腺病毒载体构建.ppt

重组腺病毒的构建1精品腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微米的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252个。核酸是双链DNA，分子量2025106。无包膜。在被感染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到细胞核。腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒症状、呼吸系统不适等。腺病毒腺病毒2精品腺病毒腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它通过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中.3精品 ITR E1a/E1b E2 E3 E4 ITR腺病毒的基因及其功能腺病毒的基因及其功能 腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚期表达。早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。E2蛋白涉及AdDNA复制 E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统 E4蛋白调节有效的晚期基因转录4精品腺病毒分类第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代 载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用，体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛科研、临床应用最广泛 ，一般常用，一般常用Ad5Ad5型腺病毒型腺病毒）第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代 载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒 基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。5精品腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础重组系统由2种质粒构成：一、包含全部（或右侧大部分）腺病毒基因组DNA的大质粒，即骨架质粒6精品二、小的穿梭质粒，其带有目的基因的表达盒以及表达盒两侧的与大质粒上的目的基因拟插入部位同源序列（左右臂）7精品8精品AdEasy腺病毒载体系统腺病毒载体系统腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在连续传代中保持不变，易于用重组连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。技术操作。可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处于分裂状态的细胞。于分裂状态的细胞。可经不同途径进入不同组织可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可可以在肠道内繁殖，也可以以 在呼吸道内繁殖。在呼吸道内繁殖。改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb，腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。稳定稳定稳定稳定性高性高性高性高宿主范宿主范宿主范宿主范 围广围广围广围广感染性感染性感染性感染性 强强强强包装容量包装容量包装容量包装容量 大大大大安全性好安全性好安全性好安全性好9精品几种病毒载体的区别10精品11精品