黄粉虫不同酶解液及其抗氧化作用的比较研究.pdf

第9 期（总第58 4期）2023年9 月文章编号：16 7 1-9 6 46（2 0 2 3）0 9 b-0030-04黄粉虫不同酶解液及其抗氧化作用的比较研究农产品加工Farm Products ProcessingNo.9Sep.张玲1，宋艳军，*韩基明1（1.山西农业大学山西功能食品研究院，山西太原0 30 0 31；2.中阳县仁味仁农产品加工有限公司，山西吕梁0 3340 0)摘要：以黄粉虫为原料，利用减提酸沉法提取黄粉虫蛋白，并选取不同的酶对黄粉虫蛋白进行酶解，分析比较其酶解液中多肽含量、SOD酶活及总抗氧化能力。结果表明，黄粉虫蛋白分别经胰蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后其多肽得率分别为7 9.6%，6 0.4%，6 4.8%；S0D酶活力分别为8 2.0 3，8 2.7 3，8 2.31U/mL；黄粉虫胰蛋白酶酶解液的总抗氧化能力为：相当于1.57 53mmol/L的FeSO04，0.9 17 3m m o l/L 的Trolox；碱性蛋白酶酶解液的总抗氧化能力为：相当于1.0 38 3mmol/L的FeS04，0.8 8 10 m m o l/L 的Trolox；木瓜蛋白酶酶解液的总抗氧化能力为：相当于0.9 39 4mmol/L的FeSO4，0.7 46 6 m m o l/L 的Trolox。黄粉虫不同酶解液都具有一定的抗氧化活性，其胰蛋白酶酶解液多肽得率较高，总抗氧化能力较强。关键词：黄粉虫；酶解；多肽；总抗氧化能力中图分类号：TS201.2The Study on Total-antioxidant Capacity of the Enzyme-lysates of(1.Institute of Functional Food of Shanxi,Shanxi Agricultural University,Taiyuan,Shanxi 030031,China;2.Zhongyang Renweiren Agricultural Products Processing Co.,Ltd.,Lvliang,Shanxi 033400,China)Abstract:In this experiment,the protein was extracted from Tenebrio molitor L used as raw materials with the method ofSubtraction acid precipitation and the content of polypeptide and the vitality of SOD and the total-antioxidant capacity ofenzyme hydrolysates were analyzed.The results showed that the polypeptide yield of hydrolysates of Tenebrio molitor proteinhydrolyzed with the trypsin,alkaline protease and papain were 79.6%,60.4%,64.8%.The activity of SOD in thehydrolysates were 82.03,82.73,82.31 U/mL respectively.The FeSO4-equivalent and the Trolox-equivalent antioxidant ca-pacity of hydrolyzates with trypsin,alkaline protease and papain were 1.575 3 mmol/L and 0.917 3 mmol/L,1.038 3 mmol/Land 0.881 0 mmol/L,0.939 4 mmol/L and 0.746 6 mmol/L,respectively.Different hydrolysates of Tenebrio molitor hadcertain antioxidant activity,especially in the trypsin hydrolysate had higher peptide yield and stronger total antioxidant activitycompared to the others.Key words:Tenebrio molitor L;enzyme hydrolysis;polypeptide;total-antioxidant capacity文献标志码：ATenebrio molitor L.ZHANG Ling,SONG Yanjun?,HAN Jimingdoi:10.16693/ki.1671-9646(x).2023.09.038黄粉虫是一种人工养殖的昆虫，繁殖速度快，俗称面包虫，营养丰富，尤其是蛋白含量高达50%左右，且研究表明黄粉虫具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂等多种功效作用-2，目前主要作为饲料在饲养上应用较多，附加值相对较低。黄粉虫蛋白酶解的研究较多，主要通过酶解蛋白的方式制备抗氧化肽、抗菌肽、降血压肽和抗肿瘤肽等生物活性肽 4-6。以黄粉虫为原料，选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶水解黄粉虫蛋白，比较各种酶水解液中多肽得率及其总抗氧化能力的强弱，为黄粉虫蛋白肽制收稿日期：2 0 2 3-0 4-19基金项目：吕梁市重点研发项目（2 0 2 1NYGG-2-22）。作者简介：张玲（19 8 2 一），女，博士，副研究员，研究方向为农产品贮藏与加工。通讯作者：韩基明（19 6 7 一），男，本科，副研究员，研究方向为农产品贮藏与加工。备过程中酶的选择及功能作用的研究提供基础的理论参考。1材料与设备1.1试验材料黄粉虫，中阳县仁味仁农产品加工有限公司提供；碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，中国医药上海化学有限公司提供；四肽标准品（Cly-Cly-Tyr-Arg），D PPH，S i g m a 公司提供；总超氧化物歧化酶（T-SOD），南京建成公司提供；总抗氧化能力2023年第9 期(T-AOC）测定试剂盒，南京建成公司提供；其他试剂均为分析纯。1.2仪器与设备CP224C型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司产品；HPG-9075型电热鼓风干燥箱，北京东联哈尔仪器制造有限公司产品；JB-3型磁力搅拌器，上海智光仪器仪表有限公司产品；PHBJ-260型便携式pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；LD5-10型低速离心机，北京雷勃尔医疗器械有限公司产品；SSW型电热恒温水槽，上海博迅实业有限公司产品；JDG-0.2型真空冷冻干燥机，兰州科技真空冷冻干燥技术有限公司产品。2试验方法2.1黄粉虫蛋白的制备碱提酸沉法：黄粉虫烘干粉碎，乙醚脱脂后溶于2 0 倍的蒸馏水中，用1mol/L的NaOH溶液调pH值至8.5，不断搅拌30 min并保持其pH值不变，以转速50 0 0 r/min离心2 0 min，取上清液，用1mol/L盐酸调节pH值为4，室温下以转速50 0 0 r/min离心20min，沉淀出的蛋白用蒸馏水洗涤，重复2 次。之后将蛋白的水溶液调节pH值至7（提高蛋白质的溶解性），冷冻干燥得黄粉虫蛋白粉。2.2黄粉虫蛋白含量及成分的测定水分的测定闪：常压直接干燥法2003）；脂肪的测定8：索氏抽提法（GB/T5009.6一2003）；蛋白质的测定 9 ：微量凯氏定(GB/TFe2+-TPTZ，于波长59 3nm处测定吸光度可以计算出5009.52003）；灰分的测定 10 ：高温灼烧法（G B/T样品中总抗氧化能力，其总抗氧化能力用FeSO4标5009.42003)。准溶液的浓度来表示。ABTS法测定原理：ABTS在2.3黄粉虫酶解液中多肽含量的测定适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+，在抗氧(1）四肽标准曲线的制作。取10 个10 mL的化物存在时，ABTS+的产生会被抑制，在波长容量瓶，用5%的TCA依次配制0，0.0 5，0.10，405nm或7 34nm处测定ABTS+的吸光度即可测定0.25，0.50，1.0 0，2.0 0 mg/mL 的 Gly-Gly-Tyr-Arg并计算出样品的总抗氧化能力。Trolox作为参考标四肽标准溶液，然后分别取6.0 mL标准溶液，加入准，其是一种VE的类似物，具有和VE相近的抗氧4.0mL双缩脲试剂，混合均匀，静置10 min，以转化能力。按照试剂盒说明书测定，试验选取2 种方速50 0 0 r/min离心10 min，取上清液于波长540 nm法对黄粉虫酶解液的总抗氧化能力进行测定。处测定OD值（以第一管做空白对照）。以肽的质量3结果与分析浓度为横坐标（mg/mL），O D 值为纵坐标，制作标准曲线。(2）酶解液多肽含量的测定。取2.5mL样品溶液，加人2.5 mL10%（W/V）的三氯乙酸（TCA)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10 min，然后以转速50 0 0 r/min离心10 min，将上清液全部转移到50 mL容量瓶中，并用5%的TCA定容至刻度，摇匀。然后取6.0 mL上述溶液置于另一试管中，加人双缩脲试剂4.0 mL（样液：双缩脲试剂=3：2,V/V），于漩涡混合仪上混合均匀，静置10 min，以转速50 0 0 r/min离心10 min，取上清液于波长540 nm张玲，等：黄粉虫不同酶解液及其抗氧化作用的比较研究各酶的酶解条件进行酶解。胰蛋白酶酶解条件：底物质量分数2%，酶添加量2%，pH值8.0，酶解温度50，酶解时间2 h。木瓜蛋白酶酶解条件：底物质量分数2%，酶添加量2%，pH值7.0，酶解温度6 0，酶解时间2 h。中性蛋白酶酶解条件：底物质量分数2%，酶添加量2%，pH值7.0，酶解温度6 0，酶解时间2 h。酶解结束后，沸水浴10 min灭酶，冷却离心，取上清液得黄粉虫酶解液待测。2.5黄粉虫酶解液中SOD酶活的测定按照试剂盒说明书测定。测定原理是通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子（O2），02可还原氮蓝四唑生成蓝色甲，后者在56 0 nm处有吸收，SOD可清除O2，从而抑制了甲的形成；反应液蓝色越深，说明SOD活性越低，反之活性越高。2.6黄粉虫酶解液总抗氧化活性的测定目前，总抗氧化能力测定试剂盒有2 种方法，(GB/T 5009.3FRAP法和ABTS法，FRAP法的测定原理：酸性条件下抗氧化物质可以还原Fe3+-TPTZ产生蓝色的3.1黄粉虫蛋白粉基本成分分析黄粉虫蛋白粉的基本成分见表1。表1黄粉虫蛋白粉的基本成分蛋白质脂肪88.441.08由表1可知，经碱提酸沉法制备的黄粉虫蛋白粉的蛋白质含量达到了8 8%以上，脂肪含量1.0 8%，其水分含量为6.0 4%，灰分含量2.8 5%。3.2黄粉虫酶解液中多肽得率分析31：处测定OD值，对照标准曲线计算样品溶液中的多肽质量浓度（mg/mL），进而可求得样品中多肽含量。2.4黄粉虫蛋白水解酶的酶解条件根据公司提供的各种酶的作用范围，选择各种蛋白酶的较佳酶解条件，分别测定酶解过程中多肽含量的变化，从而筛选出适合黄粉虫蛋白水解的酶类。分别称取黄粉虫蛋白1g，加水50 mL，按以下/W/W,%水分灰分6.042.8532Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线见图1。0.8Y=0.317 7X+0.023.4,0.7R?=0.995 2.0.60.50.40.30.20.100图1Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线由四肽标准曲线得到的回归方程为Y=0.3177X+0.0234，R 2=0.9 9 52。由回归方程可计算出黄粉虫不同酶解液中多肽的质量浓度。黄粉虫不同酶解液中多肽质量浓度见图2。8858338880.90图2 黄粉虫不同酶解液中多肽的质量浓度由图2 可知，经胰蛋白酶水解后的黄粉虫酶解液中多肽的含量最高，其质量浓度可达0.8 mg/mL左右。计算得出黄粉虫分别经胰蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后其多肽得率分别为7 9.6%，60.4%，6 4.8%，胰蛋白酶酶解黄粉虫蛋白的多肽得率最高。3.3黄粉虫酶解液中 SOD酶活的分析黄粉虫酶解液中SOD酶活的分析见图3。100-Tu.n/敏QOS0胰蛋白酶图3黄粉虫酶解液中SOD酶活的分析图3为黄粉虫蛋白经胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后其酶解液中SOD酶活分别为82.03，8 2.31，8 2.7 3U/m L，差异不明显。SOD广泛存在于动物、植物和微生物细胞中，不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H,O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。目前，SOD可作为抗氧剂和营养强化剂在食品添加剂中应用。3.4黄粉虫酶解液抗氧化活性的分析总抗氧化能力（T-AOC）标准曲线（FRAP法)见图4，总抗氧化能力（T-AOC）标准曲线（ABTS农产品加工法)见图5。0.7Y=0.283 8X+0.073 4,0.6R2=0.993 6.0.50.40.30.20.100.51.0四肽标准质量浓度/mgmL-1胰蛋白酶碱性蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶碱性蛋白酶2023年第9 期1.52.00图4总抗氧化能力（T-AOC）标准曲线（FRAP法）1.21.00.80.60.40.200图5总抗氧化能力（T-AOC）标准曲线（ABTS法）由图4和图5可知，其回归方程分别为Y=0.2838X+0.0734，R 2=0.9 9 36 和Y=-0.1569X+1.1114，R 2=0.9 9 0 2。由标准曲线方程可计算出黄粉虫蛋白各酶解液中总抗氧化能力，分别用相当于FeSO4和Trolox的浓度来表示。不同酶解液总抗氧化能力同酶解液总抗氧化能力（ABTS）见图7。1.81.21.00.80.60.40.20图6不同酶解液总抗氧化能力（FRAP)0.10图7不同酶解液总抗氧化能力（ABTS)黄粉虫胰蛋白酶酶解液的总抗氧化能力为：相当于1.57 53mmol/L的FeSO4，0.9 17 3m m o l/L 的Trolox；木瓜蛋白酶酶解液的总抗氧化能力为：相当于0.9 39 4mmol/L的FeSO4,0.7466mmol/L的Trolox;碱性蛋白酶酶解液的总抗氧化能力为：相当于0.5标准品浓度/mmolL-1Y=-1.056 9X+1.111 4,R2-0.990 2.0.20.4标准品浓度/mmolL-1（F R A P)见图 6，不胰蛋白酶木瓜蛋白酶碱性蛋白酶胰蛋白酶木瓜蛋白酶碱性蛋白酶1.00.61.50.82.01.02023年第9 期1.038 3 mmol/L的FeS04，0.8 8 1 0 mmo l/L 的 Trolox。4结论黄粉虫蛋白经胰蛋白酶酶解后其酶解液中的多肽得率及总抗氧化能力均高于其他酶解液，这可能是因为胰蛋白酶具有极强的专一性和特异性，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断2，而KatsuhiroKudo等人13 研究发现土豆蛋白酶解物中分离出的3个抗氧化肽片段，其羧基端都为Arg。张玲等人 4分离出的2 个欧李仁抗氧化肽片段，其羧基端也都为Arg。末端为Arg的肽片段可能有较好的抗氧化功能。但这3种不同酶解液中SOD酶活均为8 2.0 U/mL左右，差异不明显。这可能是因为黄粉虫酶解后高温灭酶，SOD酶活随温度升高酶的活力下降，但SOD酶的热稳定性较好，仍有部分活性残留5。参考文献：1李宁，冉学文，熊晓莉.黄粉虫主要活性物质的提取研究进展】.应用化工，2 0 19，48（3)：7 0 4-7 0 8.2 李宁，幸宏伟，熊晓莉.黄粉虫资源开发与利用 M北京：中国农业科学技术出版社，2 0 17：16 6-16 9.3 黄雄伟.盐提法提取黄粉虫蛋白质工艺研究 食品与机械，2 0 10，2 6(3)：150-152.4张建新，孙长江.黄粉虫抗菌肽的分离纯化及生物活性研究.现代食品科技，2 0 16，32（1)：116-12 1.（上接第2 6 页）10】郝慧敏.马齿苋黄豆无糖蛋糕的配方优化研究 农产品加工，2 0 2 1（16)：6-8，13.11 闫家玮，姜晓坤.罗汉果甜苷提取工艺优化及天然利咽喉保健糖果的开发.东北农业科学，2 0 19，44（5)：116-122.12 Miao Yulu,Ni Hui,Zhang Xingyi,et al.Investigatingmechanism of sweetness intensity differences through dy-namic 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