黄曲霉毒素富集-检测-降解解毒方法的研究进展.pdf

天津中医药大学学报 第42卷第5期23年10月425Oct223摘要：中药在疾病预防治疗中发挥重要作用。随着人们对中药材的需求量不断增大，中药材的使用量日益攀升，其安全性问题备受关注。其中，真菌毒素污染已经成为产业界和科研界关注的焦点问题之一。黄曲霉毒素具有强毒性和致癌性，极易侵染中药材，对中药材质量及临床用药安全构成重大威胁。中药材、饮片、制剂中黄曲霉毒素的检测对保障中药安全性具有重要意义。目前中药中黄曲霉毒素的富集、检测及降解解毒方法报道较多，为了更好地为中药中黄曲霉毒素的研究提供参考，文章综述了近年来关于黄曲霉毒素的富集方法、检测分析技术、降解解毒方法的研究。关键词：黄曲霉毒素；富集方法；检测技术；降解解毒中图分类号：R284.1文献标志码：A文章编号：（23）050656-08黄曲霉毒素富集-检测-降解解毒方法的研究进展*张亚平，单鲁豫，穆琦瑄，李文慧，王丹妮，王跃飞，于卉娟（天津中医药大学中医药研究院，省部共建组分中药国家重点实验室，天津市中药化学与分析重点实验室，天津301617）*基金项目：国家自然科学基金青年项目（）；组分中药国家重点实验室资助项目（QMJJ202102）。作者简介：张亚平（1997-），女，硕士研究生在读，主要从事中药药效物质及质量控制方向研究。通讯作者：于卉娟，E-mail：。引用格式：张亚平，单鲁豫，穆琦瑄，等.黄曲霉毒素富集-检测-降解解毒方法的研究进展J.天津中医药大学学报，2023，42(5)：656-663.DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2023.05.18中医药是中华民族的瑰宝，为中华民族繁衍生息作出了巨大贡献。国家药品监管部门、产业界、科研界高度重视中药中有害物质的防控及检测，如黄曲霉毒素、硫磺、重金属等。2021年6月，国家中药材标准化与质量评估创新联盟成立，聚焦高质量中药材的加工、生产、流通环节，提出“三无一全”（无硫磺加工、无黄曲霉毒素超标、无公害、全过程可追溯）优质药材品牌理念，进一步促进高质量中药材市场供给。中药材有害菌污染是影响中药材质量的重要方面，其中黄曲霉菌极易侵染中药材，其代谢产物黄曲霉毒素具有剧毒性和致癌性，严重影响临床用药安全1-2。此外，黄曲霉毒素也存在于发霉的粮食、豆类、坚果及其相关食品中。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌（Aspergillusflavus）和寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）在潮湿温热环境下产生的毒性次级代谢产物，是二氢呋喃香豆素化合物及其衍生物3。目前已发现20多种黄曲霉毒素，其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1等毒素已被分离鉴定，根据化学结构主要划分为环戊烯酮型和内酯型4（表1）。AFB1是已知黄曲霉毒素中毒性最强的化合物，其毒性约是氰化钾的10倍、砒霜的68倍5，被世界卫生组织列为类致癌物6。AFB1结构中存在3个毒性位点7：1）呋喃环上的双键（C8-C9）是黄曲霉毒素与蛋白质或核酸形成复合物的作用位点，是导致基因突变、致癌致畸的主要基团。2）香豆素内酯环上的10、11、15号位点。3）环戊烯酮环上的1、2、3、14号位点，这部分位点易被取代基团取代。长期暴露于黄曲霉毒素下会导致机体免疫抑制、先天畸形、不孕不育、内分泌紊乱、肝细胞癌变等8。黄曲霉毒素严重危害人类健康，国家药典委员会强调，药品微生物检查是药品安全性控制的重要研究内容。中华人民共和国药典 对中药检测黄曲霉毒素的要求日趋严格，从2010年版的5种药材增加到2020年版的24种，涵盖根茎类、果实种子类和动物类药材，检测限度为AFB1不得超过656天津中医药大学学报 第42卷第5期23年10月425Oct2235 g/kg，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的总量不得超过10 g/kg9-11。科学有效地防控黄曲霉毒素侵染中药对提升中药临床用药安全具有重要意义。目前，中药中黄曲霉毒素的富集、检测及降解解毒方法研究较多，为了更好地为中药中黄曲霉毒素的研究提供参考，本文综述了近年来黄曲霉毒素的富集方法、检测分析技术、降解解毒方法的研究进展（图1）。1黄曲霉毒素的富集方法由于中药样品基质复杂且黄曲霉毒素含量较低，因此，在进行分析检测前需采取适当的样品前处理方法进行提取、富集12。关于黄曲霉毒素的提取方法主要有振摇提取法、超声提取法、高速均质提取法、加速溶剂萃取法等。常用的黄曲霉毒素纯化方法主要有萃取法、柱净化法、免疫亲和层析法、基质固相分散法、分子印迹固相萃取法等，新技术与新方法的应用能够特异性富集目标化合物13。表2总结了黄曲霉毒素的富集方法及其基本原理、优势、应用实例14-26。2黄曲霉毒素的检测方法黄曲霉毒素在人体或动物体内长期蓄积会导致肝毒性、致畸、致癌27-28。因此，建立高效、灵敏的黄曲霉毒素检测方法对保障药品和食品安全至关重要。黄曲霉毒素的传统检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。色谱法具有检测结果准确、灵敏度高、重复性好等优点，同时也存在样品前期处理复杂、需要专业的检测人员等局限性13。免疫分析法是用于快速检验的新技术，其原理是抗原-抗体特异性识别目标分析物，具有特异性强、灵敏度高、高通量等优点29。酶联免疫吸附法广泛应用于中药中黄曲霉毒素的检测，被收载为中华人民共和国药典2020年版中黄曲霉毒素测定的方法之一11。侧流免疫层析法、胶体金免疫层析法、化学发光免疫法、荧光免疫吸附法等可实现样品中黄曲霉毒素的现场快速检测30-31。近年来，基于适配体和新型纳米材料的生物传感器因具有灵敏度高、检出限低、操作简便等优势，在黄曲霉毒素检测中得到了广泛应用32。此外，通过引入基于适配体的不同技术实现AFB1的检测，例如电化学、表面等离子体共振、比色法等33。表3对黄曲霉毒素检测方法进行了分析34-42。3黄曲霉毒素的降解方法黄曲霉毒素对光和热稳定，不溶于水。中药被其侵染后脱除困难，建立有效脱除黄曲霉毒素的方法对保障中药、食品安全意义重大。常用的黄曲霉毒素降解方法有物理法、化学法、生物法（图2）43。表4对黄曲霉毒素的降解方法进行了分析。物理方法主要采用加热、辐照、吸附剂吸附、超声等方式降低黄曲霉毒素的浓度。高温破坏毒素位点达到脱毒目的，但同时会影响中药品质，容易造成成分降解等43-44。吸附剂与黄曲霉毒素结合可以有效脱除黄曲霉毒素，常用的吸附剂有叶绿素、氧化磁性石墨烯和磁性石墨烯的纳米材料、黏土等45-46。超声降解是一种安全绿色的黄曲霉毒素脱毒方法，一般作为辅助手段与其他方法协同使用47。化学方法是指采用化学试剂降解黄曲霉毒素或抑制霉菌滋生48，主要包括有机酸法、臭氧降解表 1黄曲霉毒素的分类及化学结构化学结构名称缩写取代基RC8-C9键型R1R2R3R4二氢呋喃香豆素环戊烯酮型AFB1-H-H=O-H双键AFB2-H-H=O-H单键AFB2a-H-OH=O-H单键AFM1-OH-H=O-H双键AFM2-OH-H=O-H单键AFL-H-H-OH-H双键AFQ1-H-H=O-OH双键二氢呋喃香豆素内酯型AFG1-H双键AFG2-H单键AFG2a-OH单键图 1黄曲霉毒素富集-检测-降解解毒方法657天津中医药大学学报 第42卷第5期23年10月425Oct223表 3黄曲霉毒素检测方法的比较分析检测方法基本原理应用效果局限性应用实例检测限薄层色谱法利用固定相对不同化合物吸附能力的不同，在展开剂的作用下达到分离的目的成本低廉，操作简单灵敏度低茶叶中AFB1的检测340.071 6 ng/mL高效液相色谱法利用衍生化试剂生成衍生物用于检测重复性好，灵敏度高衍生过程相对繁琐食用油中AFB1、AFB2的检测35；土鳖虫中黄曲霉毒素的检测360.075、0.068 g/kg35；0.5 g/kg36液相色谱-质谱联用法以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统准确度好，灵敏性高，重现性好，可同时检测多种霉菌毒素样品前处理繁琐，检测成本高化妆品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的检测370.0280.078 ng/g酶联免疫吸附法结合抗原-抗体的特异性反应和酶的高效催化作用的检测方法灵敏度高，特异性强，适用于大批样本集中检测检测化合物存在局限性花生中AFB1的检测380.36 ng/mL电化学免疫传感器法通过检测抗原-抗体特异性识别前后电信号的变化实现对目标分子的检测特异性强，便捷高效检测化合物存在局限性啤酒、白酒中AFB1的检测390.12 ng/mL胶体金免疫层析法通过整合免疫学中特异性结合的原理及层析分析技术，实现对目标物的检测便捷快速，适合单个或少数样本现场快速定性分析检测化合物存在局限性远志、大枣、使君子等药材中AFB1及AFB1、AFB2、AFG1、AFG2总量的检测400.011 ng/g化学发光免疫法由化学发光分析和免疫反应两部分组成，通过发光剂直接标记抗原或抗体特异性强，灵敏度高发光剂优选过程繁琐玉米中AFB1的检测415 pg/L侧流免疫层析法结合免疫技术和色谱层析技术的快速免疫分析方法，通过标记抗原或抗体实现检测检测快速检测化合物存在局限性酒糟中AFB1的检测423.4 g/kg表 2黄曲霉毒素的富集方法及其基本原理、优势、应用实例富集方法基本原理优势应用实例振摇提取法通过仪器振动摇匀两相或多相物质，提取富集黄曲霉毒素成本低廉，操作简便大豆油中AFB1提取富集14超声提取法利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速黄曲霉毒素的溶出成本低廉，操作简便植物油、延胡索中黄曲霉毒素提取富集15-16高速均质提取法应用高速均质器，将样品与提取溶剂混合高速旋转提出黄曲霉毒素提取效率高北五味子、山楂、何首乌等药材中真菌毒素的提取富集17加速溶剂萃取法通过温度和压力双重作用增加物质溶解度和溶质扩散效率，提高对黄曲霉毒素的提取效率萃取效率高，自动化程度高山银花、葛根和沙棘中16种真菌毒素的提取富集18液-液萃取法利用物质在两种溶剂中溶解度或分配系数的不同，使溶质在不同溶剂内发生转移，从而达到富集效果成本低廉，操作简便辣椒、米粉等食品中AFB1的提取富集19分散液液微萃取法通过添加分散剂增大接触面积使分析物在样品溶液及萃取剂之间快速分配平衡达到富集效果操作简便，有机溶剂消耗少酸奶中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1的提取富集20免疫亲和层析法利用抗原与特异性抗体免疫反应，高选择性地吸附溶液中的黄曲霉毒素亲和力高，特异性强牛黄镇惊丸中黄曲霉毒素的提取富集21固相萃取柱净化法利用选择性吸附原理富集黄曲霉毒素同步完成样品的提取与净化，分离快速，回收率高，重现性好果蔬中8种真菌毒素的提取富集22多功能净化柱净化法通过选择性地吸附黄曲霉毒素达到富集目的操作简便，一次性净化三七、人参中8种真菌毒素的提取富集23基质固相分散法利用分散剂提高分散程度，增大萃取剂与样品中目标物的接触面积，实现对目标物的快速富集操作简便，溶剂使用量少，分析时间短玉米粉中黄曲霉毒素的提取富集24QuEChERS技术利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到富集黄曲霉毒素的目的操作简便，溶剂用量少，耗时短，精准度高陈皮中的9种真菌毒素提取富集25分子印迹固相萃取法以分子印迹聚合物材料作为吸附剂，选择性识别黄曲霉毒素模板分子及其结构类似物达到富集目的耐高温、高压、酸碱和有机溶剂，特异性强小麦中黄曲霉毒素的提取富集26658天津中医药大学学报 第42卷第5期23年10月425Oct223表 4黄曲霉毒素降解方法的比较分析降解方法基本原理优势局限性应用实例物理法加热法高温破坏毒素位点操作便捷，绿色安全影响产品品质霉变天麻中黄曲霉毒素的脱毒58辐照法通过紫外线、射线和电子束等多种辐射方式破坏黄曲霉毒素化学结构电子束降解花生中的AFB159吸附剂吸附法特异性吸附黄曲霉毒素吸附剂吸附鱼饲料中的黄曲霉毒素60超声法利用超声破坏黄曲霉毒素化学结构大功率超声降解水中的AFB161化学法有机酸法有机酸降解AFB1高效，安全可靠破坏产品营养物质，使用有毒试剂，存在化学残留丙酸等有机酸降解饲料中的AFB162臭氧降解法臭氧降解真菌毒素并抑制微生物增殖臭氧和紫外线照射法降解花生中的AFB163氨化脱毒法利用氨水处理或氨气熏蒸等方式改变黄曲霉毒素的化学结构氨化法降解大米和玉米中的黄曲霉毒素64生物法微生物降解法利用微生物自身的代谢体系改变黄曲霉毒素的化学结构特异性高，安全无污染降解率较低，降解时间长微生物降解AFB165生物酶降解法通过破坏黄曲霉毒素的毒性基团降低其毒性真菌毒素降解酶和益生菌复合物降解AFB166图 2 黄曲霉毒素不同降解方法的优势和局限性法、氨化脱毒法49。有机酸对AFB1具有明显的降解作用50，如柠檬酸、丙酸、苯甲酸、酒石酸等。臭氧可降解真菌毒素并抑制微生物增殖，对环境危害较小，被誉为“绿色因子”，但其本身作为强氧化剂会破坏基质中的营养物质51。氨化脱毒是指利用氨水处理或氨气熏蒸等方式改变黄曲霉毒素的化学结构，达到降低毒性的目的，但摄入过量的氨气会造成机体损伤52。微生物降解霉菌毒素是近年来研究较为广泛的一种脱毒方式，利用微生物自身的代谢体系改变黄曲霉毒素的化学结构，使之转化为其他化学衍生物，达到消除毒性或降低毒性的目的，是一种安全、高效、绿色的脱毒方式。荧光假单胞菌、鳗败血假单胞菌、葡萄球菌等菌株可有效降解黄曲霉毒素。生物酶降解是微生物降解的有效补充，通过破坏黄曲霉毒素的毒性基团降低其毒性，具有特异性强、高效性、反应条件温和等特点。红球菌53、枯草芽孢杆菌54、黑曲霉55等多种真菌和细菌的代谢酶能有效降解黄曲霉毒素56-57。目前，关于黄曲霉毒素降解方法的研究取得了较大进展，每种降解方法都有其独特的优势58-66，可以综合利用多元协同技术达到除去黄曲霉毒素的效果，提高其在不同研究对象中的适用性。探索绿色、环保、安全的整合降解黄曲霉毒素技术将成为未来研究的主流和重点。4结语黄曲霉毒素毒性极强，容易污染中药及食品，对人类健康构成严重危害。本文综述了近年来黄曲霉毒素的富集方法、检测技术及降解脱毒方法。由于黄曲霉毒素具有含量低、毒性大的特点，开发出更灵敏、更快速、更经济的检测手段具有重大迫切需求。黄曲霉毒素的早检测、早预防、早干预是有效解决黄曲霉毒素危害性的重要措施。659天津中医药大学学报 第42卷第5期23年10月425Oct223参考文献：1任晓航，杜锐，张旭，等.中药外源性污染物检测技术的现代研究J.中草药，2019，50(10)：2480-2490.REN X H，DU R，ZHANG X，et al.Modern research ondetection technology of exogenous pollutants in Chinesemateria medicaJ.Chinese Traditional and Herbal 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