电化学发光检验的原理.ppt

电化学发光原理及应用电化学发光原理及应用 2017.10.目录目录1免疫检测技术的发展2电化学发光系统及其原理3电化学发光技术的优势.一一.免疫检测技术的发展免疫检测技术的发展放免放免酶免酶免荧光免疫荧光免疫化学发光化学发光电化学发光电化学发光1959197080S2000S免疫检测技术三个重要的历程免疫检测技术三个重要的历程.放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析技术开创了体液微量物质定量分析的新领域，并为其他标记免疫分析奠定了基础。放射免疫技术是临床实验室l重要检测手段，已广泛应用于激素、维生素、药物、肿瘤标志物、病原微生物抗原(抗体)的定量分析。1959年Berson和Yalow建立了放射免疫分析方法（RIA），大大提高了免疫测定的敏感度，这种标记免疫测定开拓了医学检验的新领域。缺点缺点 半衰期短，试剂货架期不长。标记物不断变化，试剂批间、批内变化大，标准曲线不能保存。反应时间长，操作步骤很难自动化。使用放射性核素，对人体有一定的危害性。分析的限度为 10 mol/ml 或 10 g/ml。.酶免疫测定法酶免疫测定法1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法（ELISA），这种非放射标记免疫测定在临床检验，特别是感染性疾病的诊断中取得了广泛应用。缺点缺点 试剂制备困难。操作步骤复杂，耗时长。影响因素多，质量控制难以保证。最后测定的是颜色的光密度，其精密度和敏感性不如发光免疫技术。.化学发光免疫测定法化学发光免疫测定法化学发光免疫测定法出现于20世纪90年代初。由于最后测定的是光子的量，不但对检测者无害，其敏感度和精密度均优于RIA，而且试剂较稳定，并可进行全自动分析。缺点缺点采用标记催化酶（如辣根过氧化物酶）或化学发光分子（如鲁米诺）的方法，其化学反应一般不稳定，为间断的、闪烁性发光，而且在反应过程中易发生裂变，导致反应结果不稳定。检测时需对结合相与游离相进行分离，操作步骤多。反应原理相对落后。（间接发光）.电化学发光免疫技术电化学发光免疫技术电化学发光免疫测定法（电化学发光免疫测定法（ECLIA）发展于发展于 1996年，它在年，它在发光反应中加入了电化学反应，是继放射免疫、酶免疫、发光反应中加入了电化学反应，是继放射免疫、酶免疫、化学发光免疫测定之后的新一代标记免疫测定技术，是化学发光免疫测定之后的新一代标记免疫测定技术，是电化学和免疫测定相结合的产物。电化学和免疫测定相结合的产物。世界公认的世界公认的 最先进最先进最先进最先进 的临床免疫检测技术的临床免疫检测技术.二二.电化学发光技术的发展史及其原理电化学发光技术的发展史及其原理1.1.发展历程发展历程19961996年德国宝灵曼公司推出年德国宝灵曼公司推出Elecsys 2010Elecsys 2010系统系统世界上第一台世界上第一台 应用电化学发光技术的全自动免疫分析仪应用电化学发光技术的全自动免疫分析仪19981998年罗氏公司收购宝灵曼公司年罗氏公司收购宝灵曼公司20012001年罗氏推出电化学发光免疫模块年罗氏推出电化学发光免疫模块E 170 E 170 罗氏是全球唯一罗氏是全球唯一 应用电化学发光免疫技术制造仪器的厂商应用电化学发光免疫技术制造仪器的厂商20062006年罗氏推出电化学发光免疫模块年罗氏推出电化学发光免疫模块e601e60120072007年罗氏推出电化学发光免疫模块年罗氏推出电化学发光免疫模块e411e411.2.电化学发光反应原理电化学发光反应原理顾名思义，电化学发光（ECL）是电场参与化学发光所产生的结果，是指通过施加一定的电压进行电化学反应：Ru(bpy)32+e Ru(bpy)33+（强氧化剂强氧化剂）TPAeTPA+H H+TPA（强还原剂强还原剂）(阳离子自由基阳离子自由基,不稳定不稳定)TPA+Ru(bpy)33+Ru(bpy)32+TPA光子（光子（620nm）Ru(bpy)32+：三联吡啶钌，是一种电化学发光剂：三联吡啶钌，是一种电化学发光剂TPA：三丙胺，电子供体。：三丙胺，电子供体。失电子失电子.电化学发光原理电化学发光原理底物：三联吡啶钌底物：三联吡啶钌Ru(bpy)Ru(bpy)2+2+3 3 N N羟基琥珀酰胺酯羟基琥珀酰胺酯(NHS)(NHS)三丙胺三丙胺(TPA)(TPA)在电极阳极表面，以上两种电化学活性物质同时失去电子发生氧化反应，2价的Ru(bpy)2+3 标记物被氧化成3价的Ru(bpy)3+3 的标记物，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+*，TPA+*很不稳定，自发地失去一个质子而形成自由基TPA*，其为强还原剂，将一个电子给3价的Ru(bpy)3+3，使其成为激发态的Ru(bpy)2+3，而TPA自身被氧化成氧化产物。激发态的Ru(bpy)2+3衰减时发射一个波长620nm的光子，重新形成基态的Ru(bpy)2+3。这一过程在电极表面周而复始进行，产生许多光子。使得光信号增强。.电化学发光的反应步骤电化学发光的反应步骤两种方法在反应原理上并没有什么不同，最后都是检测钌标记回到基态两种方法在反应原理上并没有什么不同，最后都是检测钌标记回到基态所释放的光信号。只不过竞争法多加入了一种竞争物，和放射免疫分析所释放的光信号。只不过竞争法多加入了一种竞争物，和放射免疫分析有异曲同工之处。有异曲同工之处。双抗体夹心法双抗体夹心法竞争法竞争法.双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法1 1试剂试剂/样本加入反应杯样本加入反应杯第一抗体标记生物素（与微磁珠结合）第二抗体标记钌Ruthenium（产生光信号）.2两种抗体皆能与靶抗原特异性结合，生成抗原抗体复合物两种抗体皆能与靶抗原特异性结合，生成抗原抗体复合物.3加入链霉亲和素包被的磁珠加入链霉亲和素包被的磁珠磁珠直径2.8um，表面凸凹，链霉亲和素包被，与生物素结合，生物素-链霉亲和素特异亲和作用是目前已知的最牢固的非共价生物结合作用。.生物素生物素-亲和素放大系统亲和素放大系统1.1.高特异性高特异性高度特异性结高度特异性结合合2.2.高敏感性高敏感性4 4个结合位点个结合位点3.3.高稳定性高稳定性亲和常数高，亲和常数高，解离常数很低。解离常数很低。特点.4最终在反应杯里形成磁颗粒连接的抗原抗体复合物最终在反应杯里形成磁颗粒连接的抗原抗体复合物.5反应杯中的复合物被转移至测量池反应杯中的复合物被转移至测量池测量池中启动磁场，吸附磁颗粒连接的免疫复合物。加入Procell溶液，去除反应体系杂质并提供三丙胺TPA。.6在测量池电场环境下在测量池电场环境下TPA提供电子，激发钌发出光信号提供电子，激发钌发出光信号.7测量池中的工作电极采集光信号测量池中的工作电极采集光信号数字信号转化成浓度，报结果。数字信号转化成浓度，报结果。The end！.双抗体夹心法：双抗体夹心法：1 1）测定大分子抗）测定大分子抗原原2 2）测定成正比：）测定成正比：信号低浓度低，信号低浓度低，信号高浓度高信号高浓度高检测有多个结合检测有多个结合位点的抗原，如位点的抗原，如TGTG，TSHTSH，PRLPRL，FSHFSH，LHLH等。等。总结总结.竞争法：竞争法：1 1）测定小分子抗）测定小分子抗原原2 2）测定成反比：）测定成反比：信号低浓度高，信号低浓度高，信号高浓度低信号高浓度低检测仅一个结合检测仅一个结合位点的抗原，如位点的抗原，如FT3FT3，FT4FT4，TT3TT3，TT4TT4，TG-AbTG-Ab，TR-TR-AbAb，E2E2，孕酮，孕酮，睾酮等。睾酮等。.电化学发光技术的优势电化学发光技术的优势与其它几种标记免疫测定技术相比，电化学发光具有更多的优点：与其它几种标记免疫测定技术相比，电化学发光具有更多的优点：1.高灵敏度，检测下限达pmol；2.线形范围宽，达7个数量级；3.快速，出第一个结果的时间仅需数分钟；4.应用范围广，可以同样的灵敏度和线性范围检测各种物质，包括DNA；5.试剂稳定，无污染和衰变问题；6.自动化程度高。.Loremipsumdolorsitamet,consecteturadiLOREM IPSUM DOLORLoremipsumdolorsitamet,consecteturadiLoremipsumdolorsitamet,consecteturadi.