非预染蛋白分子量标准-大学本科毕业.docx

武汉工程大学本科毕业（设计）论文
摘 要
蛋白质分子量标准，即蛋白分子量Marker，是由一种或几种分子量大小已知且高度纯化的蛋白质混合而成，是广泛应用于电泳和免疫印记分析中的试验试剂。蛋白质分子量标准的主要功能是确定未知蛋白质的分子量大小，指示电泳效果及转膜的成败。相应的有三种类型的蛋白质分子量标准：非预染蛋白质分子量标准、预染蛋白质分子量标准和 Western 专用的预染蛋白质分子量标准。建立高效的、可靠的蛋白质分子量标准生产体系对蛋白质分子量标准的生产和商业化有重要价值。
本课题对非预染蛋白分子量标准的制作流程及方法进行探索，以求获得满足蛋白质组学研究所需的蛋白质分子量标准，并能够熟练掌握蛋白分子量Marker的制作流程。本实验预混几种已纯化好的且分子量已知的蛋白质，采用SDS-PAGE电泳的方法制作比较清晰的蛋白Marker条带。在实验中，我们主要对现有几种蛋白质进行筛选，以确定符合要求的蛋白质；探讨了点样量和点样体积对电泳条带清晰度的影响，并确定最终可用于制作Marker的蛋白质，及其合适的点样量和点样体积。
结论：在实验室现有的几种蛋白质中，我们最终选用了牛血清白蛋白（BSA）和溶菌酶，蛋白分子量分别为66KD和14KD。预混后，在上样量为8μL，即实际蛋白含量在6.4μg时，凝胶电泳可呈现两条较为清晰的条带，其范围为14~66KD，适用于低分子量蛋白的检测，有一定的参考价值。

关键词：非预染蛋白分子量标准；制备；质量控制

Abstract
Protein molecular weight standard, also known as protein Marker, is a mixture of one or several pure proteins whose molecular weight is known. It is a test agent which is widely used in the analysis of electrophoresis and Western blotting. The main function of protein Marker is to determine the molecular weight of an unknown protein and indicate the success or failure of electrophoresis and transfer results. There are three kinds of corresponding protein molecular weight standards such as unstained protein molecular weight standard、pre-stained protein molecular weight marker and pre-stained protein molecular weight marker for western blot. Efficient production of protein molecular standard is crucial to commercialization of protein standard.
In this communication we explore the processes and methods of non- pre-stained protein molecular weight standards, in order to obtain suitable protein marker to meet the requirement of proteomic studies and the ability to master protein marker making processes. In this experiment we premixed several proteins purified with known molecular weight, using SDS-PAGE to produce clearer protein marker bands. We screened several major protein of existing by SDS-PAGE experiment to determine suitable protein which meet the requirements of making protein marker; then we explored how different sample volume and the volume of spotting affect the clarity of electrophoretic bands and determined which protein can be used to make protein marker and appropriate sample volume and the volume of spotting.
Conclusions: In the several proteins existing in the laboratory, we finally chose Bovine Serum Albumin (BSA) and Lysozyme, whose molecular weights are 66KD and 14KD. After premixing, when the sample volume was 6 ~ 8ul, i.e. the actual protein content is 4.8 ~ 6.4ug, the gel can be rendered more clearly two bands ranging from 14KD to 66KD. For the detection of low molecular weight proteins, there is some reference value.
Keywords: Unstained protein molecular weight standard; Preparation; Quantity Control
目 录
摘 要 I
Abstract II
第一章 文献综述 1
1.1 蛋白分子量测定方法 1
1.1.1 超速离心法 1
1.1.2 SDS-PAGE电泳法 2
1.1.3 高效凝胶过滤率法 3
1.1.4 电喷雾离子化质谱分析 3
1.2 蛋白Marker的分类 4
1.2.1 非染色蛋白分子量标准 4
1.2.2 预染蛋白分子量标准 5
1.2.3 Western blotting专用的蛋白分子量标准 6
1.3 蛋白分子量标准的来源与研究现状 6
1.3.1 普通蛋白质分子量标准的研究现状 7
1.3.2 Western blotting 专用的蛋白质分子量标准研究现状 7
1.4 重要研究技术——SDS-PAGE电泳技术 9
1.4.1 SDS-PAGE电泳概述 9
1.4.2 SDS-PAGE电泳的原理 10
1.4.3 SDS-PAGE电泳体系的分类 11
1.4.4 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 11
1.5 主要实验内容概述 12
第二章 实验部分 13
2.1实验材料、试剂及仪器设备 13
2.1.1主要实验材料及药品 13
2.1.2试剂配制 13
2.1.3主要实验仪器及设备 14
2.2实验方法 14
2.2.1安装夹心式垂直板电泳槽 14
2.2.2配胶及凝胶板的制备 15
2.2.3样品的处理与加样 17
2.2.4电泳 18
2.2.5凝胶剥离、染色与脱色 18
第三章 结果与讨论 19
3.1对现有几种蛋白样品电泳结果的分析 19
3.2对符合要求的蛋白样品所进行的上样量梯度电泳的结果分析 19
3.3对预混后蛋白样品所进行的上样量梯度电泳的结果分析 20
第四章 结论与建议 22
4.1结论 22
4.2建议 22
参考文献 23
致 谢 24

12

第一章 文献综述
分子量大小是蛋白质主要特征参数之一。当对一种新的蛋白质进行研究时，首先应准确测定其分子量大小，然后根据分子量大小的特点，采取相应的方法进行蛋白质的分离、纯化、检测以及其它特征的研究。因此蛋白质分子量的测定方法对于蛋白质的研究具有非常重要的意义。
1.1 蛋白分子量测定方法
蛋白质是生理活动中最重要的物质之一，目前已成为生命科学领域研究的热门。对于蛋白质分子量的测定方法有很多，传统的研究方法是渗透压法。
现在比较常用于测定蛋白质分子量的方法有：超速离心法，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法( SDS-PAGE)，高效凝胶过滤色谱法( HPGFC) 和电喷雾离子化质谱法( ESI-MS )[1]。
1.1.1 超速离心法
超速离心的原理是：在液体介质中的颗粒会受到本身的重力和离心机产生的离心力作用，这些作用力会加快液体中颗粒的沉降速度，将样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开[1]。每单位引力场生物大分子下沉的速度称为沉降系数，也可用沉降速度与向心加速度之比来定义，通常用 S 表示。不同颗粒的分子量、密度、结构形状不同，沉降系数也会不同。因此常用沉降系数来命名生物分子，如某核蛋白体的沉降系数为30S，就称为30S 核蛋白体。一般蛋白质和其他生物大分子的沉降系数介于1-200S 之间。
因为蛋白质有特定的沉降系数，故可根据沉降系数来分离和鉴定蛋白质。S 值不同，在同一离心加速度下，沉降速度就存在着快慢差异，从而使不同物质得到分级分离。还可以利用沉降系数的差异来测定蛋白质分子量的大小。一般来说分子量大的 S 也大，分子量小的 S 也小，但分子量与沉降系数不成正比，因为沉降系数还受到蛋白质分子形状等因素的影响。用一个已知分子量的蛋白质作为参照标准，可通过公式计算无知蛋白质的分子量，但利用公式计算蛋白质分子量只适用于球状蛋白质，不适用于高度不对称性的纤维蛋白质。
1.1.2 SDS-PAGE电泳法
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是比较常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量[2]。SDS-PAGE 是在电泳样品中加入含有 SDS 和 β-巯基乙醇的样品处理液的一种电泳方法。SDS 即十二烷基磺酸钠，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂 β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。蛋白样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮 3-5 min，使 SDS 与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS 与蛋白质结合后使蛋白质－SDS 复合物上带有大量的负电荷，这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于显示电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。
制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，例如通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是 104－105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于 105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要使用低浓度如10％或 7.5%的凝胶；而对于分离较小的蛋白质，使用较高浓度的凝胶可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶(约 1cm)，并在浓缩胶上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺浓度通常为 3-5％)，由于浓缩胶具有较大的孔径，各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常 pH 值较低(通常 pH = 6.8)。其作用是，在样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。蛋白质在电泳时，迁移率取决于蛋白质所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那么电泳迁移率就取决于分子的大小。
分子量计算方法：以标准蛋白的分子量对数与迁移率作图或作回归方程，迁移率等于蛋白质分子迁移距离/染料迁移距离，通过样品的迁移率计算分子量。
1.1.3 高效凝胶过滤率法
凝胶过滤法又称分子排阻法，是一种高效分离纯化蛋白质的方法。原理是不同的蛋白质分子对固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力[4]。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价链接。将这种有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其他蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。
从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量，而是它的斯托克半径。利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯托克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。
1.1.4 电喷雾离子化质谱分析
超速离心法、凝胶色谱法及聚丙烯酰胺凝胶电泳法等方法需要样品的量大，灵敏度差，误差也很大 。
近年来质谱技术飞速发展，电喷雾离子化质谱，具有灵敏度高、准确率高、重复性好等特点，能准确地测定分子量高达几万到几十万的生物大分子，已广泛应用于生命科学领域。电喷雾质谱是 80 年代末发展起来的另一种电离质谱技术它是利用蛋白质分子可在适当酸性条件下，直接在溶液中形成多电荷的气相离子从而准确测定其分子量[4]。这使得质谱不仅可以测定小分子物质的分子量，而且也可以测定生物大分子物质的分子量，灵敏度、准确度为各种方法之首。
电喷雾离子化质谱是带有电喷雾离子化系统的质谱分析法，其原理是：样品溶液经很细的进样管进入电喷雾室，在强电场的作用下，样品溶液在出口处因电荷的分离和静电引力而破碎成许多细小的带电液滴。在电场的作用下，带电液滴逆着干燥气体流动的方向，向质谱计入口处漂移，逆向的干燥气体使液滴迅速蒸发，并使液滴表面的电荷浓度增大。当库仑斥力和液滴表面张力极限值相等时，液滴就会爆裂成更小的液滴，直到液滴变得非常小。由于液滴的曲率半径很小，而它的表面电荷密度很大，结果在液滴表面形成非常强的电场，这种强电场足以从液滴中解吸出离子；离子经玻璃毛细管进入压力为几托(1 托=133.322Pa)的第一真空区，在那里可以进行碰撞活化裂解，获得样品分子的碎片，从而可获得分子的结构信息。样品的分子离子和裂片离子经一系列分离器和静电透镜进入质量分析器进行质谱分析。这种电喷雾质谱法具有很高的灵敏度，且电离的分子可以带有多电荷，针对电喷雾电离所产生的多电荷状态，将多电荷状态理解为对分子质量进行多次独立的测量，并基于联立方程解的平均方法，获得对分子质量的正确估量，解决了多电荷离子信息的问题，使蛋白分子质量测量精度获得极大的提高，使质谱仪可以分析分子量高达几十万的蛋白质。
1.2 蛋白Marker的分类
近年来，蛋白质分子量的测定方法愈趋于简单、灵敏和精准，越来越多的蛋白质的分子量被精确测出，其中一些易于获得且稳定的蛋白质专门用作未知蛋白分子量的参照物，被称作蛋白质 Marker 或蛋白质 Ladder。尤其在实验室中，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳中的已知分子量标准，来确定未知蛋白分子量。为了使实验结果更有说服力，还可以根据需要对一些天然蛋白参照物作一些修饰，以满足实验要求。总的来说，蛋白质分子量标准分为三类分别是：非预染蛋白质分子量标准，预染蛋白质分子量标准及 Western 专用的预染蛋白质分子量标准[3]。
1.2.1 非染色蛋白分子量标准
非染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种蛋白分子量标准。由于没有附带染料分子或标记分子，所示分子量大小更接近蛋白原本的分子量大小，是精确判断蛋白分子量大小的方法。现在的蛋白Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比对，预混的Marker通常由一组分子量已知的蛋白条带作为指示。从选择上来说，应当选择其中至少有一条条带和待测目的蛋白分子量大小相近，越接近越好。非预染的Marker的不足之处在于，在电泳中无法观察到蛋白的移动过程，只有在电泳结束后，和待测蛋白一起经过染色及脱色处理才能显示蛋白条带在凝胶上的具体位置，因此无法对实验起预示参照作用。
(1) 宽分子量蛋白标准
如果从实验室总体考虑的，可以选范围尽量宽，条带分布比较均匀的蛋白分子量标准，即宽分子量蛋白标准，这样蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的危险。
(2) 高分子量蛋白标准
在检测大分子量蛋白时，通常使用到高分子量蛋白标准。
(3) 低分子量蛋白标准
在一般的蛋白电泳中，更常用的是低分子量蛋白标准。它除了有指示蛋白大小的作用以外，还可以用作蛋白质粗略的定量。实验室用在一般蛋白电泳的低分子量蛋白标准中。低分子量蛋白标准还包括特别小的蛋白标准，比如30kD以下蛋白或者多肽的分离辨别。
表1.1 常用蛋白质分子量标准参照物
高分子量标准参照
中分子量标准参照
低分子量标准参照
蛋白质
分子量
蛋白质
分子量
蛋白质
分子量
肌球蛋白
212000
磷酸化酶B
97400
碳酸酐酶
31000
β-半乳糖苷酶B
116000
牛血清白蛋白
66200
大豆胰蛋白酶抑制剂
21900
磷酸化酶B
97400
谷氨酸脱氢酶
55000
马心肌球蛋白
16900
牛血清白蛋白
66200
卵清蛋白
42700
溶菌酶
14400
过氧化氢酶
57000
醛缩酶
40000
肌球蛋白（F1）
8100
醛缩酶
40000
碳酸酶
31000
肌球蛋白（F2）
6200

大豆胰蛋白酶抑制剂
21500
肌球蛋白（F3）
2500

溶菌酶
14400

1.2.2 预染蛋白分子量标准
预染蛋白分子量是一些纯化好的蛋白混合物，通过与染料共价耦联，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。预染蛋白分子量标准使实验过程便于观察，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率。一般情况下，垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处，如果使用预染 Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到最佳分辨效果[3]；如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳；另外在Western Blot转膜后可以直接观察蛋白转膜是否完全，还可以在膜上标记蛋白分子量。预染蛋白分子量标准的不足之处在于，由于预染蛋白 Marker与染料共价耦联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能导致一些偏差，因此不太适合精确定位蛋白。但是，多数情况下 Marker的条带不能和待测蛋白条带完全一样，电泳的结果是一种相对Marker指示的参考大小，最后都需要经Western来定性。在不需要区分大小相近的条带时，采用预染蛋白分子量标准比较合适，而且也可以和非预染蛋白分子量标准一起使用。
1.2.3 Western blotting专用的蛋白分子量标准
(1) 生物素标记蛋白标准
生物素标记的蛋白标准，主要是配合化学发光法在蛋白分子量上标记生物素，通过带有抗生物素的抗体或者偶联青霉素的抗体，在化学发光检测到目的蛋白带时，就可以同时看到相应的分子量标准一起发光显影了。这一方法的优点在于，Marker和待测蛋白对应性较好，同时在同一张胶片上显示，不用拼接，利于分析。缺点是，如果样品中带有生物素背景，会对实验结果产生较大影响。
(2) 特殊标记蛋白标准
在经过修饰的蛋白标准中，除了生物素标记以外，近年来由于下游蛋白操作的丰富化与复杂化，也出现蛋白质末端加尾修饰的蛋白分子量标准，如His-tag。如果每个 Marker条带都有His-tag，那么经过二抗添加His-tag抗体很容易将蛋白质分子量标准的条带和待测蛋白同时显示在Western blotting结果上。
实验室常用的蛋白标准品多是来自NEB、MBI、GE、Bio-Rad 、Invitrogen、Novagen、Promega、MRESCO、Pierce Bio. 等品牌，生物帮2-D 蛋白 MW Markers。
1.3 蛋白分子量标准的来源与研究现状
蛋白质分子量标准是蛋白质定性甚至定量的重要工具，在蛋白质研究领域发挥重要作用，但是蛋白质分子量标准的来源狭窄。目前，市面上的蛋白质分子量标准多是已知的天然蛋白，分离纯化困难，分子量数值不成一定的规律性变化。且由于天然蛋白质修饰的复杂性，经常出现不同来源的同一蛋白质电泳迁移率却不同，出现指示不明确的问题。因此很多研究者通过蛋白后修饰及重组技术获得新型的蛋白质分子量标准[3]。
1.3.1 普通蛋白质分子量标准的研究现状
Mohanty(1993)等人建立了一种可产生放射性的蛋白质分子量标准的方法，这种方法显示在 Cu2+、 Zn2+、Cd2+等二价金属离子存在的特定缓冲液里下，有合适的温度，蛋白质会被放射性的[a-32p]ATP 所标记，在 X-ray 下显示有明显条带。该蛋白质分子量标准可用于检测未知分子量的带放射性蛋白质。
李兴林（2007）等人利用小麦麦谷蛋白分子量分布较宽，有遗传稳定性和易于提取等优点，来制备蛋白质分子量标准。研究中选择一定品种的不同分子量麦谷蛋白质进行搭配，采用高效的提取技术，获得由低到高分子量分布范围的蛋白质分子量标准，最后和待测样品一起经过聚丙烯酰胺凝胶电泳，可被考马斯亮蓝染色和银染而显色。该技术以小麦麦谷蛋白质作为蛋白质分子量标准，很大程度上增加了蛋白质分子量标准的上下限和分布密度。
王强等人(2008)公开了一种利用内含肽反式剪接制备蛋白质分子量标准的方法，根据原理选择一段已知分子量的蛋白 X，另选择两种互不兼容的内含肽 A 和 B，将内含肽 A和内含肽 B 分别分解为氨基末端（N 端）和羧基末端（C 端），命名为 An Ac Bn Bc，然后将他们组成五个重组蛋白，即起点蛋白（X-An），中段 1（An-X-Bc），中段 2（Bc-X-An）；终点 1（Ac-X)；终点 2 (Bc-X)。设计相应的五个重组蛋白的核酸骨架，宿主细胞内表达得到五个重组蛋白，最后在一定反应条件下，通过内含肽的相互识别，重新组装激活剪接活性，使以上五种蛋白相互连接叠加起来。通过这种方法获得了间隔均匀的蛋白质分子量标准。
1.3.2 Western blotting 专用的蛋白质分子量标准研究现状
免疫印记是广泛应用于蛋白质分子量和表达量检测的技术（Towbinetal
1979,Burnette 1981）。它是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测，通常利用预染蛋白质分子量标准作参照物，它可以同待测蛋白一起转膜，标识分子量大小的同时也指示转膜的效率，但同时它本身有一定缺陷：其一，蛋白质分子量标准本身是被染料标记的，电泳中的迁移率会发生变化；其二，在长时间的孵化和洗涤过程中，蛋白条带有可能褪色；其三，蛋白质分子量标准在转膜后可看见条带，但在 X-放射线下却不能像待测蛋白一样显影。因此众多研究试图在蛋白标准的末端加上特定的可被抗体识别的标签，这样得到的蛋白质分子量标准可与带同种标签的待测蛋白同时显示在检测结果上，直接指示待检测蛋白的分子量及含量。
最先考察对蛋白质分子量标准进行修饰的标签是金黄色葡萄球菌蛋白 A 的抗体结合区，早期研究显示许多具有感染性细菌的膜蛋白可与各种免疫蛋白的 Fc 序列有特异性的结合。这些膜蛋白已经用于亲和层析纯化系统和免疫化学分析。免疫球蛋白 Fc 最好的受体是来自金黄色葡萄球菌的膜结合蛋白 A（SPA)，以及来自马链球菌的膜结合蛋白 G（SPG)。1992年，Zueco 和 Boyd 将不同基因序列与金黄色葡萄球菌蛋白 A 的抗体结合区序列连接，构建了重组表达载体，实现其在大肠杆菌或酿酒酵母中的高效表达，最后通过 IgG 琼脂糖亲和柱层析或包涵体的洗涤等方法纯化，获得了由15kD、24kD、31kD、37kD、54kD、73kD分子量组成的蛋白质分子量标准。该蛋白质分子量标准可代替预染蛋白质分子量标准，同待测蛋白一起转膜，可以同抗体结合检测。余铭恩等(2009)将不同数目 SPA 的基因序列串联，构建于表达载体，利用大肠杆菌表达系统，通过镍柱分离纯化得到串联数目不同的重组蛋白，获得各蛋白的分子量分别为15kD、21kD、30kD、40kD、60kD、95kD。
研究显示蛋白 G 与所有免疫球蛋白 Fc 的结合比蛋白 A 强（Akerstrom 1986）。进一步的研究结果表明，蛋白 G 与 Fc 的结合能力并不比蛋白 A 强，而是这两者与不同抗体Fc 的结合力是有强弱差异的(Guss 1986）。1989 年，Eliasson 等人对 SPA，SPG 以及嵌合蛋白 A、G 与人 IgG 的 Fc 受体的结合特异性进行考察，发现嵌合蛋白 AG 与人 IgG 的所有变异体的结合活性是最强的。其中蛋白 A 的 ZZ 结构域和蛋白 G 的 B1B2 结构域是免疫球蛋白 Fc 序列的主要结合区（Sjodahl 1977,Akerstrom et al 1987,Nilsson et al 1987)，
Fahnestock 等人于 1986 年公布了 B1B2 和 ZZ 结构域的基因序列，Zhang（2009）等人根据已公布的 ZZ 结构域和 B1B2 结构域基因序列，分别设计引物扩增得到 ZZ 和 B1B2序列，然后将 ZZ 和 B1B2 序列连接得到 ZZB1B2 基因，接着对 ZZB1B2 序列进行扩增、连接，从而得到 ZZB1B2 重复序列，最后克隆到 pET101-D 载体上，进行大肠杆菌系统的表达，通过镍柱纯化，得到分子量分别为 25kD、30kD、50kD、58kD、80kD和85kD 的蛋白质分子量标准。
对蛋白质分子量标准进行重组修饰，除了金黄色葡萄球菌的膜结合蛋白 A 的重组外，近些年蛋白质的上下游操作也日趋丰富和复杂，出现 6*His 标记，*HA(hemagglutinin红血球凝集素)，*GST，*c-myc，*S 标记和 S-protein FITC(异硫氰酸荧光素）等标记，大大增加了蛋白分子量Marker的功能和应用范围。如 Invitrogen 公司开发了 BenchMarkHis-taggeded Protein Standard ， Qiagen 公司的 6xHis Protein Ladder ， Invitrogen 的BenchMark 和 Qiagen 的 6xHis Protein Ladder 都是用 His 作为标记，前者包含 10 条蛋白条带，可以用 Invitrogen 自产的一种染料或者考马斯亮蓝染色，也可以用 anti-His 的抗体进行色原显色或者化学发光进行检测，而后者强调的是精确的标定和阳性对照的作用。此外，Roche 的 Multi-Tag-MarkerMulti-Tag-Marker 包含 GST-、 HA-、c-myc-、His6-这四种最经常使用的标记，实验室购买后就可以用于多个标记蛋白的同时使用，而且，Multi-Tag-Marker 的全面性还表现在它除了可以用在 Immunoblotting，还可以用于Immunoprecipitation 免疫共沉。
上述重组蛋白质分子量标准的制备，大多以融合蛋白的形式存在，要实现融合蛋白的高效表达，主要通过高效的原核表达系统完成蛋白的重组和修饰[3]。
1.4 重要研究技术——SDS-PAGE电泳技术
1.4.1 SDS-PAGE电泳概述
本课题采用SDS-PAGE电泳的方法来制作蛋白分子量Marker，SDS-PAGE是对蛋白质进行量化、比较和特性鉴定的一种比较经济、快速而且可重复的方法[2]。Shapiro于1967年首次报告了SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳系统，根据他对11种蛋白质电泳获得的结果，发现蛋白质(或亚基)分子量的对数与蛋白质分子的迁移率之间有直线关系。Weber等人的深入研究，肯定了Shapiro的发现，确立了SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的新方法。Shapiro和Webe所应用的SDS一凝胶电泳缓冲系统为连续的磷酸盐系统，后来Laemmli将SDS电泳和DaVis的不连续盘状电泳接合起来，设计出不连续的SDS一Tris一甘氨酸系统，此系统具有很好的浓缩效应，分辨率比磷酸系统更高，应用更为广泛。由于SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好、微量、设备简单、价廉和操作容易、迅速等优点，因而得到了迅速的发展和广泛的应用。目前SDS-PAGE已成为蛋白质研究的有力工具，广泛地应用于分子生物学、生物化学、遗传学、病理学、微生物学和植物生理学等学科的研究中。
1.4.2 SDS-PAGE电泳的原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以丙烯酰胺为单体，N，N‘-甲叉双丙烯酰胺为交联剂，在催化剂（过硫酸铵）和引发剂（TEMED）的作用下，聚合成含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两条链通过甲叉桥交联起来而形成三维网状结构。这种网状结构具有分子筛效应，分离分子通过网孔的能力取决于凝胶孔的大小和形状，也取决于被分离分子的形状及大小。
SDS(十二烷基硫酸钠，Sodiumdodeeyl Sulfate)是一种很强的阴离子表面活性剂，它以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的SDS一蛋白质复合物。SDS和蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为1.4:1，由于这种高密度的结合，新引入的净电荷远远超过蛋白质分子原有的净电荷，从而消除或极大地降低了不同蛋白质分子之间原有净电荷的差异，即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。SDS一蛋白质复合物具有均一的电荷密度、相同的荷质比。据流体力学等方面的研究推测，SDS一蛋白质复合物呈紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴是恒定的，在18 Å的数量级，与蛋白质的种类无关；棒的长轴是变化的，而且与蛋白质的分子量成正比。这就是说，SDS和蛋白质结合后所形成的SDS-蛋白质复合物，消除了由于天然蛋白质分子形状的不同对电泳迁移率的影响。
带电分子电泳迁移率的大小取决于三个方面，即带电荷的多少、分子量的大小和分子的形状。根据上面的分析，SDS和蛋白质结合后使其电泳迁移率仅取决于蛋白质分子量的大小，因而可以通过比较未知分子量的蛋白质和已知分子量的蛋白质分子的迁移率，测定出未知蛋白质的分子量。在一定条件下，蛋白质的Mr与电泳迁移率间的关系可用下式表示：

Mr=k(10bm)
lgMr=lgk-bm=k1-bm
式中：k，k1——常数
b——斜率
m——相对迁移率，用每个蛋白质带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的，即
m=蛋白质带迁移距离脱色后凝胶长度×固定前的凝胶长度溴酚蓝迁移距离
根据上述方程，可以将一系列已知Mr的标准蛋白质，即蛋白分子量Marker，进行SDS-凝胶电泳，然后用每个已知Mr的标准蛋白质的电泳相对迁移率作横坐标，以Mr的对数作纵坐标作图，即得蛋白质Mr的标准曲线（一条直线）。待测Mr的未知蛋白质分子在相同条件下（同一块胶）进行电泳，测出其电泳迁移率，即可在标准曲线中求出其近似Mr。
1.4.3 SDS-PAGE电泳体系的分类
SDS-PAGE有连续体系及不连续系两种，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完成相同。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，具有较高的分辨率。本实验在制作蛋白Marker的过程中，采用的是不连续体系。
1.4.4 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀，由此产生浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。
(1) 浓缩效应 样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl-有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。
(2) 电荷效应 当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。
(3) 分子筛效应 由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而，由于迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。
1.5 主要实验内容概述
为了能够得到比较清晰的蛋白分子量Marker条带，我们设计了三个阶段性实验：
（1） 对实验室现有几种蛋白质进行电泳分析，实验室现有的几种蛋白质包括牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白、α-淀粉酶、乙醛脱氢酶、溶菌酶、胰酶，分别配制1μg/μL蛋白溶液，然后取100μL蛋白溶液加入25μL 4*Protein SDS-PAGE Loading Buffer（实际蛋白浓度为0.8ug/ul），沸水浴加热5min后上样进行电泳。其目的是挑选出符合蛋白分子量Marker制作要求的蛋白质。
（2） 对符合要求的蛋白质样品进行上样量梯度电泳，以确定适宜的蛋白上样量，并以此来确定蛋白质样品预混的比例。
（3） 根据上样量梯度电泳的结果，蛋白质样品按适当比例混合，加入Loading Buffer后，进行上样量梯度电泳，以确定预混后样品的适宜上样量及上样体积。
第二章 实验部分
2.1实验材料、试剂及仪器设备
2.1.1主要实验材料及药品
实验使用的主要试剂如表2.1。
表2.1 主要实验试剂
药品
生产厂商
牛血清白蛋白（BSA）
洁洋盛生物
溶菌酶
洁洋盛生物
凝胶电泳相关试剂
武汉科瑞生物技术有限公司
4*Protein SDS-PAGE Loading Buffer
TaKaRa
Premixed Protein Marker(Broad)
TaKaRa

2.1.2试剂配制
主要试剂配制方法如表2.2。
表2.2 主要试剂配制方法
试剂名称
配制及保存方法
10%(W/V)SDS溶液
称SDS 5g，加重蒸馏水至50mL，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解
1% TEMED(V/V)
称