高中生物选修一---植物组织培养技术.ppt

一、植物组织培养的概念一、植物组织培养的概念 1.1.概概 念念 植物组织培养（植物组织培养（Plant tissue Plant tissue cultureculture）广义上是指无菌条件下，在特定）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。术。.2.2.主要特征主要特征 （1 1）在培养）在培养容器中容器中进行；进行；（2 2）无菌无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；等的侵入；（3 3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于等物理因子处于人工控制人工控制之下，并可达到最适条件。之下，并可达到最适条件。（4 4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5 5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。微结构进行操作成为可能。.二、植物组织培养类型：二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。根据不同分类的依据可以分为不同类型。根据培养材料不同分为：根据培养材料不同分为：（1 1）完整植株培养：对幼苗和较大植株等的培养。）完整植株培养：对幼苗和较大植株等的培养。（2 2）胚胎培养：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。）胚胎培养：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。（3 3）器官培养：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花的培养。）器官培养：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花的培养。（4 4）组织培养：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。）组织培养：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。（5 5）细胞培养：对单细胞或较小的细胞团进行培养。）细胞培养：对单细胞或较小的细胞团进行培养。（6 6）原生质体培养：对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养）原生质体培养：对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养.矮牵牛茎尖离体培养培养矮牵牛茎尖离体培养培养.人参细胞人参细胞悬浮培养悬浮培养.三、植物组织培养技术的理论基础三、植物组织培养技术的理论基础 植物细胞的全能性植物细胞的全能性(Plant cellular totipotency）从理论上讲，植物体的每个生活从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有该细胞都具有该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。下，具有发育成完整植株的潜在能力。.分化、脱分化与再分化：分化、脱分化与再分化：分化是指个体发育过分化是指个体发育过程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能发生程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能发生改变，形成不同组织或器官。改变，形成不同组织或器官。脱分化也称去分化，是指离体条件下生长的细胞、组脱分化也称去分化，是指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。再分化是由脱成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。再分化是由脱分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的过程。过程。细胞全能性的表达：细胞全能性的表达：尽管理论上每个细胞都具尽管理论上每个细胞都具有全能性，但实际表达难易程度却随有全能性，但实际表达难易程度却随植物种类、植物种类、组织和细胞的不同而异。组织和细胞的不同而异。.1 1 实验室设置及仪器设备实验室设置及仪器设备2 2 实验基本操作实验基本操作3 3 培养基的成分及其配制培养基的成分及其配制4 4 培养条件的选择培养条件的选择.1 1 实验室设置及仪器设备实验室设置及仪器设备 实验室是进行组培研究的主要场所，应实验室是进行组培研究的主要场所，应能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌操作、培养、鉴定等多方面的工作。操作、培养、鉴定等多方面的工作。.1 1基本实验室基本实验室1.1 1.1 洗涤洗涤 根据工作量的大小决定其大小，一般面积控根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在制在30-50m30-50m2 2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2 2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备可以购置一台洗瓶机。准备1-21-2个洗液缸，专门个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地面应地面应耐湿并排水良好耐湿并排水良好。.配备的主要仪器设备有配备的主要仪器设备有：天平、微波炉、：天平、微波炉、pH计、计、药品柜、器械柜、电炉、各种规格的培养瓶、培药品柜、器械柜、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶、养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶、冰箱等。冰箱等。冰箱用于储存培养基冰箱用于储存培养基母液母液、激素维生素等贵重药、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同感量。感量。1.2配制培养基配制培养基?.配备高压灭菌锅、排风灭火设备等。配备高压灭菌锅、排风灭火设备等。如果没有条件的话，可以将上述工作如果没有条件的话，可以将上述工作合并合并成一成一个准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房间个准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房间要明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。要明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。1.3 消毒消毒.无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有室内应配有超净工作台超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种，紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。接种器械等。1.4 无菌操作室无菌操作室？.为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内扇。室内温度温度由空调控制，由空调控制，光照光照由日光灯控制。一般要由日光灯控制。一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、摇床、光照培养箱、生化培培养室应配有培养架、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W，固定在培养，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度为，光照强度为2000-3000lx。1.5 培养室培养室.为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。2.2、温室、温室.（一）、灭菌工作是极其重要的。（一）、灭菌工作是极其重要的。首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：有菌：有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。无菌无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）物理或化学处理；物理或化学处理；火烤后的物体；火烤后的物体；健康的动植物不与内外部表面接触的组织健康的动植物不与内外部表面接触的组织 内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但 不会影响培养，也不会污染）不会影响培养，也不会污染）灭菌灭菌2 2 实验基本操作实验基本操作.1 1、物理方法物理方法：干热、：干热、湿热湿热、过滤（、过滤（0.250.25微微米）、紫外灯、超声波等。米）、紫外灯、超声波等。2 2、化学方法化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等双氧水、福尔马林等 （二）、灭菌的方法（二）、灭菌的方法.干热灭菌干热灭菌 玻璃器皿、器械玻璃器皿、器械 湿热灭菌湿热灭菌 培养基、蒸馏水、器械、棉塞等培养基、蒸馏水、器械、棉塞等熏蒸灭菌熏蒸灭菌 接种室、培养室接种室、培养室过滤灭菌过滤灭菌 液体培养基、蒸馏水液体培养基、蒸馏水药剂灭菌药剂灭菌 培养材料培养材料烧灼灭菌烧灼灭菌 器械、瓶口、棉塞、包头纸器械、瓶口、棉塞、包头纸辐射灭菌辐射灭菌 接种室、培养间接种室、培养间各种灭菌方法及其使用范围各种灭菌方法及其使用范围.适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：法：150 150、40min40min或或120 120、120min120min，如，如果发现芽孢杆菌，果发现芽孢杆菌，160 160、9090120min120min（1 1）干热灭菌）干热灭菌.适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。棉塞、纸等。121 121 维持维持202030min30min注意点：加足水、排尽气、气压降到注意点：加足水、排尽气、气压降到0 0时，时，才能开盖才能开盖（2 2）湿热灭菌）湿热灭菌.培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌清等也需要过滤灭菌 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.220.220.450.45微微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至5050左右时，加入适量的激素，然后分装。左右时，加入适量的激素，然后分装。（3 3）过滤灭菌）过滤灭菌.主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间空气、操作台等，灭菌时间202030min30min。注意：关灯后注意：关灯后5min5min后再进入。超净工作台后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。关灯后要打开风机。（4 4）射线灭菌）射线灭菌.用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。接种器皿的灭菌。（5 5）火焰灼烧灭菌）火焰灼烧灭菌.适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较消消 毒毒 剂剂使用浓度使用浓度(%)(%)消毒时间消毒时间(min)(min)效效 果果残液去除残液去除难易难易乙醇乙醇70-7570-750.1-30.1-3好好易易新洁尔灭新洁尔灭101020205 53030好好易易氯化汞氯化汞0.10.11 12 21515最好最好最难最难过氧化氢过氧化氢101012125 51515较好较好最易最易抗菌素抗菌素4 450mgl50mgl-1-130306060较好较好较难较难次氯酸钙次氯酸钙/纳纳9 9 10105 53030好好易易（6 6）消毒剂）消毒剂.长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲甲醛、高锰酸钾熏蒸醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每立方米空间甲醛的用量通常按每立方米空间2-62-6毫升计算，毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲即挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。发为气体。熏蒸灭菌熏蒸灭菌.甲醛熏蒸接种室应至少在使用前甲醛熏蒸接种室应至少在使用前2424小时进行，熏蒸后小时进行，熏蒸后密闭保持密闭保持4 4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2 2小时进行。小时进行。对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸.人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素物品因素器器皿皿和和用用具具培养皿：洗培养皿：洗热压热压 玻璃器皿：洗玻璃器皿：洗干热（干热箱）或晾干干热（干热箱）或晾干 接种用具：用接种用具：用CCLCCL4 4布擦布擦湿布擦湿布擦 泡泡75%95%75%95%酒精酒精烧烧培养基：湿热培养基：湿热培培养养材材料料外部细菌：用水冲洗外部细菌：用水冲洗化学药剂处理化学药剂处理 内部细菌内部细菌 茎尖培养茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸用化学试剂薰蒸污染来源污染来源三、无菌操作技术三、无菌操作技术.1 1、实验器具和材料的准备、实验器具和材料的准备2 2、用、用75%75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌净工作台用紫外灯杀菌20min-30min20min-30min。注意：台面。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。菌效果。3 3、关紫外灯、打开风机，过、关紫外灯、打开风机，过5-10min5-10min进入缓冲间，进入缓冲间，以以75%75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）作台）.4 4、用、用70707575的的酒精酒精拭擦台面并拭擦台面并消毒双手消毒双手。试验。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在注意：所有操作应在火焰近处火焰近处并经过灼烧并经过灼烧进行进行。金。金属器械不能过度灼烧。移液管不能灼烧，培养瓶口、属器械不能过度灼烧。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。.5 5、取流水冲洗（至少、取流水冲洗（至少30min30min）过的外植体，用一定）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3434次，放入无菌次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。械进行分离、切割或其他处理。.6 6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。灼烧瓶口，盖上瓶塞。7 7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。.注意注意（1 1）进行培养时，）进行培养时，动作要准确敏捷动作要准确敏捷，但又不必，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（太快，以防空气流动，增加污染机会。（2 2）不能用不能用手触及已消毒器皿手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。取备品更换。（3 3）为拿取方便，工作台面上的用品）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4 4）工）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。即封闭瓶口直立可增加落菌机会。.（5 5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。胞交叉污染。（6 6）工作中）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽不能面向操作区讲话或咳嗽，以，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7 7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。管丢掉。.整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速迅速正正 确确 错错 误误.接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染防止操作带来的污染正正 确确 错错 误误.接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正正 确确 错错 误误.瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正正 确确 错错 误误.接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生.种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正正 确确 错错 误误.接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中态学上端露于空气中正正 确确 错错 误误.用于外植体分离的母体植物材料一般有用于外植体分离的母体植物材料一般有3种来源：种来源：一是一是生长在自然环境下的植物生长在自然环境下的植物；二是；二是在温室控制在温室控制环境条件下生长的植物环境条件下生长的植物；三是；三是无菌环境下已经过无菌环境下已经过离体培养的植物离体培养的植物。四、外植体的选择与处理技术四、外植体的选择与处理技术.1 1、选择优良的基因型、选择优良的基因型 试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁，也应选择有价值的植物。繁，也应选择有价值的植物。2 2、取材、取材 从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容易成功。易成功。（一）、外植体的选择（一）、外植体的选择.3.3.培养基的成分及其配制培养基的成分及其配制一、培养基的成分及其作用一、培养基的成分及其作用（一）（一）无机营养物质无机营养物质 培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了要连续的供给某些无机化学物质，除了C C、H H、O O之外，之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量营养元素。元素叫微量营养元素。.培养基的大量元素使用量一般在培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千每升几十至几千毫克毫克。大量元素包括。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,SN,P,K,Ca,Mg,S。培养基中加入量最多的是培养基中加入量最多的是N N，N N一般以硝酸盐或氨一般以硝酸盐或氨盐，或者两者结合的盐提供盐，或者两者结合的盐提供大量元素大量元素.微量元素的用量一般微量元素的用量一般每升不高于几十毫克每升不高于几十毫克。植物所。植物所需的微量元素有需的微量元素有FeFe、CuCu、ZnZn、B B、MoMo、MnMn、CoCo，ClCl其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。毒害现象。微量元素微量元素.（二）（二）.有机化合物有机化合物有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物质和一些其它的有机添加物质和一些其它的有机添加物1、维生素类物质、维生素类物质 维生素类物质在酶系统中有催化功能。维生素类物质在酶系统中有催化功能。硫胺素（硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆醇（吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（）促进根的生长，烟酸（VB3，又称，又称维生素维生素PP）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙（酸钙（VB5）、生物素（）、生物素（VH）、钴胺素（）、钴胺素（VB12）、）、叶酸（叶酸（VBc），），Vc等。等。.2、AA类物质类物质绝大多数绝大多数AA适量时对培养效果都有正象效应。常用适量时对培养效果都有正象效应。常用的有的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。用水解乳蛋白和水解酪蛋白。.3 3、糖类、糖类糖在培养基的作用：糖在培养基的作用：1 1）、为细胞提供合成新物质的碳骨架）、为细胞提供合成新物质的碳骨架 2 2）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3 3）、维持渗透压）、维持渗透压蔗糖蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。用的碳源。.4、其它有机物质、其它有机物质1）肌醇（环己六醇）肌醇（环己六醇）肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成2）天然有机物天然有机物一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。现出了良好的促进作用。.n植物激素是在植物体内合成的，对植物植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量有机物，生长发育有显著调节作用的微量有机物，而而植物生长调节植物生长调节剂是外源的调节植物生剂是外源的调节植物生长发育的物质。长发育的物质。n无机元素和有机营养构成的培养基仅保无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，只有证培养物的生存与最低生理活动，只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。分裂、脱分化和再分化。（三）、植物生长调节物质（三）、植物生长调节物质.1 1、生长素类：、生长素类：1 1）吲哚类：）吲哚类：IAAIAA（吲哚乙酸）、（吲哚乙酸）、IBAIBA（吲哚丁酸）（吲哚丁酸）、IPAIPA（吲哚丙酸）（吲哚丙酸）2 2）萘酸类：）萘酸类：NAANAA（萘乙酸）（萘乙酸）3 3）苯氧羧酸类：）苯氧羧酸类：2,4-D2,4-D（2,4-2,4-二氯苯氧乙酸）、二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T2,4,5-T（2,4,5-2,4,5-三氯苯氧乙酸）、三氯苯氧乙酸）、2,4,5-T2,4,5-TP P（2,4,5-2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。强的生长素。.生长素的生理作用生长素的生理作用1 1、促进细胞生长和细胞分裂、促进细胞生长和细胞分裂2 2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力3 3、形成愈伤组织，促进生根、形成愈伤组织，促进生根4 4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。导。.A A：NAA 0mg/LNAA 0mg/L，芽（少），根（无），芽（少），根（无）B B：NAA 0.1mg/LNAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量），芽（少），根（无），愈伤组织（少量）C C：NAA 5.0mg/LNAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量A B C.2、细胞分裂素、细胞分裂素n是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（6-6-糠基糠基氨基嘌呤氨基嘌呤KTKT）、）、6-6-苄基氨基嘌呤（苄基氨基嘌呤（6-BA6-BA）和玉）和玉米素（米素（ZTZT）等。其中最常用的是）等。其中最常用的是66苄基氨基苄基氨基嘌呤。嘌呤。n功能：功能：1 1、促进细胞的分裂和分化、促进细胞的分裂和分化2 2、诱导芽的分化、诱导芽的分化3 3、促进侧芽的萌发和生长、促进侧芽的萌发和生长4 4、抑制衰老、抑制衰老.A BA A：BA(0mg/L)BA(0mg/L)，芽（较少），根（较多）愈伤组织（一定量），芽（较少），根（较多）愈伤组织（一定量）B B：BA(0.1mg/L)BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量），芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）.控制植物细胞分化控制植物细胞分化n分裂素分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件的一个重要条件n比例高时比例高时产生芽产生芽,比例低时比例低时产生产生根根.生理作用：生理作用：1 1、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效型特别有效，对根无效2 2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。协同作用。IAA/GAIAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。比值低有利于韧皮部的分化。3 3、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。4 4、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用注：不耐热，应采用过滤灭菌加入注：不耐热，应采用过滤灭菌加入3 3、赤霉素（、赤霉素（GAGA3 3）.生理作用生理作用：1 1、抑制蛋白质的合成、抑制蛋白质的合成2 2、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GAGA的作的作用用3 3、诱导休眠、促进衰老和脱落、诱导休眠、促进衰老和脱落 4 4、脱落酸（、脱落酸（ABAABA）.以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，还有害，实际工作中要具体分析。还有害，实际工作中要具体分析。生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一般用般用ppm表示表示 1ppm=1mg/L.琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某些琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某些作物的花药培养）作物的花药培养）琼脂的用量一般在琼脂的用量一般在4-10g/L4-10g/L，所购回的琼脂要先，所购回的琼脂要先试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。（四）固化剂（四）固化剂.培养基的种类（根据无机盐的浓度）：培养基的种类（根据无机盐的浓度）：1、高无机盐含量培养基、高无机盐含量培养基 钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有MS、LS、BL、BM、ER培养基。培养基。二、培养基的配方及培养基的选择二、培养基的配方及培养基的选择.2、高硝态氮培养基、高硝态氮培养基 硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的的VB1。主要适合与木本植物、十字花科植物和。主要适合与木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有单子叶植物的组织和花药培养。主要有B5、N6、SH培养基。培养基。.3、中等无机盐含量培养基、中等无机盐含量培养基大量元素约为大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较但含量较MS的高，维生素种类比的高，维生素种类比MS多，如增加了多，如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培养，主要有生物素、叶酸等。适合于花药培养，主要有Nitch，NT、H、Miller培养基。培养基。.4、低无机盐含量培养基、低无机盐含量培养基大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于生根培养基，主要有相对也很低。多数用于生根培养基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。.4、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。养基和完全培养基。基本培养基基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有（就是通常称呼的培养基）主要有MSMS、WhiteWhite、N6N6、B5 B5、改良、改良MSMS、HellerHeller、NitshNitsh、SHSH、MillerMiller等。等。完全培养基完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。其他复杂有机物质等。MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5.（一）、贮备液（母液）的配制（一）、贮备液（母液）的配制 为什么要配制母液？为什么要配制母液？1 1）、方便）、方便 2 2）、准确（有些成分量太小）、准确（有些成分量太小）三、培养基的配制三、培养基的配制.1 1、大量元素母液的配制、大量元素母液的配制各成分按照表各成分按照表1 1培养基浓度含量扩大培养基浓度含量扩大1010倍，按顺序逐倍，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到步混合。后用蒸馏水定容到1000ml1000ml的容量瓶中，即为的容量瓶中，即为1010倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配冰箱中。配制培养基时，每配1L1L培养基取此液培养基取此液100ml100ml。.注意：注意：(1)(1)某些无机成分如某些无机成分如CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将序。特别应将CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等离子错开混等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。合，速度宜慢，边搅拌边混合。(2)CaCl(2)CaCl2 22H2H2 2O O要在最后单独加入，在溶解要在最后单独加入，在溶解CaClCaCl2 22H2H2 2O O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的COCO2 2，以防沉淀。另，以防沉淀。另外，外，CaClCaCl2 22H2H2 2O O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。出。.、微量元素母液的配制、微量元素母液的配制MSMS培养基的微量元素无机盐由培养基的微量元素无机盐由7 7种化合物（除种化合物（除FeFe）组成。）组成。微量元素用量较少，特别是微量元素用量较少，特别是CuSOCuSO4 45H5H2 2O O、CoClCoCl2 26H6H2 2OO，因此在配制中分微量，因此在配制中分微量、配制。配制。按照表按照表2 2，表，表3 3配方，用感量为配方，用感量为0.0001g0.0001g的分析天平称量，的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制其它同大量元素。配制培养基时，每配制1L1L培养基，培养基，取微量取微量10ml10ml，微量，微量mlml.3 3、铁盐母液的配制、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四