DB21∕T 3273-2020 猪伪狂犬病毒野毒株与 gE 基因缺失疫苗株TaqMan 实时荧光定量 PCR 鉴别方法(辽宁省).pdf

lCS 11.220 B 41 DB21 辽r.l.,丁-省由UET目，万标准DB21/T 3273-2020 猪伪狂犬病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法A TaqMan Real-time PCR Method for Differentiation of Wild-type Strain from gE-deleted Vaccine Strain ofPseudorabies Virus 2020-06-30发布2020-07-30实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/T 3273-2020 目次前言.11 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 缩略语.1 4 仪器和耗材.1 5 试剂和材料.1 6 样品采集、处理和运输.2 7 荧光qPCR操作程序.3 8 结果判定.4 附录A(规范性附录榕液配制.6 附录B(规范性附录)引物和探针.7 目IJ1=1 本标准根据GB/T1.1-2009的有关规定进行制定。本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。本标准负责起草单位:辽宁省农业发展服务中心。DB21/T 3273-2020 本标准起草人:兰德松、顾贵波、周维、杨洛扬、李可心、孙世宇、张健、文IJ贺、李旭、高原、丁静。本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审O归口管理部门通讯地址:辽宁省农业农村厅。先阳市和平区太原北街2号)，联系电话:[phone] 标准起草单位通讯地址:辽宁省农业发展服务中心(沈阳市皇姑区宁山东路29号)，联系电话:[phone] II DB21/T 3273-2020 猪伪狂犬病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法1 范围本标准规定了猪伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV)野毒株及gE基因缺失毒株的TaqMan荧光PCR检测方法。本标准适用于猪血液、组织脏器、精液、鼻腔拭子和细胞培养物等材料中PRV核酸的检测以及PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株病毒核酸的鉴别检测。本标准的实验操作应在生物安全II级实验室CBSL-2实验室)中进行。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的o凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 缩略语下列缩回各语适用于本标准OgD糖蛋白D(glycoprotein D)gE糖蛋白E(glycoprotein E)PRV 伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus)4 仪器和耗材4.1 仪器荧光PCR仪、高速冷冻离心机(可控温至4C，离心速度可达12OOOr/min以上)、组织研磨仪或研钵、自动化核酸提取仪(如选用商品化核酸提取试剂盒)、PCR微量离心机、2C 8 C普通冰箱、-20 C以下普通冰箱、-70C以下超低温冰箱、移液器(量程O.1L2L、2L20L、20L200L)。4.2 耗材无菌无DNA酶的1.5 mL离心管、0.2mL PCR反应管或八联管或96孔反应板、与移液器匹配的吸头。5 试剂和材料DB21/T 3273-2020 5.1 DNAzolReagent:商品化DNA提取试剂，2 C8 Oc普通冰箱中保存i或商品化核酸提取试剂盒(如磁珠法核酸提取试剂)，通常18C25 C保存。5.2 无水乙醇:一20C普通冰箱中预冷。5.3 75%乙醇:用无水乙醇和双蒸水配制，一20Cc普通冰箱中预冷。5.4 PBS:磷酸盐缓冲液(0.02mol/L pH7.2)，配制见附录A。5.5 8 mmol/L NaOH 溶液，配制见附录A。5.6 2XTaqMan Fast qPCR Master Mix:为商品化探针法实时荧光PCR反应专用试剂，包含反应所需的缓冲液、酶、dNTP、Mg+等的预混液，-20 c普通冰箱中保存，避免反复冻融。5.7 引物和TaqMan探针，序列见附录B。5.8 阳性对照和阴性对:阳性对照使用PRV野毒株细胞培养物、Bartha-K61疫苗毒，阴性对照采用灭菌双蒸水或健康猪的组织材料。5.9 除非另有说明，在检测中所用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB!T6682的要求。6 样品采集、处理和运输6.1 采样前准备6.1.1 采样人员参照NY!T541中第5.1条的要求。6.1.2 采样工具和器材参照NY!T541中第6.10.3条的要求。6.2 样品采集6.2.1 血液:参照NY/T511中第6.1条中猪血液样品采集的要求进行，将采集的血液注入含1/10f本积4%EDTA 溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备检。6.2.2 组织脏器:参照NY/T，541中第6.2条和6.3条中的要求进行，将采集的病死猪或剖杀猪主要脏器(脑组织、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等或活体采集的扁桃体装入灭菌的15mL50 mL离心营中，编号备检;组织脏器使用组织研磨仪或研钵进行处理后用于核酸提取。6.2.3 精液:参照NY/T541中第6.10.:3条中的要求进行。6.2.4 鼻腔挝子:参照NY/T541中第6.4条中的猪鼻腔拔子采集要求进行，将时子样品放入PBS缓冲液(0.02mo1/L pH7.2)中，编号备检。6.2.5 细胞培养物:细胞培养物反复冻融3次，第3次解涛、后，4 OC 4 000 g离心10min，取上清转入新的无菌无DNA酶的1.5 mL离心管中，编号备用。6.3 样品保存、包装和废弃物处理参照、NY!T541中第7条的要求。2 DB21/T 3273-2020 6.4 样品运输参照NY/T541中第9条的要求。7 荧光qPCR操作程序7.1 DNA tEr 在实验室的核酸提取区进行。7.1.1 DNAzo1手工提取7.1.1.1 取n个无菌无DNA酶的1.5mL离心营n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心营进行编号。7.1.1.2 每营加入800LDNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200L，颠倒混匀，室温静置5min;4C 10 000 g离心10mi n。7.1.1.3 取900L上清，转入新的无菌无DNA酶1.5mL离心管中，加入500L预冷的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置3m i n;4C 10 000 g离心5min。7.1.1.4 弃上清，沿管璧缓慢加入1mL-20 c普通冰箱中预冷的75%乙醇，颠倒混匀，4C 10 000 g离心5min。重复洗涤2次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器小心移去残液。7.1.1.5 用50L8 mmol/L NaOH溶液溶解沉淀，DNA在-20c以下保存备用。7.1.2 核酸提取仪提取7.1.2.1 按照与核酸提取仪匹配的核酸提取试剂盒说明书提取。7.1.2.2 将提取的DNA转入新的无菌无DNA酶的1.5mL离心管中，在-20C以下普通冰箱中保存备用。7.2 荧光qPCR检测7.2.1 反应体系的配制和分装在试剂配制区进行。gD基因和gE基因的反应体系相同。设荧光qPCR反应管数为口，且为待检样品数十阳性对照管数+阴性对照管数，每个反应体系见表1，配制体系时建议按照n十1个反应进行配制，配制反应体系建议在冰盒中进行:配制好的反应液充分混匀后，按照每管18f.lL分装于PCR反应管内，并做好标识。表1每个反应体系配制表组分用量2 X TaqMan Fast qPCR Master Mix 10口L游特异性PCR引物00mol/L)0.5L 下游特异性PCR引物00mol/L)0.5L TaqMan探针(10I.lmol!L)o.5L 灭菌双亲水6.5 I.l L 总体积18L 7.2.2 加样3 DB21/T 3273-2020 在核酸提取区进行。每个反应管中按顺序分别加入2IlL待检样品、阳性对照、阴性对、DNA溶液，盖好盖子后，PCR微量离心机瞬时离心30s，转移至PCR扩增区。7.2.3 qPCR 扩增检测在PCR扩增区进行。7.2.3.1 荧光通道将PCR反应管放入荧光PCR仪内，设置探针5端边择FAM荧光通道3端边择无(口one)荧光。7.2.3.2 荧光qPCR反应条件gD和gE基因荧光qPCR反应条件均为94C 3 min;94 C 15 s,60 C 45 s，收集荧光，40 个循环。8 结果判定8.1 闹值设定闽值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阔值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准。8.2 质量控制8.2.1 阴性对照无Ct值，且无典型的S型扩增曲线。8.2.2 阳性对照FAM通道Gt值三三30，且扩增曲线为典型的S型。8.2.3 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。8.3 结果描述及判定8.3.1 gD基因检测结果8.3.1.1 阴性无Ct值Ct值38，且无典型的S型扩增曲线，报告为PRV核酸阴性。8.3.1.2 阳怕二Ct直36，且扩增曲线为典型的S型，报告为PRV核酸阳性，且需进一步经gE基因检测来进行PRV野毒与疫苗毒的鉴别检测。8.3.1.3 可疑36Ct值三三38，判定为可疑，需从提取DNA开始进行一次重复检测O如重复检测结果仍为3638，且无典型的S型扩增曲线，报告为PRV野毒核酸阴性。4 DB21/T 3273-2020 8.3.2.2 阳性Ct值三三36，且扩增曲线为典型的S型，报告为PRV野毒核酸阳性。8.3.2.3 可疑36Ct值三三38，判定为可疑，需从提取DNA开始进行一次重复检测。如重复检测结果仍为36Ct值三三38，且扩增曲线均呈典型的S型扩增曲线，报告为PRV野毒核酸阳性。8.3.3 鉴别方法针对缺失包含gE基因在内的PRV活疫苗免疫猪只，如果gE基因检测阳性，则判定为PRV野毒核酸阳性:如果gD基因检测阳性而gE基因检测阴性，则判定为PRV疫苗毒阳性;如果gD基因和国基因检测均为阴性，则判定为PRV核酸阴性，既无PRV野毒也无疫苗毒。针对未免疫缺失gE基因的PRV疫苗(DgE/PRV)的猪只，如果。基因或gE基因检测结果为阳性，则判定为PRV野毒核酸阳性:如果。基因和gE基因检测均为阴性，则判定为PRV核酸阴性。5 A.1 8 mmol/L NaOH;窑液自甘自己制附录A(规范性附录j容;夜自己市IJ称量o.32 g NaOH，溶解到1000 mL灭菌去离子水中，昆匀，分装，常温保存。A.2 0.02 mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制DB21/T 3273-2020 A.2.1 0.2 mol/L磷酸氢二制溶液:称取磷酸氢二呐(Na2HP04.12H20)71.64 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀oA.2.2 0.2 mollL磷酸二氢饷溶液:称取磷酸二氢纳(NaH2POH20)31.21 g，先加适量去离子水溶解，最后定窑至1000mL，混匀。A.2.3 量取0.2moL/L磷酸氢二制溶液360mL,0.2mol/L磷酸二氢纳溶液140mL，称取氯化制38g，用无离子水溶解稀释至5000mL,4C保存。6 名称gD-qF(上游号|物)gD-qR(下游引物)gD-P(探针)gE-qF(r游引物)gE-qR(下游引物)gE-P(探针)附录B(规范性附录引物和探针序列日，-3)GTTCAACGAGGGCCAGTACC CGGCGTCAGGAATCGCATCA FAM-ACCAGCACCGCACGTACAAG-BHQ1 CCGAGGACGAGTTCAGCA GGCCCATTCGTCACTTCCG FAM-ACCAGACGTCGAAGCCGGA-BHQ1 DB21/T 3273-2020 注:引物和探针均由生物公司合成，用无菌无核酸酶水配制成10阳ol/L工作液，-20 oc以下普通冰箱中保存供检测用。7