的预后。关键词：创伤性脑损伤；代谢组学；生物学标志物；超高效液相色谱线性离子阱 静电场轨道阱组合式高分辨质谱；严重程度；预后中图分类号：文献标志码：，（，；，）：（），（）（）（，），（），：；创伤性脑损伤（，）是由外力作用而导致的脑部损伤，具有较高的死亡率和致残率，是严重威胁人类健康的公共卫生问题之一。格拉斯哥昏迷评分（，）等认知测试具有快速、低成本、无创、易于应用的特点，但由于受检查者的主观判断影响，通常临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基金项目：徐州医科大学优秀人才科研启动基金项目（）。作者简介：周惠惠，年生，女，硕士研究生，主要从事临床生物化学检验研究。通信作者：李洪春，副教授，：。只作为 的筛查方法。颅脑创伤患者脑监测技术中国专家共识指出，强烈推荐影像学检查作为首选辅助检查，推荐脑生物学标志物检测，如胶质纤维酸性蛋白和泛素羧基末端水解酶 用于识别轻度 患者。但影像学技术费用昂贵，且使许多患者暴露于不必要的电离辐射，增加急诊科的负担，故而开发新的血清生物学标志物有助于提高临床决策规则的作用。本研究旨在利用非靶向和靶向代谢组学方法探索新的 潜在生物学标志物，用于辅助早期诊断、判断病情及预后，并加深对 代谢改变的认识，以期寻找治疗靶点。材料和方法 研究对象 选取徐州医科大学附属医院 年 月至 月就诊的 患者（组）和体检健康者（健康人对照组）各 例进行非靶向分析筛选和靶向分析验证。患者 评分在入院 内根据睁眼反应、语言反应和运动反应 个方面进行评估，分为重型（分，），中型（分，）和轻型（分，）；格拉斯哥预后评分（，）在患者伤后 个月进行评估，分为预后不良组（分，）和预后良好组（分，）。收集所有受试者的一般信息和实验室检测指标等临床资料。本研究经徐州医科大学附属医院伦理委员会批准（），所有受试者均知情同意。仪器与试剂 高效液相色谱仪（美国 公司），高分辨质谱仪（美国赛默飞世尔科技公司），离心机（德国 公司）。色谱柱：柱（，）；流动相中 相：水（含甲酸乙腈），相：乙腈（含 甲酸水）；柱温：；流速：；流动相梯度体系：，；，；，；，。乙腈、甲醇（美国赛默飞世尔科技公司）。样本制备 规范采集 患者创伤 内及 个月后的空腹静脉血标本，、离心，移取 上清液置于 离心管中，加入 蛋白质沉淀剂（甲醇乙腈体积比）涡旋震荡 ，、离心，取上清液 置于离心浓缩仪中干燥，加入 乙腈水（体积比）复溶，离心 ，取上清加入进样小瓶，用于质谱检测。质谱检测 超高效液相色谱线性离子阱 静电场轨道阱组合式高分辨质谱（）步骤：进样量为 ，载气为氮气，流速恒定为 ，柱温为 。设置：模式，电喷雾毛细管电压（正离子为 ；负离子为 ），毛细管温度为 ，扫描范围为 ，锥孔电压为 ，锥空气流速为 ，最大进样时间为 ，动态排除为 ，分辨率为 ，分辨率为 。数据处理及统计学分析采用 软件对原始光谱进行数据预处理获得峰强度矩阵，将数据导入 软件进行多元变量统计分析，包括主成分分析（，）和正交偏最小二乘法判别分析（，），交叉验证采用、等参数评价 模型质量，通过 次置换检验评价模型拟合程度。设置单变量统计分析 检验中 和倍数变化（，）或，变量投影重要度（，），作为差异代谢物筛选条件。用 软件将差异代谢物导入京都基因和基因组百科全书（，）数据库进行差异代谢物富集通路分析和分层聚类。采用 软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数标准差（）表示，不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数）（，）表示，计数资料以 和表示，两组间比较采用独立样本 检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 检验；相关性分析采用 相关分析，以 为差异具有统计学意义。结果 两组受试者一般临床特征和生化指标分析 组血清天冬氨酸氨基转移酶和葡萄糖水平显著高于健康人对照组，前清蛋白、总蛋白、清蛋白、球蛋白、肌酐、尿酸、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平显著低于健康人对照组，差异均有统计学意义（）。两组受试者年龄、丙氨酸氨基转移酶、尿素和三酰甘油之间的差异无统计学意义。见表。临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，表 组和健康人对照组一般临床特征和生化指标参数 组（）健康人对照组（）值年龄（岁）评分天冬氨酸氨基转移酶（）（，）（，）丙氨酸氨基转移酶（）（，）（，）前清蛋白（）总蛋白（）清蛋白（）球蛋白（）（，）（，）尿素（）肌酐（）尿酸（）半胱氨酸蛋白酶抑制剂（）葡萄糖（）（，）（，）总胆固醇（）三酰甘油（）（，）（，）高密度脂蛋白胆固醇（）（，）（，）低密度脂蛋白胆固醇（）两组代谢模式对比结果根据峰强度进行 和 分析。分析显示（图、）两组样本代谢物存在显著差异，阳离子模式（）和 分别为 和；阴离子模式（）和 分别为 和。分析显示组间存在显著差异（图、），阳离子模式 （），（），；阴离子模式（），（），。次置换试验（图、）阳离子模式 和 分别为 和，阴离子模式 和 分别为 和。火山图用于反映血清中差异代谢物的总体分布情况，见图。注：、，模型，每个点代表一位受试者样本，绝大多数样本都在 可信区间内，显示两种不同的类聚现象；、，模型，横坐标表示主成分得分值，反映组间差异，纵坐标表示正交成分得分值，反映组内差异；、，置换检验模型，与 轴的回归线截距，表明模型不存在“过拟合”现象。图 组与健康人对照组代谢谱临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，图 组与健康人对照组差异代谢物火山图 患者差异代谢物的筛选结果 根据、或 筛选出 个差异代谢物，选择丰度变化最大的前 个差异代谢物绘制热图，观察代谢物的全局表达量和聚类关系。见图。注：横轴为样本分组名称，纵轴为丰度变化最大的前 个差异代谢物聚类分析，红色表示丰度较高，蓝色表示丰度较低。图 组与健康人对照组差异代谢物热图 患者差异代谢物 富集通路分析结果表明，与健康人对照组相比，组存在 个显著代谢富集通路，分别为：（）不饱和脂肪酸生物合成；（）氨酰基 生物合成；（）精氨酸生物合成；（）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；（）柠檬酸循环（循环）；（）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。见图。临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，注：颜色由黄变红表示 值依次降低，富集系数越大（黑点直径越大）表示富集到该通路上的代谢物数目越多，右上角的点代表的代谢富集通路最具有显著性。图 组与健康人对照组代谢富集通路分析 患者候选生物学标志物的筛选和验证将 个差异代谢物绘制 曲线，根据 筛选出 个候选生物学标志物，再对所有血清样本进行靶向定量分析，最终明确谷氨酸、乳酸、尿酸和肌酐与非靶向代谢结果一致。见表。表 组和健康人对照组候选生物学标志物筛选结果趋势候选生物学标志物分子式 值保留时间（）质荷比谷氨酸乳酸尿酸肌酐 不同严重程度 组与健康人对照组差异代谢物水平比较 组不同严重程度的血清谷氨酸和乳酸水平均显著高于健康人对照组，尿酸和肌酐水平均显著低于健康人对照组，差异有统计学意义（）；随着 病情加重，患者血清谷氨酸和乳酸浓度逐渐升高，尿酸和肌酐浓度逐渐降低，差异有统计学意义（）。见表。表 不同严重程度 组与健康人对照组差异代谢物水平比较组别例数（）差异代谢物浓度（）谷氨酸乳酸尿酸肌酐重型 组 中型 组 轻型 组 健康人对照组 值 值注：，与健康人对照组相比，；，与轻型 组相比，；，与中型 组相比，。预后良好组与预后不良组差异代谢物水平比较 预后不良组血清谷氨酸和乳酸浓度高于预后良好组，尿酸和肌酐浓度低于预后良好组（）。见表。临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，表 患者预后良好组与预后不良组差异代谢物水平比较组别例数（）差异代谢物浓度（）谷氨酸乳酸尿酸肌酐预后不良组 预后良好组 值 值 相关性分析结果 例 患者 相关性分析结果见表。其中谷氨酸和乳酸水平与入院 的 评分和伤后 个月的 评分呈负相关，而尿酸和肌酐与其呈正相关（）。表 患者 相关性分析（）代谢指标 值谷氨酸乳酸尿酸肌酐 影响预后不良的 曲线分析谷氨酸、乳酸、尿酸、肌酐单项和四者联合的代谢物组 分别为、，和，联合检测提高了预测 预后不良的敏感性（）和特异性（）。见表。表 谷氨酸、乳酸、尿酸和肌酐预测预后不良的 曲线模型参数指标（）标准误 值 值敏感性（）特异性（）谷氨酸（）乳酸（）尿酸（）肌酐（）代谢物组（）讨论 机制复杂多样，与神经退行性疾病的关系尚未阐明，不同严重程度的 也需要不同的治疗策略。目前 的检测主要依赖于影像学，但存在早期漏检的问题。本研究以血清样本为研究对象，探讨了 患者代谢谱的差异，结果证实谷氨酸、乳酸、尿酸、肌酐为可靠的差异代谢物，不饱和脂肪酸的生物合成是 受影响最大的代谢富集通路，并将代谢物与病情严重程度和预后联系起来。笔者选择了 例 患者，将其按照入院 评分和伤后 个月 评分进行分组，结果发现这 种差异代谢物在不同严重程度和预后的患者之间也存在差异，四者联合预测预后的 为，敏感性和特异性分别为 和。谷氨酸和乳酸是糖类代谢的重要中间产物。后脑组织损伤中断大脑有氧氧化过程，导致机体代偿性生成谷氨酸和乳酸。谷氨酸与草酰乙酸转氨基生成 酮戊二酸，维持三羧酸循环能量供应，并转化为谷氨酰胺进入神经元，参与神经传递；另一方面，谷氨酸作为中枢神经系统兴奋性神经递质，在突触大量释放后激活相应的 甲基天冬氨酸受体和 氨基羟基甲基异恶唑丙酸受体，介导钙流入神经元调控蛋白的信号转导和磷酸化去磷 酸 化，导 致 线 粒 体 功 能 障 碍 和 神 经 元 凋亡；同时钙促进活性氧自由基（，）的产生激活了磷脂酶 介导的炎症反应。有文献报道大量谷氨酸的兴奋性毒性是导致进行性神经功能衰退的重要因素；另有研究表明，外源性乳酸可能成为脑损伤和神经退行性疾病的潜在治疗干预手段。本研究中 患者谷氨酸和乳酸升高，且随着病情加重逐渐增加，谷氨酸的神经毒性可能继发一系列神经退行性改变，乳酸对抗脑损伤引起的脑水肿、脑细胞死亡和神经代谢异常，故而在创伤早期提高血清乳酸水平可能缓解早期脑水肿症状，预防损伤进一步发生。尿酸和肌酐是人体内的抗氧化剂，具有对抗氧化应激保护神经，激活神经干细胞增殖，参与神经损伤修复的作用。等发现 患者和脑肿瘤手术患者血清尿酸水平均下降，且下降水平与 评分相关；还有研究表明，帕金森患者血清尿酸水平随着疾病的进展而下降；等发现血清尿酸和肌酐联合其他预后因素可帮助预测男性 患者的预后；此外，另有研究证实血清肌临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，酐水平与全因痴呆相关。上述研究与本研究结果相一致，患者血清尿酸和肌酐水平低于健康人对照组，且病情越严重，尿酸和肌酐水平越低，与入院 评分和伤后 个月 评分呈正相关，生化结果也一致显示尿酸水平降低，因此联合测定肌酐和尿酸水平对创伤后评价肾脏功能、疾病严重程度及预防并发症具有重要意义。曹朝梁研究认为 后血尿酸升高且随着严重程度增加，尿酸水平越高，患者预后越差。与本研究结果相反，但具体原因有待收集更多样本进一步验证。本研究存在以下不足之处：首先，的诊断是基于临床症状和影像技术，可能会遗漏低能损伤患者；其次，脑脊液是反映血脑屏障破坏最理想样本，由于是有创操作，本实验仅收集血清样本进行代谢组学分析，后续将扩大样本量并收集多元化样本进行比较。参考文献夏照帆，伍国胜 创伤性脑损伤的临床研究进展 第二军医大学学报，（）：，（），（）：，（）：中华医学会神经外科学分会颅脑创伤专业组，中华医学会创伤学分会神经损伤专业组 颅脑创伤患者脑监测技术中国专家共识 中华神经外科杂志，（）：（），（）：陈水斌，汤奕林，欧阳林，等 磁共振弥散张量成像在创伤性脑损伤临床诊断和预后评估的应用价值 医学影像学杂志，（）：乔郅钠，徐美娟，龙梦飞，等 循环关键节点对 谷氨酸合成的影响 生物工程学报，（）：，：，：，：，：，（）：，：，：，：，：，（）：，（）：，：？，（）：，：，（）：曹朝梁 血尿酸及胰岛素样生长因子 在急性创伤性脑损伤早期诊断及预后评估中的临床价值 中国卫生检验杂志，（）：（收稿日期：）（本文编辑：许晓蒙）临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，